ES2322924B1 - Metodos y dispositivo biosensor para medida microinterferometrica del potencial de membrana neuronal. - Google Patents

Abstract

Métodos y dispositivo biosensor para medida microinterferométrica del potencial de membrana neuronal.

La invención describe un método para la monitorización del potencial de membrana neuronal mediante el análisis de los patrones espacio-temporales de difracción de un haz de luz coherente incidente sobre la célula. La invención incluye un dispositivo compatible con sistemas de microscopia convencionales para la cuantificación de la distribución angular del patrón de difracción así como un sistema de medida diferencial con filtro adaptativo compensador de canal para la cancelación del ruido de la fuente de luz y la mejora de la relación señal-ruido. A diferencia de las técnicas convencionales, los métodos y dispositivo descritos en la invención no requieren del uso de cromóforos o fluoróforos, solventando los problemas de "bleaching", toxicidad y variabilidad en la calidad del marcaje y en la relación señal-ruido característicos de los marcadores sensibles a voltage (voltage-sensitive dyes, VSDs).

Description

Métodos y dispositivo biosensor para medida microinterferométrica del potencial de membrana neuronal.

Campo de la invención

La invención tiene aplicación en el campo de la biomedicina.

Objeto de la invención

La invención incluye métodos y dispositivo para la monitorización óptica del potencial de membrana celular. La invención se fundamenta en los cambios producidos por variaciones en el potencial de membrana sobre los patrones espacio-temporales de difracción de luz coherente incidente sobre la célula estudiada. Los métodos y dispositivos descritos en la invención suponen una mejora técnica sustancial respecto a las técnicas ópticas tradicionales basadas en marcadores moleculares sensibles a potencial (voltage-sensitive dyes, VSDs), al eliminar la fototoxicidad y el fotobleaching que afectan a éstos.

Antecedentes

La monitorización de la actividad eléctrica producida por neuronas in vitro es necesaria para el estudio del funcionamiento del tejido nervioso, por ejemplo, con el objeto de identificar fármacos efectivos en el tratamiento y/o prevención de neuropatologías. Dicha actividad eléctrica está caracterizada por cambios transitorios en el potencial eléctrico de la membrana celular (potenciales de acción, Kandel et al. 2000), típicamente de una magnitud máxima de aproximadamente 100 mV y duración del orden de 1 milisegundo. Éstos han sido tradicionalmente detectados mediante técnicas electrofisiológicas (ver Molecular Devices, The Axon Guide, 2006) que requieren el uso de microelectrodos situados en contacto con la célula.

La necesidad de emplear microposicionadores hidráulicos, piezoeléctricos o mecánicos con resoluciones submicrométricas para la manipulación del microelectrodo dificulta la medida simultánea de múltiples células. Aunque varios micromanipuladores pueden emplearse en paralelo para la detección de potenciales intracelulares en hasta tres neuronas (Bi G.Q. et al. Distributed synaptic modification in neural networks induced by patterned stimulation Nature 401(6755):792-6 1999) la consecución de medidas intracelulares simultáneas en números superiores de células es progresivamente más complicada.

A esta limitación de las técnicas electrofisiologías convencionales, se suma la pobre estabilidad del interface microelectrodo-neurona. En efecto, el contacto físico entre el microelectrodo y la membrana celulares, necesario para medidas intracelulares, raramente hace posible experimentos de duración superior a una hora. Sin embargo, medidas de mayor duración son con frecuencia necesarias, por ejemplo para la evaluación a largo plazo (semanas o meses) de nuevos fármacos o para el estudio de los mecanismos que guían el desarrollo morfológico y funcional de células in vitro.

En respuesta a las limitaciones técnicas de los métodos electrofisiológicos covencionales, se han propuesto estrategias ópticas basadas en la monitorización de los transitorios del potencial de membrana mediante la observación de los cambios provocados por éstos en la absorción y/o fluorescencia ópticas de marcadores moleculares sensibles a potencial (voltage-sensitive dyes, VSDs). Los VSDs son cromóforos o fluoróforos utilizados a modo de tinción de membrana, cuyas propiedades ópticas son moduladas por el potencial eléctrico de ésta (Tasaki et al. Changes in extrinsic fluorescence of nerve produced by electric stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 64(4):1362-8 1969; Cohen L. Optical monitoring of physiological-activity - a brief-history. Japanese Journal of Physiology 43: s1-s6 suppl. 1 1993; patente US 6,979,553 Use of Nernstein voltage sensitive dyes in measuring transmembrane voltage, de Farinas et al. 2005; patente US 7,087,416 Detection of transmembrane potentials by optical methods, de Tsien et al. 2006).

La compatibilidad de los VSDs con detectores multipixel (por ejemplo cámaras CCDs) facilita la monitorización simultánea de múltiples células. Por otro lado, si bien la ausencia de contacto físico entre un microelectrodo y la membrana celular elimina el riesgo de daño mecánico de ésta, los VSDs sufren de limitaciones que reducen su utilidad en el campo de las neurociencias. En primer lugar, el "bleaching", es decir la degradación de las propiedades del marcador por efecto de la iluminación durante el proceso de medida, reduce el tiempo de experimentación (con observación continua) a menos de una hora. El orden de magnitud de la duración de un experimento con VSDs es pues comparable al que caracteriza las técnicas electrofisiológicas convencionales (Jin W. et al. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. J Neurosci Methods. Mar 30;115(1):13-27 2002). La dependencia de la toxicidad de los VSDs con el subtipo neuronal y la variabilidad en la calidad del marcaje, con la resultante impredecibilidad de la relación señal-ruido, son otras características negativas de los marcadores sensibles a voltaje.

Con anterioridad al desarrollo de los VSDs, se había observado que, incluso en ausencia de marcadores, diversas propiedades ópticas del axón (opacidad, birefringencia e intensidad del scattering) varían transitoriamente durante la generación de un potencial de acción: Hill et al. (Hill D.K. et al. Opacity changes in stimulated nerve, J. Physiol 108:278-281 1949; Hill D.K. The effect of stimulation on the opacity of a crustacean nerve trunk and its relation to fibre diameter. J. Physiol. 111(3-4):283-303 1950), Bryant S.H. et al. (Bryant S.H. et al. Changes in light scattering accompanying activity in nerve. J. Cellular Comp. Physiol. 40(2):199-219 1952), Cohen et al. (Cohen L.B. et al. Evidence for structural changes during the action potential in nerves from the walking legs of Maia squinado. J. Physiol. 194(2):85 1968; Cohen L.B. et al. Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218:438-441 1968; Cohen L.B. et al. Changes in axon birefringence J. Physiol. 211:495-515 1970; Cohen L.B., Landowne D. Light-scattering changes in voltage-clamped squid giant axons. Journal of General Physiology 55 (1):144 1970; Cohen et al., Changes in light scattering associated with the action potential in crab nerves. J. Physiol. 212:259-275 1971; Cohen L.B. et al. Analysis of the potential-dependent changes in optical retardation in the squid giant axon. J. Physiol. 218(1):205-237 1971; Cohen L.B. et al Changes in light scattering that accompany the action potential in squid giant axons: potential-dependent components. J Physiol. 224:701-725 1972; Cohen L.B. et al. Changes in light-scattering that accompany action potential in squid giant axons - potential-dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):701 1972; Cohen L.B. et al. Changes in axon light-scattering that accompany action potential - current- dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):727 1972; Cohen L. Optical monitoring of physiological-activity - a brief-history. Japanese Journal of Physiology 43: s1-s6 suppl. 1 1993), Stepnoski et al. (Stepnoski et al. Noninvasive detection of changes in membrane-potential in cultured neurons by light-scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (21): 9382-9386 1991) y Tasaki et al. (Tasaki I. et al. Optical-changes during nerve excitation - interpretation on the basis of rapid structural-changes in the superficial gel layer of nerve-fibers. Physiological Chemistry and Physics and Medical NMR 26 (1): 101-110 1994; Tasaki I. et al. Swelling of squid giant-axon during action-potentials. Biological Bulletin 159 (2): 494-494 1980).

La señal óptica s asociada con el potencial de acción, expresada como la variación relativa de la intensidad de luz en el pico del potencial de acción,

s = \frac{\Delta I}{I}

toma valores del orden de 1-10\times10^{-6} (con axones de invertebrados) comparados con 1-5\times10^{-2} (1-5%) típicamente obtenidos con VSDs. Debido a la baja sensibilidad de los métodos intrinsecos, éstos han requerido tradicionalmente de promediado para obtener suficiente relación señal-ruido. Los VSDs, en cambio, permiten medidas de potenciales de acción individuales, sin necesidad de promediado. En consecuencia, la investigación en el área se ha centrado en la resolución de los problemas inherentes a VSDs (bleaching, fototoxicidad y impredictibilidad de la tinción). Los métodos intrínsecos, en el contexto de las medidas en neurons individuales, han evolucionado poco desde su descubrimiento.

Aún así, los métodos intrinsecos basados en birefringencia como el descrito en la patente US 5,485,229 (Method and apparatus for determining electrical activity in the retinal nerve fiber layer using intrinsic birefringent properties of retinal ganglion cell axons de William A. Hare 1996), se han demostrado útiles en medidas en tejido no disociado como la retina. Aparatos para medidas de fase con alta sensibilidad han sido descritos con anterioridad (patente US 6,665456 Method and apparatus for differential phase optical coherence tomography de Dave et al. 2003; patente CA 2,529,942 EP 1,644,720 Systems and methods for phase measurements de Gabriel Popescu et al. 2005) pero no se han demostrado de utilidad para la detección de potenciales de acción en neuronas aisladas in vitro.

Esta invención describe métodos y dispositivo para la medida de señales ópticas intrínsecas (incluyendo índice de refracción y la absorvancia) asociadas a potenciales de acción en neuronas individuales de vertebrado sin necesidad de promediado.

La medida del índice de refracción y la absorvancia óptica de líquidos es posible mediante técnicas interferométricas como describe Cremers et al. (patente US 4,447,153 Apparatus and method for quantitative measurement of small differences in optical absorptivity between two samples using differential interferometry and the thermooptic effect, de Cremers D.A. et al. 1984). Medidas similares en volúmenes pequeños (inferiores a 1 mm^{3}), o microinterferometría, han sido descritas por Bornhop et al. (patente US 6,809,828 Universal detector for biological and chemical separations or assays using plastic microfluidic devices, de Bornhop D.J. et al. 2004) y Swinney K. et al. (Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry, Review of Scientific Instruments, 71(7):2684-2692 2000). La microinterferometria se ha demostrado útil en el contexto de la química analítica pero métodos y dispositivos para la detección microinterferométrica de potenciales de acción en neuronas in vitro no se han descrito.

La invención descrita aquí presenta métodos y dispositivos a este efecto, constituyendo una mejora sustancial con respecto a sistemas basados en VSDs.

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Referencias Patentes

US 4,447,153 Apparatus and method for quantitative measurement of small differences in optical absorptivity between two samples using differential interferometry and the thermooptic effect. Cremers D.A. et al. 1984.

US 5,485,229 Method and apparatus for determining electrical activity in the retinal nerve fiber layer using intrinsic birefringent properties of retinal ganglion cell axons. Inventor: Hare W.A. (1996).

US 6,665456 Method and apparatus for differential phase optical coherence tomography. Inventor: Dave D.P. et al. (2003).

CA 2,529,942 EP 1,644,720; Systems and methods for phase measurements. Inventor: Popescu G. et al. (2005).

US 6,979,553 Use of Nernstein voltage sensitive dyes in measuring transmembrane voltage. Inventor: Farinas J.A. et al. (2005).

US 6,809,828 Universal detector for biological and chemical separations or assays using plastic microfluidic devices. Inventor: Darryl J. Bornhop et al. (2004).

US 7,087,416 Detection of transmembrane potentials by optical methods. Inventor: Tsien et al. (2006).

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Artículos científicos

Bi G. Q. et al. Distributed synaptic modification in neural networks induced by patterned stimulation Nature 401(6755):792-6 (1999).

Bryant S. H. et al. Changes in light scattering accompanying activity in nerve. J. Cellular Comp. Physiol. 40(2):199-219 (1952).

Cohen L. B. et al. Evidence for structural changes during the action potential in nerves from the walking legs of Maia squinado. J. Physiol. 194(2):85 (1968).

Cohen L. B. et al. Light scattering and birefringence changes during nerve activity. Nature 218:438-441 (1968).

Cohen L. B. et al. Changes in axon birefringence J. Physiol. 211:495-515 (1970).

Cohen L. B. et al. Light-scattering changes in voltage-clamped squid giant axons. Journal of General Physiology 55 (1):144 (1970).

Cohen et al. Changes in light scattering associated with the action potential in crab nerves. J. Physiol. 212:259-275 (1971).

Cohen L. B. et al. Analysis of the potential-dependent changes in optical retardation in the squid giant axon. J. Physiol. 218(1):205-237 (1971).

Cohen L. B. et al Changes in light scattering that accompany the action potential in squid giant axons: potential-dependent components. J Physiol. 224:701-725 (1972).

Cohen L. B. et al. Changes in light-scattering that accompany action potential in squid giant axons - potential- dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):701 (1972).

Cohen L. B. et al. Changes in axon light-scattering that accompany action potential - current-dependent components. Journal of Physiology-London 224 (3):727 (1972).

Cohen L. Optical monitoring of physiological-activity - a brief-history. Japanese Journal of Physiology 43: s1-s6 suppl. 1 (1993).

Hill D. K. et al. Opacity changes in stimulated nerve. J. Physiol 108:278-281 (1949).

Hill D. K. The effect of stimulation on the opacity of a crustacean nerve trunk and its relation to fibre diameter. J. Physiol. 111(3-4):283-303 (1950).

Jin W. et al. Voltage-sensitive dye imaging of population neuronal activity in cortical tissue. J Neurosci Methods. 115(1):13-27 (2002).

Kandel E. R. et al. Principles of Neural Science, 4th ed. McGraw-Hill, New York. ISBN 0838577016 (2000).

Landowne D. Measuring nerve excitation with polarized-light. Japanese Journal of Physiology 43: s7-s11 suppl. 1 (1993).

Molecular Devices. The Axon Guide (http://www.moleculardevices.com/pdfs/Axon_Guide.pdf) (2006).

Stepnoski R. A. et al. Noninvasive detection of changes in membrane-potential in cultured neurons by light-scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (21): 9382-9386 (1991).

Swinney K. et al. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Review of Scientific Instruments. 71(7):2684-2692 (2000).

Tasaki I. et al. Optical-changes during nerve excitation - interpretation on the basis of rapid structural-changes in the superficial gel layer of nerve-fibers. Physiological Chemistry and Physics and Medical NMR 26 (1): 101-110 (1994).

Tasaki I. et al. Swelling of squid giant-axon during action-potentials. Biological Bulletin 159 (2): 494-494 (1980).

Tasaki et al. Changes in extrinsic fluorescence of nerve produced by electric stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. 64(4):1362-8 (1969).

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Dispositivo microinterferométrico para medida óptica de potenciales de acción en neuronas

La fig. 1 muestra los elementos que integran el dispositivo de medida de esta invención.

El diámetro de axones y dendritas de vertebrados no mielinizadas es del orden de 1-2 micrómetros. Por ello, el uso de fuentes de luz no coherentes o haces de luz coherentes no enfocados dificulta la obtención de suficiente densidad de potencia lumínica sobre un segmento de axón o dendrita. La presente invención resuelve este problema mediante el uso de haces coherentes de perfil gausiano enfocados sobre la neurona mediante lentes objetivo.

La fig. 1 incluye la fuente coherente (1), por ejemplo un láser de gas HeNe emitiendo a 632.8 nm (longitud de onda sin biotoxicidad). El uso de otras fuentes coherentes es posible para la explotación de los métodos descritos en esta invención y quedan incluidos en la misma. Un conjunto de dos lentes convexas, (2) y (3), en configuración telescópica se utilizan para la expansión y colimación del haz hasta un diámetro del orden de 1 cm. Los espejos posicionables (4) se utilizan para alinear el haz láser al objetivo (5). Un espejo semireflectante (6) desvía una fracción del haz hacia el fotodetector de referencia (7). El objetivo (5) enfoca el haz láser en el plano conteniendo las células in vitro (10). La constelación de fotodetectores (9) mide la intensidad resultante de la superposición de los diversos frentes de onda resultantes de la interacción del haz con la membrana celular. El posicionador motorizado (8) de tres ejes (sólo uno visible en la imagen) permite el control de la célula con respecto al haz láser con resolución submicrométrica.

La fig. 2 muestra la sección transversal de un axón o dendrita (11) sobre el plano de cultivo (10). El punto de máxima estrechez del haz enfocado (12) (cintura limitada por difracción) se hace coincidir con el axón a monitorizar (11). En el plano de observación (13) se forma el patrón de difracción conteniendo máximos y mínimos, interrogados por los fotodetectores (9).

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Método de detección de potenciales de acción mediante microinterferometría

Los métodos descritos en la presente invención hacen uso de los siguientes fenómenos físicos:

a)

el indice de refracción de la membrana celular experimenta un cambio del 0.1% durante un potencial de acción (Stepnoski R.A. et al. Noninvasive detection of changes in membrane-potential in cultured neurons by light-scattering. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (21): 9382-938, 1991). Éste se debe al impacto del transitorio en el campo eléctrico transmembrana sobre el alineamiento de las moléculas de membrana, y

b)

cambios de fase en una onda electromagnética son convertidos en cambios en intensidad (medibles por ejemplo mediante fotodetectores) cuando ésta interfiere con una onda de referencia de igual frecuencia pero diferente fase. De especial relevancia para la presente invención es la posibilidad de obtener medidas del índice de refracción de cilindros dieléctricos mediante observación de los patrones interferométricos producidos por estos a partir de la iluminación de un solo haz coherente (Swinney K. et al. Ultrasmall volume refractive index detection using microinterferometry. Rev. of Scientific Instruments 71(7), 2000).

Axones y dendritas se asemejan cilindros dieléctrico (el plasma intracelular) recubiertos por capas también dieléctricas (la membrana). La presente invención hace uso de la conocida variación del índice de refracción de la membrana asociada a la generación de un potencial de acción y de técnicas microinterferométricas aplicables a cilindros dieléctricos para su medida.

La fig. 3 muestra el diagrama de difracción obtenido mediante la solución de las ecuaciones de Maxwell en coordenadas cilíndricas para el caso de un haz láser gausiano incidente en el centro de un axón. Éste se modela como un cilindro dieléctrico correspondiendo al axoplasma (radio 4 longitudes de onda e índice de refracción 1.3) recubierto de una capa dieléctrica de espesor 0.01 longitudes de onda modelando la membrana celular (índice de refracción 1.5).

La fig. 4 muestra el cambio porcentual de intensidad medida por el fotodetector (log_{10}\DeltaI/I) durante un potencial de acción, en función del ángulo de observación.

Como se indica en la fig. 4, un fotodetector posicionado en un ángulo \theta=0º detecta una señal óptica s de una magnitud relativa de 10^{-3 . 7} o 2\times10^{-4} asociada a un potencial de acción. Asumiendo un nivel de ruido en el fotodetector dominado por "shot", es decir,

I_{shot} << \sqrt{I^{2}_{rudielectrónica} + I^{2}_{ruidohaz})}

la medida se efectuará con una relación señal-ruido superior a la unidad siempre y cuando se cumpla la desigualdad,

I_{shot} = \sqrt{2IqB} < 2 \times 10^{-4} \times I

donde q es la carga del electrón (1.6\times10^{-19} culombios), I la corriente producida por la componente DC de la iluminación y B el ancho de banda de la medida (10 KHz). Dicha condición se cumple cuando,

I > \frac{2qB}{4 \times 10^{-8}} = 80\ nA

En medidas experimentales realizadas sobre dendritas y axones a \theta = 0º mediante un fotodiodo de Silicio con área de 1 mm^{2}, posicionado a 5 cm del plano del cultivo neuronal, y amplificador de transimpedancia de ganancia 10^{7} y ancho de banda 10 KHz, se detecta una corriente superior a 100 nA usando un láser HeNe de 5 mW enfocado con un objetivo de 20X y apertura numérica 0.45.

La selección del ángulo \theta=0º para la medida es la ideal dado que el máximo de la relación señal ruido se obtiene para esta posición (ver fig. 5, la cual muestra \frac{\Delta I}{\sqrt{I}}).

La fig. 6 muestra un cultivo neuronal compatible con los métodos presentados en esta invención, es decir, a baja densidad (separación entre células > 100 \mum) y en ausencia de glía que pudiera distorsionar el patrón de difracción. La subred de la imagen incluye tres neuronas (14) y se indican sendos puntos (15) sobre axones y dendritas donde el enfocado de la fuente genera patrones de difracción como los descritos en esta invención.

A título de ejemplo, las figs. 7 y 8 muestran patrones de difracción producidos por una dendrita sobre una pantalla difusa situada a 10 cm del nivel del cultivo. La imagen fue obtenida mediante una cámara CCD situada a 50 cm sobre la pantalla. En el caso de la fig. 7, el haz se enfocó a z<0 \mum, es decir, bajo la neurona estudiada, mientras que en la fig. 8 se muestra el patrón de difracción correspondiente para z>0 \mum, es decir con enfoque sobre la célula y dentro del medio de cultivo.

Los cálculos y medidas anteriores asumen un nivel de ruido en el fotodetector limitado por "shot". Con el objeto de cumplir esta condición, la invención incluye los métodos descritos en el siguiente apartado para la reducción del nivel de ruido inherente a la fuente de luz y por scattering de partículas en suspensión.

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Método de reducción del ruido de intensidad de la fuente coherente

En condiciones ideales, el ruido en los detectores coincidirá con el ruido "shot" intrínseco a toda fuente de luz. La presente invención hace uso de fuentes de luz coherentes, cuyo ruido en intensidad puede ser fácilmente superior al ruido "shot". Por ejemplo, con frecuencia los láser HeNe convencionales emitiendo a 632.8 nm pueden producir un ruido del 1% de la intensidad nominal, considerando un ancho de banda DC-10 MHz.

La invención incluye dos métodos para la reducción del ruido de la fuente (ver Fig. 1). En primer lugar, la señal es filtrada pasa-banda. A titulo de ejemplo, dos frecuencias de corte adecuadas para potenciales de acción son 10 Hz (inferior) y 10 KHz (superior). Otros valores son de utilidad según las características del ruido y la señal a
detectar.

En segundo lugar, la invención hace uso de un sistema de dos fotodetectores configurados para medida diferencial. El fotodetector de referencia (7) recibe una fracción de la potencia generada por la fuente y obtenida mediante un espejo semireflectante (6) posicionado tras el telescopio de expansión/colimación, (2) y (3). El amplificador de transimpedancia asociado a este fotodetector es idéntico al utilizado para los fotodetectores de medida (9) y monitoriza la intensidad total producida por la fuente,

I_{1}(t) = (i_{0} + n_{i}(t)) * h_{1}(t)

donde i_{0} es la intensidad nominal, n_{i}(t) el ruido de la fuente, "*" indica convolución y h_{1}(t) la respuesta impulsional del amplificador de transimpedancia agregado con el factor de atenuación producido por el espejo semireflectante.

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Los fotodetectores de medida (9) obtienen la señal I_{2},

I_{2}(t) = (i_{0} + n_{i}(t) + s(t)) * h_{2}(t)

donde i_{0} es la intensidad nominal de la fuente, n_{i}(t) el ruido producido por ésta, s(t) la señal óptica asociada con un potencial de acción y h_{2}(t) la respuesta impulsional del amplificador de transimpedancia agregado con un factor de atenuación.

En el supuesto de que h_{1} = h_{2}, la señal de referencia I_{1} puede sustraerse de I_{2} para obtener s(t), la señal de scattering asociada al potencial de acción a detectar, libre del ruido de intensidad producido por la fuente de manera que

I_{1} - I_{2} = s(t)

En condiciones reales, h_{1}<>h_{2} (por ejemplo debido a las tolerancias en los componentes de los amplificadores, desigual distribución de potencias en el espejo semireflectante, capacidades parásitas en los amplificadores, etc.). La invención incluye un filtro adaptativo Least-Mean-Squares (LMS) que permite compensar las diferencias en la respuesta impulsional de los dos canales para la cancelación del ruido de la fuente y obtener así medidas limitadas por ruido "shot".

El filtro adaptativo es un FIR (finite impulse response) de N coeficientes, [x_{1}...x_{N}] cuyos valores se determinan durante la fase de calibración del sistema y en ausencia de células susceptibles de provocar scattering. La función error a minimizar por parte del filtro adaptativo es la diferencia entre I_{1}*h_{adapt}(t) (la señal de referencia convolucionada con la respuesta impulsional del filtro adaptativo) e I_{2}, la señal de scattering,

Error = (I_{1} * h_{adapt}(t) - I_{2})^{2}

Los coeficientes [x_{1}...x_{N}] se optimizan mediante el algoritmo LMS (bien conocido en el ámbito del procesado de señal) hasta conseguir un nivel remanente de ruido (la desviación standard de Error) coincidente con el nivel esperado para el ruido "shot" o bien hasta que el valor Error sea inferior a un valor predeterminado. El ruido remanente es una combinación del ruido "shot" del fotodetector de referencia y de los fotodetectores de medida, habiendo eliminado o reducido en gran medida el ruido de la fuente.

Otro método para la reducción de ruido incluido en esta invención es el filtrado, con anterioridad a las medidas sobre neuronas, del medio líquido de cultivo (diámetro de porosidad 0.2 micrómetros). Este método reduce las fluctuaciones en la intensidad de la señal detectada por scattering asociado con partículas presentes en el medio.

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Procedimientos para el uso del dispositivo

La Fig. 9 muestra un ejemplo de las etapas para la operación del dispositivo descrito en la presente invención. Variaciones según el tipo de células y técnica de cultivo son posibles y quedan incluidas bajo las líneas generales descritas aquí.

Como primer paso puede prepararse un cultivo primario de neuronas (14) , por ejemplo de roedor, sembrado sobre un sustrato de plástico o cristal (10) pretratado con moléculas promotoras de adhesión, por ejemplo poli-l-lisina, polietilenimina, laminina, colágeno o similar. Si el medio de cultivo incorporara sérum, el crecimiento de las células gliales puede controlarse con antimitóticos como arabinósido de citosina (Ara-C). En medios libres de sérum, el crecimiento gial suele ser mínimo aunque la viabilidad de las células puede verse afectada. Para la presente invención es deseable que el número de células gliales sea reducido con el objeto de limitar su efecto sobre el patrón de difracción del láser.

Cuando el cultivo llega al estado de desarrollo deseado, se inician las medidas microinterferométricas (típicamente después de un semana tras el sembrado). En primer lugar, las células se retiran del incubador y se posicionan en el microscopio. Usando, por ejemplo, iluminación en contraste de fase, se desplaza la célula seleccionada hasta el punto aproximado donde el haz láser está en foco (un ocular marcado puede facilitar este paso mediante referencias en el campo de visión). A continuación se apaga la iluminación en contraste de fase y se enciende la fuente láser. En caso de utilizar una versión movible de los fotodetectores (9), éstos pueden colocarse ahora en posición de medida. La distribución espacial del patrón de difracción proyectado sobre los fotodetectores se utiliza para el alineado fino del foco del láser con respecto al axón o dendrita. Una vez finalizado dicho alineado se inicia la adquisición de datos, eliminación de ruido mediante filtro adaptativo (14) e identificación de potenciales de acción en tiempo
real.

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Descripción de las figuras

Fig. 1 ilustra una disposición de los subsistemas de iluminación, microscopia y detección compatibles con los métodos descritos en esta invención.

Fig. 2 ilustra la interacción del haz enfocado incidente con un axón o dendrita visto en sección transversal y el patrón de interferencia en el plano de observación.

Fig. 3 muestra el patrón de difracción (intensidad normalizada en función del ángulo de observación \varphi) simulado en el plano z=0 correspondiente a un axón de radio r=1.5 \mum iluminado con un haz láser HeNe (632.8 nm). La figura compara las intensidades radiadas en el caso del potencial de membrana en reposo (- 65 mV, trazo punteado) y en el punto máximo de un potencial de acción (0 mV, trazo continuo).

Fig 4. muestra el valor absoluto de la señal óptica fraccional s, definida como \DeltaI/I, producida por un potencial de acción correspondiente al patrón de la fig. 3.

Fig. 5 muestra la relación señal-ruido (\frac{\Delta I}{\sqrt{2qIB}}), normalizada a \theta=0º, para la señal óptica generada por un potencial de acción sobre el patrón de difracción de la fig. 3.

Fig. 6 muestra un cultivo celular libre de glía optimizado para la observación del potencial de membrana según métodos y dispositivos descritos en esta invención.

Fig. 7 muestra el patrón de difracción producido por una dendrita obtenido con una cámara CCD posicionada a 10 cm sobre el cultivo celular cuando el haz láser es enfocado en z<0 \mum.

Fig. 8 muestra el patrón de difracción producido por una dendrita obtenido con una cámara CCD posicionada a 10 cm sobre el cultivo celular cuando el haz láser es enfocado en z>0 \mum .

Fig. 9 muestra el diagrama de flujo del uso del dispositivo contenido en la invención.

Claims (7)

1. Método para la medida del potencial eléctrico de la membrana celular sin necesidad de marcadores extrínsecos, cromóforos y fluoróforos, que comprende: a) la iluminación de la célula y b) el análisis del patrón de difracción producido por ésta en un plano de observación distante.

2. Método según reivindicación 1, caracterizado porque la fuente de iluminación es coherente y genera un patrón de interferencia.

3. Método según reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque el patrón de difracción se obtiene mediante un haz enfocado sobre la membrana celular por medio de una lente convergente.

4. Método de utilización del dispositivos según reivindicación 1, incluyendo: a) cultivo de neuronas libres de glía para minimización de la perturbación del haz por células no neuronales; b) filtrado del medio de cultivo previo a la medida de difracción; c) posicionamiento del haz sobre la célula; d) medida del patrón de difracción; e) cancelación del ruido de la fuente e f) identificación de los potenciales de acción en la señal óptica.

5. Dispositivo para la implementación del método según reivindicación 1, incluyendo: a) una fuente de luz (1) incidente sobre una célula libre de cromóforos o fluoróforos; b) uno o más medios de fotodetección (9) con el objeto de monitorizar el patrón de difracción producido por ésta; y d) microposicionador para el desplazamiento relativo del haz y de la célula (8).

6. Dispositivo según reivindicación 5, incluyendo elementos ópticos para el colimado y enfoque del haz (2-5).

7. Dispositivo según reivindicación 5, incluyendo un sistema de cancelación del ruido de la fuente de luz caracterizado por a) reflector parcial del haz (6), b) al menos un elemento fotodetector (7) sirviendo como referencia; c) conversor analógico-digital; d) filtro adaptativo digital (14) para estimación del ruido de la fuente a partir de la señal de referencia y e) sustractor del ruido de la señal medida.