CN112111414B - 一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于皮革固体废弃物领域，具体涉及一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法及应用。首先以制革废弃铬革屑为原料，基于碱‑酶水解体系采用分批加料工艺制备脱铬水解胶原蛋白。其次，以提取的脱铬水解胶原蛋白为营养源，复配葡萄糖、少量蛋白胨、微量元素液、琼脂、维生素B1、纯化水制备固体发酵培养基；最后，利用固体培养基发酵培养白腐真菌。制备的固体培养基，可实现白腐真菌的正常、高效生长，不仅实现了铬革屑变废为宝的目的，还可大幅替代传统的蛋白胨资源，有效降低白腐真菌的培养成本，有利于含铬蛋白固体废弃物的高值化利用。

Description

一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法及应用

技术领域

本发明属于皮革固体废弃物领域，具体涉及一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法及应用。

背景技术

20世纪90年代以来，皮革行业迅猛发展，中国逐渐成为世界上最大的制革大国，但随之而来的污染问题也日益严重。特别是制革生产过程中，有70%的废弃物为含铬废弃物，其中主要有铬革屑，含铬皮块，磨革灰等。另一方面，氮源是构成微生物细胞和代谢产物中氮素来源的营养物质。制革废弃物中含有丰富的胶原蛋白及其不同程度的水解产物（多肽、氨基酸等）可为微生物生长繁殖提供必要的有机氮源。而且制革工序中所使用的部分化料含有大量的无机盐，如浸灰过程中使用的石灰，提碱工艺中使用的氧化镁、碳酸镁等，这些物质沉积于胶原纤维中，也可成为微生物生长的微量元素，减少传统培养发酵时无机盐的添加。以往含铬革屑的焚烧、掩埋等处置手段不仅造成铬污染，而且浪费了宝贵的天然蛋白资源。而微生物法廉价、安全、不造成二次污染，利用微生物法降解环境有害污染物是当前的研究热点。

Vasileva等研究了水解胶原蛋白对铜绿假单胞菌，都柏林沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌等微生物生长的影响（Current microbiology，2007，54(1): 54-57）。郭丽等研究以猪皮胶原蛋白为底物，用枯草芽孢杆菌发酵产蛋白多肽，经过优化，得到了产蛋白多肽较高的发酵条件（郭丽等，响应面法优化枯草芽胞杆菌发酵猪皮产胶原蛋白肽研究[J].农业机械，2011，(24):156-159.）。杨志华等人采用湿热-酸法处理含铬废革料，使之发生适度的降解并用于富铬酵母的发酵培养（杨志华，刘彦，张明辉.利用含铬废革料制备富铬酵母的研究(Ⅰ)-含铬废革料的湿热-酸法降解[J].四川大学学报(工程科学版)，2003，35(6):42-44）。

以往的研究，集中于考察鲜皮等不含铬的皮块中制备的水解胶原蛋白对细菌，如球菌、杆菌等生长的影响，或者直接利用微生物，如酵母、皱绒青霉等生物直接降解含铬皮屑。前者没有考虑铬对微生物的作用，后者无疑中又过分放大了铬对微生物生长的危害，处理效果不佳。因为，铬属于重金属，且经三价铬盐处理后的铬鞣革对微生物及酶均有一定抗性，其蛋白质不易被降解。因此，在铬革屑的再利用之前，有必要消除铬的危害。现阶段脱铬的方法主要有氧化法、酸/碱水解法、酶解法等。遗憾的是，迄今为止，没有任何一种方法能够做到铬的完全脱除。而一些证据又表明，微生物通常使用微量金属元素作为一种营养或能量来源以满足其生长需求，这可能与生物酶的活化需要特定的金属离子有关。既然当前的脱铬方法难以完全除去铬，通过某些方法，降低水解蛋白中的铬含量，并控制在适当范围之类，进而适用于特定微生物的发酵培养不失为一种行之有效的手段。

另一方面，近年来白腐真菌因产漆酶（具有较强的氧化还原能力，能与木质素、胺类化合物、芳香化合物等底物发生作用）而对有机物有很强的分解能力，因而在制革工业加脂废水、染料废水处理中有广泛的应用前景。对于白腐真菌，常见的氮源为硫酸铵、氯化铵等无机氮源，酵母提取物、蛋白胨等有机氮源以及玉米粉、马铃薯、麦麸等天然含氮物质。以铬革屑脱铬后的水解胶原产物，作为制革废水处理工程菌-白腐真菌培养的主要营养源，可现实废弃物在行业内的闭路循环利用。

发明内容

为了实现废弃铬革屑的资源化利用，拓宽白腐菌发酵现有培养基的原料来源，本发明提供了一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，以铬革屑脱铬及酶水解后得到的蛋白作为白腐菌发酵营养源，以期为含铬废弃物的微生物资源化利用寻求另一条出路。

本发明的技术方案如下：

一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，包括以下步骤：

（1）水解脱铬：60-80℃下，向制革废弃铬革屑中加入铬革屑重量的6%-9%氧化钙、600%-1000%的去离子水，搅拌反应，趁热离心抽滤，收集滤液，通二氧化碳处理，抽滤除去沉淀，收集滤液，离心，弃去沉淀，收集液体；

（2）酶处理：向步骤（1）收集的液体中加入内切水解蛋白酶，搅拌，得到有小分子酶水解蛋白；

（3）培养基的配置：原料包括葡萄糖、琼脂、蛋白胨、微量元素储备液、维生素B1、步骤（2）中的小分子酶水解蛋白、纯化水；将配置好的培养基及接种工具灭菌，待用。

优选地，所述的步骤（1）中铬革屑为羊皮削匀铬革屑、牛皮削匀铬革屑、猪皮削匀铬革屑中的任意一种。

优选地，所述的步骤（1）中，以Cr₂O₃计，铬革屑的铬含量2.5%-5%。

优选地，所述的步骤（1）中，铬革屑分批次加入，分别于反应0h、0.5h、1h加入，每次加入量为铬革屑总量的1/2、1/4、1/4。

优选地，所述的步骤（1）得到的液体中铬含量为0.06-3mg/L。

优选地，所述的步骤（2）中内切水解蛋白酶的加入量为步骤（1）得到液体中水解蛋白含量的1%。

优选地，所述步骤（3）中微量元素储备液的组成为：6g/L CoSO₄·7H₂0、6g/LZnSO₄·7H₂O、6g/L FeSO₄·7H₂0、0.6g/L CuSO₄·5H₂0、0.6g/L H₃BO₄。

优选地，所述步骤（3）中培养基的配置为：葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蛋白胨0.5g/L，微量元素液储备液16.7mL/L，维生素B1 0.4g/L，固体培养基中酶水解蛋白的浓度2-25g/L。

上述方法制备的固体培养基。

上述固体培养基在白腐真菌微生物的发酵培养上的应用。

上述应用，包括以下步骤：

S1白腐真菌菌种复壮；所述的白腐真菌为黄孢原毛平革菌(PhanerochaeteChrysosporium GIM3.383)或云芝变色栓菌（Trametes versicolor CICC 50001）中的任意一种。

S2扩大培养步骤（1）复壮后的菌种；

S3接种到制备好的固体培养基上。

本发明的有益效果：

（1）水解胶原蛋白的提取率高

与常规Ca(OH)₂碱水解一次加料工艺不同，本发明采用分批次加料工艺，可以避免水解体系因铬革屑的一次投料带来的粘度迅速增长，反应均匀性变差，传质受阻等问题。本发明水解反应前期，反应浴中碱浓度大，铬革屑少，有利于脱铬及蛋白水解反应的迅速进行，后期随着体系粘度的缓慢上升，铬革屑缓慢分次加入，体系反应平缓，波动小，因而具有更高的水解效率，同时获得的水解蛋白中铬含量较低。

（2）培养基成本较低

作为白腐菌发酵培养基的传统蛋白胨资源有限，随着我国生物医药工业的发展，蛋白胨的供需矛盾将日益突出。铬革屑，属于制革废弃物，处理一吨铬革屑，企业给予的补贴在3000-5000元不等，在价格性能比方面明显优于常规的胰胨、肉胨、骨胨等动物性蛋白胨。

（3）培养效果好

氮源对微生物的生长和代谢是必不可少的。然而，来源不同的微生物对培养基成分的要求有很大差异。与一般铵盐等无机氮源相比，以废弃铬革屑水解物制备的有机氮源营养丰富，含有大量的蛋白质、肽类、游离的氨基酸以外，还含有少量的糖类、脂肪和生长因子等。本发明废皮屑经Ca(OH)₂碱水解脱铬处理，再经酶生物降解处理，提取得到的水解胶原蛋白，含铬量低、分子量低、氨基酸种类齐全，营养易吸收，用于白腐真菌微生物的发酵培养，能够有效促进菌丝的生长。

附图说明

图1 一次加料工艺（左）与分批加料工艺（右）；

图2 白腐菌在固体培养基中生长2d（从左至右：对比例、实施例1、实施例2、实施例3）；

图3 白腐菌生长2d后的菌群直径。

具体实施方式

以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的范围的限制。

实施例1

一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，包括以下步骤：

（1）水解脱铬：在60℃的恒温水浴中，于三角烧瓶中加入25g铬革屑（含Cr₂O₃：3.2%），再加入3g的氧化钙、300g的去离子水，搅拌反应0.5h后，加入12.5g铬革屑，继续反应0.5h，再加入12.5g铬革屑继续反应1h，得到粘稠的水解蛋白均混物，趁热离心抽滤去除不溶性固体物质，收集滤液，对脱铬后得到的水解蛋白样品进行通二氧化碳处理，抽滤除去白色沉淀碳酸钙，收集滤液，将滤液于离心机中8000r/min离心5 min，弃去沉淀，收集液体，测水解蛋白的含量8.7%，铬含量1.56mg/L。

（2）酶处理：将步骤（1）收集的水解蛋白液装入锥形瓶中，加入水解蛋白重1%的Alcalase水解酶（诺维信公司），于40℃磁力搅拌5h，得到有小分子酶水解蛋白。

（3）培养基的配置

固体培养基按如下配方配置：葡萄糖1.2g，琼脂1.2g，蛋白胨0.03g，微量元素液储备液1mL（其中CoSO₄·7H₂0（6g/L）、ZnSO₄·7H₂O（6g/L）、FeSO₄·7H₂0（6g/L）、CuSO₄·5H₂0（0.6g/L）、H₃BO₄（0.6g/L）），维生素B1为0.024g，步骤（2）中的酶水解蛋白16.7g，置于三角瓶中，加纯化水至60mL，砂芯橡胶塞口。将配置好的培养基及接种工具一起进行高温湿热灭菌121℃，30min；待用。

上述培养基在白腐真菌微生物的发酵培养上的应用，包括以下步骤：

S1 菌种复壮

配置PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

pH值自然，马铃薯去皮，洗净，切成小块，称取200g，加入适量蒸馏水，煮沸20min，纱布过滤若干次，滤液中加入葡萄糖与琼脂，补蒸馏水至1000mL，混匀后分装于试管中，密封，121℃灭菌20min，试管趁热摆斜面。

取冰箱冷冻保存试管斜面白腐菌种（云芝变色栓菌CICC 50001），室温下放置30min，用接种环轻轻挑取表面菌丝，伸入配置好的PDA试管斜面由低至上连续划线，至斜面顶端，塞紧橡胶塞，恒温培养箱中培养6-7d，完成菌种复苏。

S2扩大培养菌种

无菌水倒入复苏完成试管中，制成菌液，吸取菌液滴加于蛋白胨平板培养基（葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蛋白胨20g/L，微量元素液储备液（同上）16.7mL/L，维生素B1 0.4g/L）表面中心位置，吸入1mL菌悬液自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之分布均匀，静置5-10min，使菌液浸入培养基，封口膜密封边缘，倒置于培养箱28℃，150r/min，培养7d。

S3接种

无菌条件下，将步骤S2活化后的平板培养的菌丝用9mm打孔器沿着外周打孔，取生长旺盛的平板菌落边缘菌丝块，在上述制备的固体培养基上铺上一层灭菌玻璃纸，然后将菌块接到已铺好玻璃纸的提取蛋白培养基正中央。28℃培养箱培养5-6d。

实施例2

一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，包括以下步骤：

（1）水解脱铬：在60℃的恒温水浴中，于三角烧瓶中加入30g铬革屑（含Cr₂O₃：2.5%），再加入4.2g的氧化钙、390g的去离子水，搅拌反应0.5h后，加入15g废弃铬革屑，继续反应0.5h，再加入15g铬革屑继续反应1h，得到粘稠的水解蛋白均混物，趁热离心抽滤去除不溶性固体物质，收集滤液，对脱铬后得到的水解蛋白样品进行通二氧化碳处理，抽滤除去白色沉淀碳酸钙，收集滤液，将滤液于离心机中8000r/min离心5 min，弃去沉淀，收集液体，测水解蛋白的含量10.2%，铬含量1.12mg/L。

（2）酶处理：将步骤（1）收集的水解蛋白液装入锥形瓶中，加入水解蛋白重1%的Alcalase水解酶（诺维信公司），于40℃磁力搅拌5h，得到有小分子酶水解蛋白。

（3）培养基的配置

固体培养基按如下配方配置：葡萄糖1.2g，琼脂1.2g，蛋白胨0.03g，微量元素液储备液1mL（其中CoSO₄·7H₂0（6g/L）、ZnSO₄·7H₂O（6g/L）、FeSO₄·7H₂0（6g/L）、CuSO₄·5H₂0（0.6g/L）、H₃BO₄（0.6g/L）），维生素B1为0.024g，步骤（2）中的酶水解蛋白10.7g，置于三角瓶中，加纯化水至60mL，砂芯橡胶塞口。将配置好的培养基及接种工具一起进行高温湿热灭菌121℃，30min；待用。

上述培养基在白腐真菌微生物的发酵培养上的应用，包括以下步骤：

S1菌种复壮

配置PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

pH值自然，马铃薯去皮，洗净，切成小块，称取200g，加入适量蒸馏水，煮沸20min，纱布过滤若干次，滤液中加入葡萄糖与琼脂，补蒸馏水至1000mL，混匀后分装于试管中，密封，121℃灭菌20min，试管趁热摆斜面。

取冰箱冷冻保存试管斜面白腐菌种（黄孢原毛平革菌GIM3.383），室温下放置30min，用接种环轻轻挑取表面菌丝，伸入配置好的PDA试管斜面由低至上连续划线，至斜面顶端，塞紧橡胶塞，恒温培养箱中培养6-7d，完成菌种复苏。

S2扩大培养菌种

无菌水倒入复苏完成试管中，制成菌液，吸取菌液滴加于蛋白胨平板培养基（葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蛋白胨20g/L，微量元素液储备液(同上)16.7mL/L，维生素B1 0.4g/L）表面中心位置，吸入1mL菌悬液自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之分布均匀，静置5-10min，使菌液浸入培养基，封口膜密封边缘，倒置于培养箱28℃，150r/min，培养7d。

S3接种

无菌条件下，将步骤S2活化后的平板培养的菌丝用9mm打孔器沿着外周打孔，取生长旺盛的平板菌落边缘菌丝块，在上述固体培养基上铺上一层灭菌玻璃纸，然后将菌块接到已铺好玻璃纸的提取蛋白培养基正中央。28℃培养箱培养5-6d。

实施例3

一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，包括以下步骤：

（1）水解脱铬：在80℃的恒温水浴中，于三角烧瓶中加入20g铬革屑（含Cr₂O₃：5%），再加入3.6g的氧化钙、400g的去离子水，搅拌反应0.5h后，加入10g铬革屑，继续反应0.5h，再加入10g铬革屑继续反应1h，得到粘稠的水解蛋白均混物，趁热离心抽滤去除不溶性固体物质，收集滤液，对脱铬后得到的水解蛋白样品进行通二氧化碳处理，抽滤除去白色沉淀碳酸钙，收集滤液，将滤液于离心机中8000r/min离心5 min，弃去沉淀，收集液体，测水解蛋白的含量7.5%，铬含量0.06mg/L。

（2）酶处理：将步骤（1）收集的水解蛋白液装入锥形瓶中，加入水解蛋白重1%的Alcalase水解酶（诺维信公司），于35℃磁力搅拌5h，得到有小分子酶水解蛋白。

（3）培养基的配置

固体培养基按如下配方配置：葡萄糖1.2g，琼脂1.2g，蛋白胨0.03g，微量元素液储备液1mL（其中CoSO₄·7H₂0（6g/L）、ZnSO₄·7H₂O（6g/L）、FeSO₄·7H₂0（6g/L）、CuSO₄·5H₂0（0.6g/L）、H₃BO₄（0.6g/L）），维生素B1为0.024g，步骤（2）中的酶水解蛋白9.7g，置于三角瓶中，加纯化水至60mL，砂芯橡胶塞口。将配置好的培养基及接种工具一起进行高温湿热灭菌121℃，30min；待用。

上述培养基在白腐真菌微生物的发酵培养上的应用，包括以下步骤：

S1菌种复壮

配置PDA固体培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

pH值自然，马铃薯去皮，洗净，切成小块，称取200g，加入适量蒸馏水，煮沸20min，纱布过滤若干次，滤液中加入葡萄糖与琼脂，补蒸馏水至1000mL，混匀后分装于试管中，密封，121℃灭菌20min，试管趁热摆斜面。

取冰箱冷冻保存试管斜面白腐菌种（云芝变色栓菌CICC 50001），室温下放置30min，用接种环轻轻挑取表面菌丝，伸入配置好的PDA试管斜面由低至上连续划线，至斜面顶端，塞紧橡胶塞，恒温培养箱中培养6-7d，完成菌种复苏。

S2扩大培养菌种

无菌水倒入复苏完成试管中，制成菌液，吸取菌液滴加于蛋白胨平板培养基（葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蛋白胨20g/L，微量元素液储备液（同上）16.7mL/L，维生素B1 0.4g/L）表面中心位置，吸入1mL菌悬液自平板中央以同心圆方向轻轻向外涂布扩散，使之分布均匀，静置5-10min，使菌液浸入培养基，封口膜密封边缘，倒置于培养箱28℃， 150r/min，培养7d。

S3接种

无菌条件下，将步骤S2活化后的平板培养的菌丝用9mm打孔器沿着外周打孔，取生长旺盛的平板菌落边缘菌丝块，在上述固体培养基上铺上一层灭菌玻璃纸，然后将菌块接到已铺好玻璃纸的提取蛋白培养基正中央。28℃培养箱培养5-6d。

实施效果例

为了说明本发明的水解蛋白中的铬对白腐菌的影响情况，选择白腐菌在添加有规定质量浓度无机铬（碱式硫酸铬）的培养基中（葡萄糖1.2g，蛋白胨1.2g，微量元素液1mL（其中CoSO₄·7H₂0（6g/L）、ZnSO₄·7H₂O（6g/L）、FeSO₄·7H₂0（6g/L）、CuSO₄·5H₂0（0.6g/L）、H₃BO₄（0.6g/L）），加纯化水至60mL）培养6d产生的生物量为指标来衡量铬对白腐真菌生长的影响，如表1所示。

表1 不同Cr(Ⅲ)质量浓度培养基下白腐菌发酵产生的生物量（g）

Cr(Ⅲ)质量浓度/(mg/L)	20	40	60	80	150	200
							黄孢原毛平革菌GIM3.383	0.216	0.208	0.195	0.0212	0.0181	0.006
云芝变色栓菌CICC 50001	0.185	0.182	0.179	0.0176	0.0152	0.007

由表1发现，培养基中Cr(Ⅲ)质量浓度在60mg/L以下时，其对白腐菌生长影响较小。但是当Cr(Ⅲ)质量浓度超过80mg/L以后， 随着Cr(Ⅲ)质量浓度的提高，白腐菌发酵的生物量急剧下降，说明在这个质量浓度以上的Cr(Ⅲ)会对白腐菌的正常生长构成威胁。本发明水解蛋白的铬含量在0.06-3mg/L，远低于抑制白腐真菌生长的重金属铬的有害浓度，均能保证白腐菌的正常生长。

同时为了说明本发明所采用的分批加料工艺，按照实施例1中同等配比，同等水解条件，只是一次加料工艺，得到脱铬水解蛋白。并与实施例1水解蛋白对比，水解之后的蛋白溶液外观如图1所示。

由图1看出，分批加料工艺后的体系沉淀絮凝物（主要为氢氧化铬沉淀）体积多于一次加料体系，这是因为分批加料体系蛋白水解效率高，蛋白含量高，最终溶液体系黏度大，絮凝物沉降慢，造成这一现象。进一步，过滤去除两者体系的沉淀絮凝物，收集滤液，向其中通入过量二氧化碳，抽滤除去白色沉淀碳酸钙，收集滤液，将滤液于离心机中8000r/min离心5 min，弃去沉淀，收集液体。对二者收集液体的固含进行测定，即为水解蛋白的含量；一次加料的水解蛋白的含量为4.1%，铬含量12.7mg/L，而分批加料的水解蛋白的含量为8.7%，铬含量1.56mg/L，后者固含高出前者近1倍。说明本发明采用的分批加料工艺对铬革屑脱铬提取水解蛋白的效果更好，含铬率更低。

为了进一步说明本发明培养基的营养效果，取同等培养条件下不含有本发明水解蛋白的培养基作为对比例（对比例中，菌种采用云芝变色栓菌CICC 50001，固体培养基按如下配方配置：葡萄糖1.2g，琼脂1.2g，蛋白胨0.03g，微量元素液储备液1mL（其中CoSO₄·7H₂0（6g/L）、ZnSO₄·7H₂O（6g/L）、FeSO₄·7H₂0（6g/L）、CuSO₄·5H₂0（0.6g/L）、H₃BO₄（0.6g/L）），维生素B1为0.024g，加纯化水至60mL。），结果如图2及图3所示。

由图2及图3可知，本发明培养基培养2d后白腐菌生长情况较好，说明提取的蛋白得以有效利用，而对比例中不含本发明水解蛋白，营养不足，白腐菌菌落生长稀疏，直径较小。

Claims (9)

1.一种利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）水解脱铬：60-80℃下，向制革废弃铬革屑中加入铬革屑重量的6%-9%氧化钙、600%-1000%的去离子水，搅拌反应，趁热离心抽滤，收集滤液，通二氧化碳处理，抽滤除去沉淀，收集滤液，离心，弃去沉淀，收集液体；

（2）酶处理：向步骤（1）收集的液体中加入内切水解蛋白酶，搅拌，得到小分子酶水解蛋白；

（3）培养基的配置：原料包括葡萄糖、琼脂、蛋白胨、微量元素储备液、维生素B1、步骤（2）中的小分子酶水解蛋白、纯化水；将配置好的培养基及接种工具灭菌，待用；

所述的步骤（1）中，铬革屑分批次加入，分别于反应0h、0.5h、1h加入，每次加入量为铬革屑总量的1/2、1/4、1/4。

2.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中铬革屑为羊皮削匀铬革屑、牛皮削匀铬革屑、猪皮削匀铬革屑中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述的步骤（1）中，以Cr₂O₃计，铬革屑的铬含量2.5%-5%。

4.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述的步骤（1）得到的液体中铬含量为0.06-3mg/L。

5.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述的步骤（2）中内切水解蛋白酶的加入量为步骤（1）得到液体中水解蛋白含量的1%。

6.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述步骤（3）中微量元素储备液的组成为：6g/L CoSO₄·7H₂0、6g/L ZnSO₄·7H₂O、6g/LFeSO₄·7H₂0、0.6g/L CuSO₄·5H₂0、0.6g/L H₃BO₄。

7.根据权利要求1所述的利用铬革屑制备白腐真菌固体培养基的方法，其特征在于，所述步骤（3）中培养基的配置为：葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，蛋白胨0.5g/L，微量元素液储备液16.7mL/L，维生素B1 0.4g/L，固体培养基中酶水解蛋白的浓度2-25g/L。

8.采用权利要求1所述的方法制备的固体培养基。

9.权利要求8所述的固体培养基在白腐真菌微生物的发酵培养上的应用。

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