CN112106656A

CN112106656A - 一种石菖蒲直接器官发生型再生法

Info

Publication number: CN112106656A
Application number: CN202011014692.7A
Authority: CN
Inventors: 蔡永萍; 韩文龙; 章扬; 金青; 黄满畅; 王亮
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2020-12-22

Abstract

本发明提供了一种石菖蒲直接器官发生型再生法，涉及植物细胞工程技术领域；利用石菖蒲鞭芽或根状茎为外植体，在不进行愈伤的前提下直接再生获得完整植株，使石菖蒲的繁殖不受季节和材料限制，可以克服根状茎繁殖过程病毒积累、种质退化的缺点；生长周期短，组培苗萌发率高。本发明所述再生法克服了愈伤组织再生途径变异率高和周期长的缺点，同时还可以减少培养步骤、缩短培养时间、提高石菖蒲组培苗的生产效率，使得生根速度快、根粗壮、成本低。

Description

一种石菖蒲直接器官发生型再生法

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种石菖蒲直接器官发生型再生法。

背景技术

石菖蒲(Acorus tatarinowii Schott)是天南星科菖蒲属多年生草本植物，又名九节菖蒲、岩菖蒲、野韭菜等。根状茎芳香，根肉质，具多数须根，叶全缘，排成二列，肉穗花序(佛焰花序)，花梗绿色，佛焰苞叶状。喜阴湿环境，不耐干旱，稍耐寒。它具有附生习性，分布在中国黄河流域的南部，生长在海拔20～2000m的湿地，岸边或溪流的石头之间。

《中国药典(2020)》中是以石菖蒲的根状茎作为药用，具有开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃的效用。除其药用价值外，石菖蒲不仅是端午节最常用的植物，还常常作为香料用于烹饪。目前石菖蒲以药用为主，近年来因其具有丰富的药理学作用日益得到重视。然而，石菖蒲是多年生草本植物，营养生长过程缓慢，其种子在果实中极难收集，自然状态下种子萌发率和出芽率极低。目前石菖蒲主要通过根状茎繁殖，这种繁殖方法不仅受季节和材料的限制，而且长期无性繁殖使植物体内积累大量病毒，导致石菖蒲品质退化，很难在短时间内获得大量优质种苗。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种石菖蒲直接器官发生型再生法，对石菖蒲新品种选育和工厂化种植方面有着重要的意义。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种石菖蒲直接器官发生型再生法，包括以下步骤：(1)将外植体消毒后接种至启动培养基上进行初代培养，得萌发芽；所述启动培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 1.5～2.0mg/L、NAA 0.3～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L；所述外植体包括鞭芽或根状茎；

(2)将所述萌发芽接种至继代培养基上进行继代培养，萌发芽继续生长；所述继代培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 2.0～2.5mg/L、NAA 0.5～1.0mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L；

(3)待步骤(2)所述继续生长的萌发芽叶长达到5～6cm时，移栽至装有蛭石的培养瓶中进行生根培养，所述生根培养时每天向培养瓶内加入5～7mg/L的IBA。

优选的，步骤(1)所述消毒的方法，包括：将所述外植体用洗衣粉的水溶液浸泡10～20min，流水冲洗30～50min；用质量分数为75％的乙醇水溶液浸泡30～60s，无菌水冲洗2～3次后，再用质量分数为0.1％的HgCl₂水溶液中浸泡6～8min，无菌水冲洗3～5次后，吸干水分；每250mL所述HgCl₂水溶液中还包括0.5～1mL的吐温-80。

优选的，步骤(1)所述初代培养时，先暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养，光照时间16～18h/d，光照强度为10～12.5μmol/(m²·s)，温度为25℃。

优选的，步骤(1)所述初代培养的时间为4周。

优选的，步骤(2)所述继代培养时的光照强度为31.25～37.5μmol/(m²·s)，光照时间为16～18h/d，温度为24～27℃。

优选的，步骤(2)所述继代培养的周期为4周。

优选的，步骤(3)所述生根培养时，光照强度为25μmol/(m²·s)，光照时间为14h/d，温度为25℃。

本发明提供了一种石菖蒲直接器官发生型再生法，利用石菖蒲鞭芽或根状茎直接再生获得完整植株，使石菖蒲的繁殖不受季节和材料限制，可以克服根状茎繁殖过程病毒积累、种质退化的缺点；利用较小的鞭芽再生不但具有脱毒的效果，而且其可直接分化成苗，生长周期短，可以在较短时间内获得大量优质种苗；外植体可选择鞭芽或根状茎，材料利用率高，培养基激素配比合理，组培苗萌发率高；在进行外植体消毒时，同时兼顾成活率、褐化率和污染率，可以达到高成活率、低污染率和褐化率。本发明所述再生法不包含愈伤分化的过程，克服了愈伤组织再生途径变异率高和周期长的缺点。本发明所述再生法在促进生根时，集生根和炼苗于一体，可以减少培养步骤、缩短培养时间、提高石菖蒲组培苗的生产效率，使得生根速度快、根粗壮、成本低。

附图说明

图1为本发明方法技术路线图；

图2为本发明方法长出新叶的鞭芽；

图3为本发明方法长出新叶的根状茎；

图4为本发明实施例1诱导生根图；

图5为本发明实施例1诱导的石菖蒲根；

图6为本发明实施例2诱导生根图；

图7为本发明实施例2诱导的石菖蒲根。

具体实施方式

本发明提供了一种石菖蒲直接器官发生型再生法，流程如图1所示，包括以下步骤：(1)将外植体消毒后接种至启动培养基上进行初代培养，得萌发芽；所述启动培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 1.5～2.0mg/L、NAA 0.3～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L；所述外植体包括鞭芽或根状茎；

本发明将外植体消毒后接种至启动培养基上进行初代培养，得萌发芽；所述启动培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 1.5～2.0mg/L、NAA 0.3～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L；所述外植体包括鞭芽或根状茎。本发明所述消毒的方法，优选包括：将所述外植体用洗衣粉的水溶液浸泡10～20min，流水冲洗30～50min；用质量分数为75％的乙醇水溶液浸泡30～60s，无菌水冲洗2～3次后，再用质量分数为0.1％的HgCl₂水溶液中浸泡6～8min，无菌水冲洗3～5次后，吸干水分；每250mL所述HgCl₂水溶液中还包括0.5～1mL的吐温-80。本发明对所述洗衣粉的水溶液浓度并没有特殊限定，可清洗干净石菖蒲外植体表面杂物即可。本发明优选用无菌滤纸吸干外植体上的水分。

本发明对消毒后的外植体进行初代培养，所述初代培养时，优选先暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养，光照时间16～18h/d，光照强度为10～12.5μmol/(m²·s)，温度为25℃。本发明所述初代培养的时间优选为4周。

得萌发芽后，本发明将所述萌发芽接种至继代培养基上进行继代培养，萌发芽继续生长；所述继代培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 2.0～2.5mg/L、NAA 0.5～1.0mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L。本发明在进行所述继代培养前，优选还包括将所述外植体上变黄的叶片以及褐化部分除去，然后转接到继代培养基上进行继代培养，每隔4周进行一次继代培养。本发明所述继代培养时的光照强度优选为31.25～37.5μmol/(m²·s)，光照时间优选为16～18h/d，温度优选为24～27℃。

本发明待所述继续生长的萌发芽叶长达到5～6cm时，移栽至装有蛭石的培养瓶中进行生根培养，所述生根培养时每天向培养瓶内加入5～7mg/L的IBA。本发明所述生根培养时所述IBA的加入量并没有特殊限定，优选为使蛭石湿润即可。本发明所述生根培养时，光照强度优选为25μmol/(m²·s)，光照时间优选为14h/d，温度优选为25℃。

下面结合实施例对本发明提供的一种石菖蒲直接器官发生型再生法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.外植体的预处理和消毒

选取生长旺盛、无病虫害的石菖蒲，取幼嫩的鞭芽作为外植体。用流水冲洗10min将外植体冲洗干净，在洗衣粉水中浸泡10min，再用流水冲洗30min，在超净工作台中用质量分数为75％的酒精浸泡30s，用无菌水冲洗3次，再置于250mL质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中浸泡6min，其中HgCl₂溶液中需要加入1mL吐温-80，待HgCl₂消毒结束用无菌水冲洗4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，备用。

2.初代培养

将消毒过后的鞭芽接种在启动培养基上，每瓶接种一个鞭芽，暗培养3d后按照培养条件培养，培养4周。启动培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.15g/L活性炭，培养基pH为5.8。培养条件为光照强度12.5μmol/(m²·s)，光照18h/d，黑暗6h/d，温度25℃。

3.继代培养

初代培养4周后，将鞭芽转接到继代培养基上进行继代培养，每隔4周将石菖蒲的鞭芽转接到新的培养基上进行继代培养(图2)。继代培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+5g/L琼脂+0.15g/L活性炭，培养基pH为5.8，培养条件为光照强度31.25μmol/(m²·s)，光照18h/d，黑暗6h/d，温度25℃。

4.生根培养

挑选继代培养中叶长达到5～6cm的鞭芽，移栽到装有蛭石的培养瓶中(图4)，每天向培养瓶中加入6mg/L IBA(加入的量使蛭石保持湿润为宜)诱导生根。培养条件为光照强度25μmol/(m²·s)，光照14h/d，黑暗10h/d，温度25℃。培养15～20d即可诱导生根(图5)，根长1～2cm，50d时生根率达到75％。

实施例2

1.外植体的预处理和消毒

选取生长旺盛、无病虫害的石菖蒲，用单面刀片将其根状茎切成1～2cm长的茎段作为外植体。用流水冲洗10min将外植体冲洗干净，在洗衣粉水中浸泡20min，再用流水冲洗40min，在超净工作台中用质量分数为75％的酒精浸泡60s，用无菌水冲洗3次，再置于250mL质量分数为0.1％的HgCl₂溶液中浸泡8min，其中HgCl₂溶液中需要加入1mL吐温-80，待HgCl₂消毒结束用无菌水冲洗4次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，备用。

2.初代培养

将消毒过后的根状茎接种在启动培养基上，每瓶接种一个茎段，暗培养5～7d后按照培养条件培养。启动培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+4.8g/L琼脂+0.15g/L活性炭，培养基pH为5.8。培养条件为光照强度12.5μmol/(m²·s)，光照18h/d，黑暗6h/d，温度25℃。

3.继代培养

初代培养4周后切去茎段褐化部分，将茎段转接到继代培养基上进行继代培养，每隔4周将石菖蒲的茎段转接到新的培养基上继代培养(图3)。继代培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.5mg/L+30g/L蔗糖+4.8g/L琼脂+0.15g/L活性炭，培养基pH为5.8。培养条件为光照强度31.25μmol/(m²·s)，光照18h/d，黑暗6h/d，温度25℃。

4.生根培养

挑选继代培养中叶长达到5～6cm的茎段，切除基部褐化部分，将其转移到装满蛭石的培养瓶中培养(图6)，每天向培养瓶中加入6mg/L IBA(加入的量使蛭石保持湿润为宜)诱导生根。培养条件为光照强度25μmol/(m²·s)，光照14h/d，黑暗10h/d，温度25℃。培养20d左右即可生根(图7)，形成完整植株。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种石菖蒲直接器官发生型再生法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将外植体消毒后接种至启动培养基上进行初代培养，得萌发芽；所述启动培养基以MS为基本培养基，还包括以下质量浓度的成分：6-BA 1.5～2.0mg/L、NAA 0.3～0.5mg/L、蔗糖25～30g/L、琼脂4～6g/L和活性炭0.1～0.2g/L；所述外植体包括鞭芽或根状茎；

2.根据权利要求1所述再生法，其特征在于，步骤(1)所述消毒的方法，包括：将所述外植体用洗衣粉的水溶液浸泡10～20min，流水冲洗30～50min；用质量分数为75％的乙醇水溶液浸泡30～60s，无菌水冲洗2～3次后，再用质量分数为0.1％的HgCl₂水溶液中浸泡6～8min，无菌水冲洗3～5次后，吸干水分；每250mL所述HgCl₂水溶液中还包括0.5～1mL的吐温-80。

3.根据权利要求1所述再生法，其特征在于，步骤(1)所述初代培养时，先暗培养3～7d，然后进行光暗交替培养，光照时间16～18h/d，光照强度为10～12.5μmol/(m²·s)，温度为25℃。

4.根据权利要求1或3所述再生法，其特征在于，步骤(1)所述初代培养的时间为4周。

5.根据权利要求1所述再生法，其特征在于，步骤(2)所述继代培养时的光照强度为31.25～37.5μmol/(m²·s)，光照时间为16～18h/d，温度为24～27℃。

6.根据权利要求1或5所述再生法，其特征在于，步骤(2)所述继代培养的周期为4周。

7.根据权利要求1所述再生法，其特征在于，步骤(3)所述生根培养时，光照强度为25μmol/(m²·s)，光照时间为14h/d，温度为25℃。