CN112094896A - 活动性结核病诊断标志物、试剂盒及其应用 - Google Patents
活动性结核病诊断标志物、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了活动性结核病诊断标志物、试剂盒及其应用，其特征在于，包括血液样本中的血液生物标志物MCEMP1蛋白质，所述MCEMP1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，还提供了能够快速检测受试者中是否患有活动性肺结核的试剂盒，所述试剂盒包括全血样品中总RNA提取相关试剂、定量PCR相关试剂、ELISA相关试剂。本发明首次采用MCEMP1作为活动性肺结核检测的生物标记物，用于肺结核的临床诊断以及鉴别诊断，为肺结核的临床诊断提供了新的方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，更具体地，涉及MCEMP1(C19orf59)作为活动性肺结核诊断标志物、试剂盒及其应用。
背景技术
肺结核是由结核分枝杆菌感染引起的一种慢性传染性疾病。在世界范围内，结核病是十大死因之一，也是单一传染源(高于艾滋病毒/艾滋病)的主要死因。2018年，全球估计有1000 万人患上肺结核，共有150万人死于结核病(包括25.1万艾滋病毒携带者)。新发结核患者2/3 来源八个结核高负担国家，其中印度占比最高，其次是中国、印度尼西亚、菲律宾、巴基斯坦、尼日利亚、孟加拉国和南非。耐多药结核病(MDR-TB)仍然是一种公共卫生危机和健康安全威胁。肺结核的成功治疗在很大程度上取决于准确诊断和开始标准化的抗结核治疗。在临床实践中，肺结核是根据病人的症状、胸片(胸片)异常和痰细菌学检查来治疗的。痰涂片检查可在近50-60％的肺结核患者中发现抗酸杆菌。然而，在目前一些活动性肺结核病例中，无论是细菌学检查还是连续的胸部X光检查都不能明确地显示疾病的活动性。影像学检查结果提示，无临床或微生物证据的痰阴性肺结核是活动性肺结核发生的最危险因素之一。
涂阴肺结核患者比涂阳肺结核患者传播结核病的风险低，但仍能传播疾病。近50％的肺结核患者为痰涂片阴性。聚合酶链反应(PCR)可以快速分析痰标本，但灵敏度较低。部分患者接受标准的6个月抗结核治疗，涂片和培养呈阴性，但肺部仍有病变。且约5％的药物敏感肺结核患者在完成标准的6个月抗结核治疗后6个月内会复发。菌阴结核病因痰菌阴性，其活动性判断常依赖于结核病的中毒症状(低烧、盗汗、乏力、体重减轻等)、PPD强阳性、 TSPOT、血沉增快、腺苷脱氨酶水平增高等综合因素判断。活动的菌阴结核病X线特征是病灶边缘模糊或部分模糊，密度不高的点状、斑点、斑块状、片状病灶密度不均的病灶，胸部 CT影像学特征是2-4mm腺泡结节病灶，5-8mm小叶病灶，磨玻璃样病变、斑块状、片状病变。
使用氟-18-氟脱氧葡萄糖(FDG)的正电子发射断层扫描和计算机断层扫描(PET/CT)是指导肿瘤患者治疗的一种有用的成像方法。FDG是葡萄糖的类似物，由于激活的巨噬细胞(肉芽肿中最丰富的炎性细胞)消耗大量葡萄糖，在结核性肉芽肿等细菌感染部位积聚。肺结核病灶中FDG的积聚与细菌数量和高代谢性病灶复发的高风险相关。虽然肺结核病灶中的高摄取表明存在活动性疾病，但也可能表明宿主免疫系统的反应最终将占优势。然而，在PET 的高代谢损伤中，免疫反应更为活跃。当宿主出现免疫抑制时，如果病变中含有残留的结核分枝杆菌，则更可能演变为复发性结核。然而，FDG-PET/CT价格昂贵，不能作为结核病病灶完全不活动的指标。因此，迫切需要找到准确诊断结核病病灶完全失活的分子指标，为今后结核病的完全治愈提供依据。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有活动性结核病诊断标志物特异性不好，灵敏度不高，且检测耗时的问题，提供MCEMP1 mRNA作为活动性肺结核诊断标志物的一种技术构思，为活动性肺结核的诊断提供新的靶点，并且对活动性肺结核诊断有良好的临床应用价值。
具体地，本发明一方面提供了选择性地检测一种全血MCEMP1 mRNA的试剂在制备快速诊断活动性肺结核的试剂盒中的用途，所述试剂用于测定得自所述受试者的全血中MCEMP1 mRNA的水平，其中所述MCEMP1 mRNA的水平相对于正常人受试者的水平的降低指示所述受试者中存在活动性肺结核。
可选择地，所述MCEMP1 mRNA的序列如SQE ID NO:1所示。
可选择地，其中使用扩增、杂交、和/或测序的方法检测所述全血中MCEMP1 mRNA的水平。
可选择地，使用定量PCR来检测所述全血中MCEMP1 mRNA的水平。
可选择地，所述试剂包括所述全血中MCEMP1 mRNA定量PCR上游引物及下游引物。
可选择地，所述全血中MCEMP1 mRNA定量PCR上游引物及下游引物序列分别如SQEID NO:2所示。
具体地，本发明另一方面，还提供了所述试剂盒的使用方法，
a.测定得自所述受试者全血中MCEMP1 mRNA的水平及蛋白水平；
b.将血浆样品中全血中MCEMP1 mRNA的水平及蛋白水平与一组数据对比，所述数据为正常受试者中全血中MCEMP1 mRNA的水平及血浆中MCEMP1蛋白水平；
c.基于步骤b做出的对比结果，确定所述受试者是否患有活动性肺结核。
具体地，本发明另一方面还提供了一种快速检测活动性肺结核的试剂盒，所述试剂盒包括全血中总RNA提取相关试剂、所述MCEMP1 mRNA RT-PCR相关试剂以及定量PCR相关试剂、ELISA试剂。
具体地，本发明另一方面，还提供了所述全血MCEMP1 mRNA及血浆中MCEMP1蛋白水平中在制备快速检测活动性肺结核的试剂盒中应用。
在发明的方法或试剂盒的某些实施方案中，所述受试者可以是哺乳动物，例如，人。
在发明的方法或试剂盒中，通过执行软件分类算法，可以确定至少一种mRNA的水平相对于合适对照的差异。
本发明相对于现有技术而言，具有以下技术效果：
1.本发明首次采用血液样本中的MCEMP1作为活动性肺结核检测的生物标记物。用ROC曲线分析，结果显示，全血中MCEMP1表达水平对活动性肺结核诊断具有较好的敏感性和特异性。因此，本发明克服了现有活动性肺结核诊断检出率低、耗时长等缺点，具有特异性好、灵敏度高的特点，对活动性肺结核的辅助诊断有良好的临床应用价值。
2.本发明提供了利用血中MCEMP1作为活动性肺结核检测的生物标记物检测活动性肺结核的检测试剂以及试剂盒，能够准确快速的对活动性肺结核进行检测以及对活动性肺结核的发病阶段进行检测，便于临床应用。
附图说明
图1为活动性肺结核患者和健康志愿者全血中MCEMP1的表达水平。
活动性肺结核患者(TB)取45例和健康志愿者(HC)取55例。数据取两次次平行试验均值，*表示具有统计学差异，**表示具有显著性差异。
图2为MCEMP1在结核(TB)和健康(HC)全血中相对表达水平的ROC分析。
活动性肺结核患者(TB)取45例和健康志愿者(HC)取55例。数据取两次次平行试验均值。
图3为活动性肺结核患者和健康志愿者血浆中MCEMP1的蛋白水平。
活动性肺结核患者(TB)取24例和健康志愿者(HC)取2例。数据取两次次平行试验均值，*表示具有统计学差异，**表示具有显著性差异。
具体实施方式
下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
MCEMP1(Mast cell expressed membrane protein 1)，肥大细胞表达膜蛋白1，又称 C19ORF59，是由肥大细胞、巨噬细胞等组织表达的跨膜蛋白。其编码基因位于染色体19p13.2。其确切的生物意义及其功能尚未确定，但该基因启动子区含有活化B细胞的核因子kappa轻链增强子和活化T细胞结合基序的核因子，与许多免疫受体基因相似。虽然对MCEMP1的研究有限，但推测这个基因编码一个单程跨膜蛋白。根据其表达模式，推测其参与调节肥大细胞分化或免疫应答。最近研究表明，肥大细胞是脑缺血的第一反应，是血脑屏障通透性的早期调节因子。脑卒中患者MCEMP1表达增加可能是脑肥大细胞活化和肥大细胞介导的血脑屏障破坏的结果。此外，在原发性卒中类型和缺血性卒中亚型之间检测到的表达差异可能表明MCEMP1表达与梗死面积之间存在关联。并且，MCEMP1的外周血表达可能对脑卒中的诊断和预后有一定的价值。目前在结核病的关联尚未报道。
1.简介
本发明提供了血液生物标志物MCEMP1，其序列如SEQ ID NO:1所示，其指示活动性肺结核，且其可以用于准确地诊断受试者中的活动性肺结核。另外，提供了用于诊断活动性肺结核的试剂盒。在某些实施方案中，所述方法需要检测合适的样品中的MCEMP1。
2.定义
在详细阐述本发明之前，提供要在本文中使用的某些术语的定义。除非另外定义，否则在本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域技术人员通常理解相同的含义。
术语“受试者”意图包括，能够直接地或间接地涉及活动性肺结核的任意障碍。受试者的例子包括哺乳动物，例如，人类、非人灵长类动物、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因的非人动物。在某些实施方案中，所述受试者是人，例如，遭受活动性肺结核的人，处于遭受活动性肺结核及其相关的风险中的人，或者潜在地能够遭受活动性肺结核相关的痴呆的人。
术语“治疗”在本文中用于表示解除、减轻或缓解受试者中的疾病的至少一种征状。例如，关于活动性肺结核，术语“治疗”包括：解除、减轻或缓解认知损害(诸如记忆和/或定向的病损)或总体功能(所有功能，包括日常生活活动)的病损，和/或减慢或逆转总体或认知损害的进行性衰退。因此，术语“治疗”也包括：在疾病的临床表现或疾病的征状之前延迟或阻止发作，和/或减少疾病征状的发展或恶化的风险。
术语“约”或“大约”通常是指在给定的值或范围的5％内，或更优选1％内。
3.活动性肺结核的mRNA生物标志物
本发明涉及mRNA生物标志物：与“正常”受试者相比，其被发现在得自患有活动性肺结核的受试者的生物样品中差别地存在。如果在样品中的一种mRNA生物标志物的表达水平之间的差异被确定为统计上显著的，那么一种mRNA生物标志物在样品之间差别地存在。统计显著性的常见试验包括、但不限于：t-检验、ANOVA、Kniskal-Wallis、Wilcoxon、Mann-Whitney 和比值比。单独的或组合的mRNA生物标志物可以用于提供受试者患有或没患活动性肺结核的相对风险的量度。
4.测定样品中的mRNA生物标志物的水平
通过任意合适的方法，可以测定生物样品中的mRNA生物标志物的水平。可以使用任意可靠的用于测量样品中的mRNA的水平或量的方法。通常，可以从样品检测和定量mRNA，所述样品例如是通过关于mRNA已知的多种方法分离的RNA的样品，所述方法包括：例如，基于扩增的方法(例如，聚合酶链式反应(PCR)、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)、定量聚合酶链式反应(qPCR)、滚环扩增等)、基于杂交的方法(例如，杂交阵列(例如，微阵列)、NanoString分析、RNA印迹分析、支链DNA(bDNA)信号放大、原位杂交等)和基于测序的方法(例如，下一代测序方法，例如，使用Illumina或IonTorrent平台)。其它示例性的技术包括核糖核酸酶保护测定(RPA)和质谱法。
5.使用mRNA生物标志物确定活动性肺结核
本文描述的mRNA生物标志物可以用于诊断试验中以评估受试者的活动性肺结核状态。疾病状态包括活动性肺结核的存在或不存在。疾病状态还可以包括监测活动性肺结核的进程，例如，监测疾病进展。基于受试者的活动性肺结核状态，可以指示其它操作，包括、例如，其它诊断试验或治疗操作。
通常以测定的准确度、测定的灵敏度、测定的特异性或“曲线下面积”(AUC)(例如，在受试者操作特征(ROC)曲线下的面积)的方式，测量诊断试验的正确预测疾病状态的能力。本文中使用的准确度是错误分类的样品的比例的量度。可以将准确度计算为，正确分类的样品的总数除以样品的总数(例如在试验群体中)。灵敏度是通过试验预测为阳性的“真阳性”的量度，且可以计算为正确鉴别的活动性肺结核样品的数目除以活动性肺结核样品的总数。特异性是通过试验预测为阴性的“真阴性”的量度，且可以计算为正确鉴别的正常样品的数目除以正常样品的总数。AUC是受试者操作特征曲线下的面积的量度，所述曲线是灵敏度相对于假阳性率的图(1-特异性)。AUC越大，试验的预测值越有效。试验的实用性的其它有用的量度包括“阳性预测值”(它是试验为阳性的实际阳性的百分比)和“阴性预测值”(它是试验为阴性的实际阴性的百分比)。
6.用于检测mRNA生物标志物的试剂盒
在另一个方面，本发明提供了用于诊断受试者中的活动性肺结核状态的试剂盒，所述试剂盒可用于测定MCEMP1的转录水平。试剂盒可以包括：适合选择性地检测mRNA存在的材料和试剂，所述mRNA指示源自受试者的样品中的活动性肺结核。例如，在一个实施方案中，所述试剂盒可以包括与mRNA特异性地杂交的试剂。这样的试剂可以是适合用于检测mRNA(例如，探针或引物)的形式的核酸分子。所述试剂盒可以包括可用于执行测定以检测一种或多种mRNA的试剂，例如，可以用于在qPCR反应中检测一种或多种mRNA的试剂。所述试剂盒同样可以包括可用于检测一种或多种mRNA的微阵列。
在另一个实施方案中，所述试剂盒可以含有一个或多个容器，所述容器装有mRNA生物标志物样品，所述样品将用作参比标准、合适对照或用于校准测定以检测试验样品中的mRNA 生物标志物。
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1
活动性肺结核患者和健康志愿者血标本均来自上海市公共卫生临床中心。收集好的 EDTA抗凝的全血4小时内2000g,离心10min,取500μL血浆保存在-80℃冰箱。剩余血标本采用QIAGEN公司QIAamp RNA Blood mini Kit试剂盒分离提取全血中总RNA。取1μL用于Nanodrop 2000检测，检测样本的浓度和纯度。
实施例2
利用实施例1得到的全血总RNA作为模板，采用Takara的PrimeScriptRT reagentKit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒，按照操作说明进行cDNA合成。
1.去除基因组DNA反应
按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性进行各项时先按数+2 的量配制Master Mix，然后再分装到每个反应管中，最后加入RNA样品。
42℃2min(或者室温5min)
4℃保存
2.反转录
反应液配制请在冰上进行。为了保证的准确性，各项时先按数+2的量配的量配制Master Mix，然后再分装10μL到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录应。
37℃15min
85℃5sec
4℃
实施例3
以cDNA为模板，采用Promega公司的
qPCR Master Mix试剂盒，按以下表准备反应混合液。目的基因MCEMP1的特异性上下游引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列为：MCEMP-Forward Primer：5’-CCATGCAAAGGGTGGTCATTC-3’； MCEMP-ReversePrimer：5’-GCTTGTACGGAGTTTGAGACATT-3’(SEQ NO ID:2-3)。
然后以下表所示的反应体系进行PCR扩增。
实施例4
采用武汉华美生物工程有限公司的Human Mast cell-expressed membraneprotein 1(C19orf59)ELISA kit，检测活动性结核病人和健康志愿者血浆中MCEMP1蛋白的含量。
具体如下：
1.将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟。
2.加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL,轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时。
3.弃去液体，甩干，不用洗涤。
4.每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
5.弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μL/孔，甩干。
6.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
7.弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μL/孔，甩干。
8.依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30分钟。
9.依序每孔终止溶液50μL，终止反应。
10.在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的OD值。
实施例6
所述试剂盒，包括全血总RNA提取相关试剂、RT-PCR相关试剂、定量PCR相关试剂及ELISA试剂盒。
所述RNA提取相关试剂：QIAGEN公司QIAamp RNA Blood mini Kit试剂盒。
RT-PCR相关试剂：Takara的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)反转录试剂盒。
定量PCR相关试剂：Promega公司的
qPCR Master Mix试剂盒。
ELISA试剂盒：武汉华美生物工程有限公司的Human Mast cell-expressedmembrane protein 1(C19orf59)ELISA kit。
实施例6
检测58例活动性肺结核患者和55例健康志愿者全血MCEMP1的表达水平。
具体按照实施例1-3的方法进行检测。
以上实验重复三次，以GAPDH作为内参对照，通过2-ΔΔCt法计算各组之间全血中MCEMP1表达水平的差异；
如附图1所示，与健康相比，活动性肺结核患者全血中MCEMP1表达水平明显上调。
此外，利用ROC曲线分析全血中MCEMP1在活动性肺结核的诊断价值，结果表明检测全血中MCEMP1表达水平可作为活动性肺结核的诊断标志物。如附图2所示，当结核组(TB)和健康组(HC)进行ROC分析时，AUC面积为0.654表明MCEMP1 mRNA对活动性肺结核的诊断具有较好价值，具有特异性好，灵敏度高特点。
实施例7
检测24例活动性肺结核患者和20例健康志愿者血浆中MCEMP1的蛋白水平。
具体按照实施例4的方法进行检测。
以上实验重复三次，根据标准曲线计算待测样本中MCEMP1的浓度；
如图3所示，与健康相比，活动性肺结核患者血浆中MCEMP1蛋白水平明显上调。
利用ROC曲线分析全血中MCEMP1在活动性肺结核的诊断价值，结果表明检测全血中MCEMP1表达水平可作为活动性肺结核的诊断标志物。如附图2所示，当结核组(TB)和健康组(HC)进行ROC分析时，AUC面积为0.7738，且当结核组(TB)和肺癌组(LC)进行ROC分析时，AUC面积为0.869，表明MCEMP1 mRNA对活动性肺结核的诊断具有较好价值，具有特异性好，灵敏度高特点。
以上具体实施方式为便于理解本发明而说明的较佳实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种活动性结核病诊断标志物，其特征在于，包括血液样本中的血液生物标志物MCEMP1蛋白质，所述MCEMP1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种快速诊断活动性肺结核的试剂盒，其特征在于，用于测定MCEMP1的转录水平，试剂盒中为适合选择性地检测MCEMP1的mRNA生物标志物存在的检测试剂，包括：
全血总RNA提取试剂、RT-PCR扩增试剂、定量PCR试剂、以及ELISA试剂，
其中，ELISA试剂：每孔检测板(12x 8包被覆的微孔)中包含、冷冻干燥的标准品100μL、生物素抗体(100x浓缩液)100μL、HRP-亲和素100μL(100x浓缩液)、生物素抗体稀释液、HRP-亲和素稀释剂、样品稀释液、洗涤缓冲液(25x浓缩液)、TMB底物90μL、终止液50μL、封板膜(用于96孔)；
所述试剂盒同样可以包括可用于检测一种或多种mRNA的微阵列。
3.根据权利要求2所述的一种快速诊断活动性肺结核的试剂盒，其特征在于，所述MCEMP1 mRNA定量PCR扩增的上游引物氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
4.根据权利要求2所述的一种快速诊断活动性肺结核的试剂盒，其特征在于，所述MCEMP1 mRNA定量PCR扩增的下游引物氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求2所述的一种快速诊断活动性肺结核的试剂盒，其特征在于，
全血总RNA提取试剂，采用RNA Blood mini Kit试剂盒，包含硅胶膜、抗凝剂如柠檬酸盐、肝素或EDTA等稳定血液样本，
RT-PCR扩增试剂，采用RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)
定量PCR试剂，采用qPCR Master Mix试剂盒，包含MCEMP1 mRNA的定量PCR上游引物0.2μL，定量PCR下游引物0.2μL。
6.一种如权利要求2所述快速诊断活动性肺结核的试剂盒的使用方法，其特征在于，试剂盒中的检测试剂用于测定得自受试者的全血样品中的MCEMP1的转录及蛋白水平，其中所述MCEMP1的转录水平和蛋白水平相对于正常人受试者的水平的升高指示所述受试者中存在活动性肺结核，包括以下步骤：
a.测定得自所述受试者全血中MCEMP1的mRNA水平；
b.将全血中MCEMP1的mRNA水平与第一组数据对比，通过2-ΔΔCt法计算各组之间全血中MCEMP1表达水平的差异，所述第一组数据为正常受试者中全血中MCEMP1的mRNA水平；
c.基于步骤b做出的对比结果，确定所述受试者是否患有活动性肺结核。
7.一种如权利要求2所述快速诊断活动性肺结核的试剂盒的使用方法，其特征在于，试剂盒中的检测试剂用于测定得自受试者的全血样品中的MCEMP1的转录及蛋白水平，其中所述MCEMP1的转录水平和蛋白水平相对于正常人受试者的水平的升高指示所述受试者中存在活动性肺结核，包括以下步骤：
a.测定得自所述受试者血浆中MCEMP1蛋白水平；
b.将全血中MCEMP1蛋白的水平与第二组数据对比，所述第二组数据为正常受试者中血浆中MCEMP1蛋白水平；
c.基于步骤b做出的对比结果，确定所述受试者是否患有活动性肺结核。
8.根据权利要求6或7所述快速诊断活动性肺结核的试剂盒的使用方法，其特征在于，
收集好的EDTA抗凝的全血4小时内2000g,离心10min,取500μL血浆保存在-80℃冰箱。剩余血标本采用分离提取试剂盒分离提取全血中总RNA，并取1μL用于检测样本的浓度和纯度；
利用得到的全血总RNA作为模板，采用反转录试剂盒进行cDNA合成。
采用ELISA试剂盒，检测活动性结核病人和健康志愿者血浆中MCEMP1蛋白的含量，具体如下：
a1.将各种试剂移至室温(18-25℃)平衡至少30分钟。
a2.加样：分别设标准品孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本100μL,轻轻晃动混匀，覆上板贴，37℃温育2小时。
a3.弃去液体，甩干，不用洗涤。
a4.每孔加生物素标记抗体工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
a5.弃去孔内液体，甩干，洗板3次。每次浸泡2分钟，200μL/孔，甩干。
a6.每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液100μL，覆上新的板贴，37℃温育1小时。
a7.弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每次浸泡2分钟，200μL/孔，甩干。
a8.依序每孔加底物溶液90μL，37℃避光显色15-30分钟。
a9.依序每孔终止溶液50μL，终止反应。
a10.在反应终止后5分钟内用酶标仪在450nm波长依序测量各孔的OD值。
9.根据权利要求6或7所述快速诊断活动性肺结核的试剂盒的使用方法，其特征在于，使用扩增、杂交、和/或测序的方法检测所述MCEMP1的mRNA水平，包括：聚合酶链式反应、实时聚合酶链式反应、定量聚合酶链式反应、滚环扩增等、杂交阵列、NanoString分析、RNA印迹分析、支链DNA(bDNA)信号放大、原位杂交等和下一代测序方法以及包括核糖核酸酶保护测定和质谱法。
10.一种活动性结核病诊断标志物的应用，其特征在于，所述生物标志物指示活动性肺结核。
Priority Applications (1)
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