CN112094268A - 化合物wez系列及其制备方法和制备药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开化合物WEZ系列及其制备方法和制备药物的用途，化合物WEZ系列为式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所示化合物，以上化合物或其药学上可接受的盐可应用于制备预防和/或治疗多种免疫异常性疾病的药物
Figure DEST_PATH_IMAGE002
。

Description

化合物WEZ系列及其制备方法和制备药物的用途
技术领域
本发明属于化学药物领域，具体涉及式I、Ⅱ、Ⅲ结构的化合物WEZ系列或其药学上可接受的盐及其制备方法和制备药物的用途。
背景技术
NK/T细胞淋巴瘤是我国常见的非霍奇金淋巴瘤，近年来发病率呈增高趋势。免疫因素在发病机制中起重要作用，具有自身免疫性疾病（如红斑狼疮、皮肌炎、干燥综合征、结节病）的患者淋巴瘤的患病风险增加。该病治疗困难，预后差。传统治疗侵袭性非霍奇金淋巴瘤的CHOP方案用于NK/T细胞淋巴瘤治疗的效果较差，即使能够获得短暂缓解、随后的复发率也较高，目前临床上仍缺乏有效的治疗NK/T细胞淋巴瘤的手段。
免疫性疾病发病率高，全世界至少有数亿患者，其中包括类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克隆恩病、溃疡性结肠炎、干燥综合征、银屑病（包括寻常型、脓疱型、红皮病型和关节病型）、湿疹（又名特应性皮炎、异位性皮炎、异位性湿疹）、脂溢性皮炎等；这些疾病严重时可以累及多器官，导致心、肝、肾、血管、肺、关节和脑等器官损伤，死亡率高。该类疾病的病因和发病机制相当复杂，反复发作，目前仍无法根治，需要长期治疗控制病情进展。临床常用的治疗药物主要是糖皮质激素和免疫抑制剂等，但是这类药物的治疗有效率不足50%，并且不良反应大，包括骨髓抑制、肝肾功能损伤、骨质疏松、易诱发感染和肿瘤等。新型生物制剂也具有免疫抑制作用，有诱发感染和肿瘤的风险，而且价格昂贵，限制了其广泛长期应用。他克莫司软膏是目前外用治疗湿疹的非糖皮质激素金标准药，其中0.1%普特彼疗效最佳，不良反应有局部刺激，长期应用有诱发肿瘤风险。
已有的研究已经证实，许多炎症免疫性疾病（比如类风湿性关节炎、银屑病）的发病机制与心血管疾病密切相关，伴发高血脂、高血压和心脏病的风险高。心血管疾病包括高脂血症、高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症代谢综合征、动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉疾病等，对身体危害大，严重时危及生命。
白癜风是一种常见的后天性限局性或泛发性皮肤色素脱失病，全世界白癜风患病率为1% ~2%。由黑素细胞受损而引起皮肤或者黏膜的色素脱失，以出现褪色的白斑为主要特征，病因和发病机制尚不清楚。全身各部位可发生，常见于指背、腕、前臂、颜面、颈项及生殖器周围等。治疗较困难，临床上常用的治疗药物是补骨脂类药物，此类药物外用易引起局部刺激和光敏，口服易损伤肝脏。
痤疮（俗称青春豆）是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，发病率约9.4%，已成为世界第8大流行性疾病。于青春期多见，痤疮的产生与青春期皮肤的生理病理变化密切相关。临床表现主要有粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等，愈合时间长，给患者的容貌和心理带来严重的影响。痤疮与多个发病机制相关，毛囊口角化异常是本病发病的重要基础，炎症和感染是痤疮的发病因素。痤疮患者的皮脂腺较大，皮脂腺分泌增加，皮脂中亚油酸水平相对减少，影响脂肪的合成，导致滤泡上皮缺乏脂肪酸，从而诱导滤泡过度角化，使上皮细胞不能正常脱落，毛囊皮脂腺口过度变小，皮脂不能顺畅排出，形成粉刺。毛囊皮脂腺口被堵塞而形成毛囊皮脂腺内缺氧的环境，造成厌氧性的痤疮丙酸杆菌大量繁殖，分解皮脂，产生化学趋化因子，白细胞聚集形成丘疹。毛囊皮脂腺内的大量中性粒细胞聚集，吞咽痤疮丙酸杆菌后发生炎症反应，使得大量脓细胞堆积而形成脓疱、囊肿，愈后易形成凹陷性疤痕。当面部、额部、颊部、下颌部、胸部、背部及肩部出现大小不等的结节、囊肿，常继发化脓感染，破溃后常流出带血的胶冻状脓液，以后形成窦道。雄激素水平升高是加速痤疮产生的关键环节，使皮肤角化异常堵塞毛囊皮脂腺导管，导致细菌滞留、繁殖，产生炎症。与痤疮具有类似角化异常机制的疾病包括鱼鳞病、毛周角化病（又名毛发苔藓）、毛囊角化病和汗孔角化症等，毛周角化病见毛囊口扩大，内有角栓，鱼鳞病表现为汗腺和皮脂腺减少，毛囊内出现角质性栓塞。目前临床上消除角栓和粉刺的药物主要是维甲酸类药物。维甲酸类药物可抑制角化，减少皮脂分泌，促进角质形成细胞的正常角化，并具有调节免疫和抗炎作用，从而减少粉刺、丘疹和脓疱的形成。但维甲酸类药物外用对皮肤有刺激，容易导致红肿、刺痛，加重原有皮损，长期外用维甲酸类药物可导致皮肤变薄，光敏和皮肤屏障受损等，而口服维甲酸类药物有肝损和血脂升高等不良反应。
肺纤维化（pulmonary fibrosis）是一种病因未明、发病机制复杂的弥漫性肺部疾病，目前公认是肺损伤后过度修复导致细胞外基质过度沉积的结果。肺纤维化的发病机制不明，目前公认为肺泡上皮反复损伤与过度修复是发病的关键。病理特点是长期慢性肺部炎症及肺泡持续性损伤导致细胞外基质金属蛋白酶（MMP）聚集，特别是MMP-2、MMP-9异常增多，金属蛋白酶组织抑制剂-1（TIMP-1）降低，使其平衡关系破坏，导致肺大量细胞外基质聚集，组织细胞重构和胶原过度沉积。同时可能抑制组织中VEGF表达，降低肺微小静脉血管的通透性，抑制血管内皮细胞分裂增殖及血管再生，加重肺组织损伤，并最终导致弥漫性肺间质疾病肺纤维化。目前无有效的抗纤维化药物，常用糖皮质激素抗炎以降低抗纤维化进程，但疗效有限，不良反应多。
对于上述疾病，目前的治疗方法远不能满足临床需求，需要寻找更多疗效好、副作用少、价格便宜的新药来控制疾病进展，减少复发和并发症，降低死亡率。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有药用价值的具有式I、Ⅱ、Ⅲ结构的化合物WEZ系列和其药学上可接受的盐。
本发明的另一目的在于提供上述化合物的制备方法。
本发明的进一步的目的在于提供上述化合物的用途。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
本发明提供具有式I、Ⅱ、Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure 967879DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1、R2、R3独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、甲氧基、氨甲基；
R4独立地选自氢、甲基、乙基、羧基、羟基；
R5是
Figure 678346DEST_PATH_IMAGE002
；
其中R6和R8各自独立地是H、甲基、卤素或（C1-C4）烷基，条件是R6和R8不同时为卤素。
在一些优选的实施方案中，R1优选为氯，R2和R3优选为氢。
在一些优选的实施方案中，R4优选为氢。
在一些优选的实施方案中，R5优选为
Figure 219049DEST_PATH_IMAGE003
。
在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供化合物WEZ系列，包括具有式Ⅳ（简称WEZ-4）、式Ⅴ（简称WEZ-5）、式Ⅵ（简称WEZ-6）结构的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure 935289DEST_PATH_IMAGE004
。
本发明还提供式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物WEZ系列的制备方法：
(S)-2-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯和2-溴-3-氯吡啶反应得到(S)-2-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(S)-2-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(R)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-2-基)苯甲酰胺（式IV）。
(S)-3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯和2-溴-3-氯吡啶反应得到(S)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(S)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(S)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺（式V）
(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷和2-溴-3-氯吡啶反应得到(R)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(R)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺（式Ⅵ）。
本发明还提供一种具体的式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物的制备方法的具体步骤：
（1）(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷和2-溴-3-氯吡啶反应得到ETH：(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷和2-溴-3-氯吡啶加入碱，氮气保护下加入催化剂，80～120℃，反应5～9小时，生成ETH-1，类似地可以合成ETH-2，ETH-3；
（2）ETH-1与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸反应合成(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯：4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸在溶剂中，加入草酰氯和催化剂N,N-二甲基甲酰胺，在25～55℃反应至澄清，减压回收溶剂后，残留物加入有机溶剂，加入(R)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，置冰水浴降温至5℃以下，加入双(三甲基硅基)胺基锂，得到(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，类似地可以得到(S)-2-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，(S)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯；
（3）(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯脱保护得到式Ⅵ（WEZ-6）：(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯加入二氯甲烷和盐酸甲醇溶液，搅拌过夜，倒入水中，加碳酸氢钠调节pH为10～11，用二氯甲烷萃取洗涤后，减压回收溶剂，得到膏状残留，经硅胶柱层析得到式Ⅵ，类似地可以得到式IV和式V。
在一些实施例中，本发明步骤（1）中反应溶剂选自C5～C6一元醇、甲苯、二氧六环、四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种，优选为二氧六环。
在一些实施例中，本发明步骤（1）中所用的碱选自碳酸盐、醇钠、磷酸钾、磷酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾或双(三甲基硅基)胺基锂中的一种或几种，优选为叔丁醇钠或碳酸铯。
在一些实施例中，本发明步骤（1）中所用催化剂选自钯盐、钯络合物或膦配体中的一种或几种；包括但不限于乙酸钯、RuPhosPd G3、1，1‘-联-2-萘酚、三（二甲氨基）膦、RuPhos等。
在一些实施例中，本发明步骤（2）中的溶剂选自甲苯、N,N-二甲基甲酰胺。
在一些实施例中，本发明步骤（2）中有机溶剂为非质子溶剂，优选为二氯甲烷或四氢呋喃。
本发明还提供一种药物组合物，以本发明式I、II、Ⅲ或式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体组成。
本发明还提供式I、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物辅以药学上可接受的盐形成的药物组合物在制备治疗和/或预防疾病药物中的应用。
在一些具体的实施例中，所述的疾病包括但不限于为淋巴瘤，以及其它淋巴系统异常性疾病。
在一些具体的实施例中，所述的疾病为类风湿性关节炎，以及其它类似免疫异常性疾病，包括但不限于强直性脊柱炎、克隆恩病、溃疡性结肠炎等。
在一些具体的实施例中，所述的疾病包括但不限于银屑病、湿疹、异位性皮炎，以及其它类似炎症性皮肤病，包括玫瑰糠疹、副银屑病、脂溢性皮炎、糖皮质激素依赖性皮炎等。
在一些具体的实施例中，所述的疾病包括但不限于高脂血症、高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症代谢综合征、动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉疾病等心血管疾病。
在一些具体的实施例中，所述的疾病为包括但不限于白癜风，以及其它黑色素细胞较少性疾病。
在一些具体的实施例中，所述的疾病包括但不限于痤疮，以及其它类似角化异常性疾病，包括鱼鳞病、毛周角化症、毛发苔藓、毛囊角化病或汗孔角化症等。
本发明所述的式I、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物或其药学上可接受的盐或组合物可制备为药学上允许的任何剂型，例如为适于口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内任意给药方式的制剂。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的剂型为膏剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂或注射剂。
说明书中的定义：
“C5～C6一元醇”表示被一个羟基取代的含有5或6个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团。
这里所采用的术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的盐，由本发明发现的具有特定取代基的化合物与相对无毒的酸或碱制备。当本发明的化合物中含有相对酸性的功能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的碱与这类化合物的中性形式接触的方式获得碱加成盐。药学上可接受的碱加成盐包括钠、钾、钙、铵、有机氨或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物中含有相对碱性的官能团时，可以通过在纯的溶液或合适的惰性溶剂中用足够量的酸与这类化合物的中性形式接触的方式获得酸加成盐。药学上可接受的酸加成盐的实例包括无机酸盐，所述无机酸包括例如盐酸、氢溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氢根，磷酸、磷酸一氢根、磷酸二氢根、硫酸、硫酸氢根、氢碘酸、亚磷酸等；以及有机酸盐，所述有机酸包括如乙酸、丙酸、异丁酸、马来酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、柠檬酸、酒石酸和甲磺酸等类似的酸；还包括氨基酸（如精氨酸等）的盐，以及如葡糖醛酸等有机酸的盐（参见Berge et al.，"PharmaceuticalSalts"，Journal of Pharmaceutical Science 66：1-19（1977））。本发明的某些特定的化合物含有碱性和酸性的官能团，从而可以被转换成任一碱或酸加成盐。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式或者溶剂化形式存在，包括水合物形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化的形式相当，都包含在本发明的范围之内。
本发明的某些化合物可以具有不对称碳原子（光学中心）或双键。外消旋体、非对映异构体、几何异构体和单个的异构体都包括在本发明的范围之内。
除非另有说明，用楔形实线键和楔形虚线键表示一个立体中心的绝对构型，用波浪线表示楔形实线键或楔形虚线键，用直形实线键和直形虚线键表示立体中心的相对构型。当本文所述化合物含有烯属双键或其它几何不对称中心，除非另有规定，它们包括E、Z几何异构体。同样地，所有的互变异构形式均包括在本发明的范围之内。
术语“药学上可接受的载体”是指能够递送本发明有效量活性物质、不干扰活性物质的生物活性并且对宿主或者患者无毒副作用的任何制剂载体或介质，代表性的载体包括水、油、蔬菜和矿物质、膏剂、洗剂基质、软膏基质等。这些基质包括悬浮剂、增粘剂、透皮促进剂等。它们的制剂为化妆品领域或局部药物领域的技术人员所周知。关于载体的其他信息，可以参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy，21st Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins（2005），该文献的内容通过引用的方式并入本文。
术语“赋形剂”通常是指配制有效的药物组合物所需要载体、稀释剂和/或介质。
针对药物或药理学活性剂而言，术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。对于本发明中的口服剂型，组合物中一种活性物质的“有效量”是指与该组合物中另一种活性物质联用时为了达到预期效果所需要的用量。有效量的确定因人而异，取决于受体的年龄和一般情况，也取决于具体的活性物质，个案中合适的有效量可以由本领域技术人员根据常规试验确定。
术语“活性成分”、“治疗剂”，“活性物质”或“活性剂”是指一种化学实体，它可以有效地治疗目标紊乱、疾病或病症。
“任选”或“任选地”指的是随后描述的事件或状况可能但不是必需出现的，并且该描述包括其中所述事件或状况发生的情况以及所述事件或状况不发生的情况。
本发明所使用的溶剂可经市售获得。化合物经手工或者ChemDraw软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。
本发明的式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物或其药学上可接受的盐可应用于制药领域，如治疗和预防疾病的药物方面。本发明通过建立相应疾病的动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物或其药学上可接受的盐可应用于治疗多种疾病。由于部分疾病目前还没有公认的动物模型用于研究，我们选取了具有成熟动物模型的代表性疾病来研究式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物在类似系列疾病中的作用。通过建立NK/T细胞淋巴瘤移植动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物治疗淋巴瘤的作用。通过建立类风湿性关节炎动物模型，发现了式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物治疗类风湿性关节炎，以及强直性脊柱炎、克隆恩病、溃疡性结肠炎等类似免疫异常性疾病中的作用和机制。通过建立银屑病和湿疹动物模型，发现了式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物在治疗银屑病、湿疹、特应性皮炎，以及玫瑰糠疹、副银屑病、糖皮质激素依赖性皮炎、脂溢性皮炎等类似炎症性皮肤病中的作用和机制。通过建立高脂血症动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物治疗高脂血症、高低密度脂蛋白（LDL）胆固醇血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉疾病等心血管疾病中的作用。通过建立白癜风动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物治疗白癜风等色素减少性疾病中的作用。通过建立痤疮动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物在治疗痤疮，以及鱼鳞病、毛周角化症、毛发苔藓、毛囊角化病、汗孔角化症等其它角化异常性疾病中的作用。通过建立大鼠肺纤维化动物模型，发现式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ所示化合物治疗肺纤维化类疾病中的作用。
由于免疫异常是许多疾病的共同发病机制和通路，该系列化合物的药效包括但不限于以上疾病。该系列化合物可以单独使用也可以联合其他药物使用，为众多免疫性疾病的治疗提供了新的药物。
附图说明
图1 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6明显减少移植淋巴瘤组织中p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达(P<0.01)。
图2 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够降低类风湿关节炎大鼠血清IL-17水平，增加血清IL-10水平(P均<0.01)。
图3 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够明显减轻小鼠银屑病样炎症反应。
图4WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗组银屑病样小鼠的红斑、鳞屑、浸润及总分（红斑+鳞屑+浸润）均明显低于模型组。
图5 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够明显抑制银屑病患者外周血CD4+T细胞分泌IL-17、IFN-γ和IL-4(P<0.01)。
图6 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够明显减轻湿疹模型小鼠耳部红斑、鳞屑和渗出。
图7WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够明显减少湿疹模型小鼠的耳厚度(P<0.01)。
图8 WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能够明显降低湿疹模型小鼠的血清IL-4水平(P<0.01)。
图9 构建高胆固醇小鼠模型。
图10 WEZ-6能降低高脂小鼠的胆固醇水平。
图11化合物WEZ-6质谱分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1制备式Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ结构的化合物的方法
1、合成线路：
Figure 536034DEST_PATH_IMAGE005
Figure 733797DEST_PATH_IMAGE006
Figure 140508DEST_PATH_IMAGE007
2、具体合成步骤：
（1）ETH-1的合成
(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷11.8克、2-溴-3-氯吡啶11.0克、叔丁醇钠10.0克，甲苯70ml加入到250ml三口瓶中，氮气保护，开启搅拌，加入0.1克乙酸钯、1，1‘-联-2-萘酚，三（二甲氨基）膦，加热至100℃，反应7小时，停止反应，倒入500ml水中，用乙酸乙酯1000ml分次萃取，合并乙酸乙酯层后，用水200*3洗涤，回收乙酸乙酯层后得到残留膏状物，用硅胶拌样，经硅胶柱层析得到ETH-1约7克。
（2）吡咯烷酰胺的合成
4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸在溶剂中，加入草酰氯和催化剂N,N-二甲基甲酰胺，在25～55℃反应至澄清，减压回收溶剂后，残留物加入溶剂，加入(R)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，置冰水浴降温至5℃以下，加入双(三甲基硅基)胺基锂，得到吡咯烷酰胺，即（R）-3-（4-（3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基）-N-（3-氯吡啶-2-基）苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯。
（3）化合物式VI的合成
吡咯烷酰胺10克，二氯甲烷50ml，4mol/L盐酸甲醇溶液10ml，室温搅拌过夜。倒入100ml水中，加碳酸氢钠调节pH=10～11，用100ml二氯甲烷萃取，洗涤后，减压回收溶剂，得到膏状残留，经硅胶柱层析得到3.2克化合物式VI，即(R)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺（简称WEZ-6），M+H=420.1（质谱检测结果见图11）。
基于本实施例类似的方法，根据前述通式，本实施例对于本领域专业人员来说，很容易得到化合物ETH-2和ETH-3，并由ETH-2和ETH-3最终合成式IV（简称WEZ-4）和式V（简称WEZ-5）。化合物式IV的氢谱：δ1.59（2H），δ2.10（2H），δ2.42（2H），δ2.93（1H），δ5.95（1H），δ6.90～8.97（10H），化合物式IV的质谱：[M+H]=420；化合物式V的氢谱：δ2.29（2H），δ2.57（1H），δ2.74（2H），δ3.31（2H），δ4.61（1H），δ6.86～8.87（10H），化合物式IV的质谱：[M+H]=420。
实施例2大鼠药代动力学性质研究
1.实验方法：
购买雄性SD大鼠36只，随机分配为3个化合物组（WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6），将每个化合物试验用的12只大鼠再随机分成两组，其中6只大鼠分别采用静脉注射给药（1mg/kg），给药后0.0833、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24h分别采血并分离出血浆，另外6只大鼠采用灌胃给药（5mg/kg），给药后0.25、0.5、1、2、4、6、8和24h分别采血并分离血浆。采用LC/MS/MS法测定每种化合物在血浆中的浓度，并用Phocnix WinNonlin 6.2.1软件计算相关药代动力学参数，计算其在雄性SD大鼠中的生物利用度，评价每种化合物的药代动力学性质。
2.实验结果
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6在雄性SD大鼠中生物利用度分别为52.3%、76.5%和85.9%，说明化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6具有良好的药代动力学性质，其中WEZ-6具有的药代动力学性质最优。
实施例3、化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对NK/T细胞淋巴瘤的影响
1、实验方法
（1）细胞培养及分组：购买NK/T细胞淋巴瘤细胞株YTS细胞，用含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养基贴壁培养，细胞铺满90%后用胰蛋白酶进行消化和传代，传代后的细胞继续扩增培养，得到足够数量的细胞后进行分组。对照组用不含药物的DMEM处理，WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗组分别用含有不同浓度（10µM、20µM、30µM）的DMEM处理，连续处理24小时。
（2）动物分组与造模
动物分组：选取SPF级的雄性C57小鼠(18～20)g，饲养环境温度(18～23)℃、适度45%～55%、自由饮水摄食。随机分为对照组和WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组，每组各6只。
造模：取传代的YTS细胞、制备浓度为5×10 7个/mL的细胞悬液，将0.2 mL细胞悬液接种在右侧腋窝皮下，7天后扪及米粒大小的肿瘤，提示移植瘤小鼠制备成功。皮下注射YTS细胞后d 7、9、12、15、19、25时，治疗组分别给予WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6（8mg/kg）瘤内注射，对照组瘤内注射生理盐水。第35天时处死、解剖移植瘤并称重，而后将移植瘤用液氮冷冻，-80℃保存。
（3）观察指标及测试方法
细胞活力检测：在96孔板内接种YTS细胞，按照分组及给药方法对各组进行处理，处理24 h后，向每个培养孔内加入20µl MTS试剂盒的检测液，培养箱中继续孵育4 h后取出培养板，震荡后在酶标仪上测定570 nm波长的吸光值、记为OD570。
细胞周期检测：在6孔板内接种YTS细胞，按照分组及给药方法分对各组进行处理，处理24 h后，用70%乙醇固定细胞过夜，第二天用50 mg/L的碘化丙啶、0.1%Triton X-100避光孵育细胞30 min，最后在流式细胞仪上检测细胞周期。
细胞凋亡检测：按照上诉方法收集细胞并固定过夜，用Annexin V/PI凋亡试剂盒中的检测液避光孵育15 min，在流式细胞仪上检测细胞凋亡率。
Western blot检测：取肿瘤组织并加入RIPA裂解液提取蛋白，在SDS-PAGE凝胶中进行电泳、电转移至NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入1:1 000稀释的p-JAK2、JAK2、p-STAT3、STAT3一抗或1:5 000稀释的β-actin一抗，4℃孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶标记的二抗并在室温孵育1 h，洗膜后加入显影液、在化学显影仪中曝光得到蛋白条带，用ImageJ软件扫描条带灰度值，以β-actin为内参、计算蛋白表达水平。
2、实验结果
（1）WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对YTS细胞活力、细胞周期及细胞凋亡的影响
培养YTS细胞并用不同浓度的WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6分别进行干预，研究WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6抗NK/T细胞淋巴瘤活性。与对照组比较，10µM浓度和20µM浓度WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6干预后的细胞活力OD570值无显著变化(P>0.05)，30µM浓度WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6干预后的细胞活力OD570值显著减低(P<0.05)，说明30µM浓度能够抑制YTS细胞的生长，后续选用30µM浓度WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6继续进行实验。30µM WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6分别干预后，如表1所示，YTS细胞中G0/G1期比例以及凋亡率显著升高(P<0.01)，S期比例显著降低(P<0.01)，G2/M期比例无显著变化(P>0.05)。
表1各组对YTS细胞活力、细胞周期及细胞凋亡的影响
Figure 107327DEST_PATH_IMAGE008
*与对照组比较有显著差异(P<0.01)
（2）WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对YTS细胞移植淋巴瘤生长及JAK2/STAT3通路的影响
经细胞实验明确WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6通过JAK2/STAT3通路调节YTS细胞的细胞活力、细胞周期及细胞凋亡后，本实验通过YTS细胞移植瘤动物模型验证WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6的抗NK/T细胞淋巴瘤活性。建立YTS细胞移植瘤小鼠模型后分别给予WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6干预，如表2所示，移植瘤体质量明显减轻(P<0.01)，移植瘤组织中p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达明显减少(P<0.01)（图1）。
表2各组对YTS细胞体质量及p-JAK2和p-STAT3蛋白表达的影响
Figure 223182DEST_PATH_IMAGE009
*与对照组比较有显著差异(P<0.01)
3、实验结论：
结果显示：化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能够使淋巴瘤YTS细胞的细胞周期停滞、促进YTS细胞的凋亡，通过JAK2/STAT3通路抑制淋巴瘤YTS细胞移植瘤生长。
实施例4、化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对类风湿关节炎（RA）鼠的关节症状和炎症指标的影响
1、实验材料与方法
（1）实验材料
弗氏完全佐剂（Freund＇s Adjuvant Complete，FCA，购于美国Sigma公司）；IL-10ELISA试剂盒（联科生物技术有限公司）；IL-17 ELISA试剂盒（美国Raybiotech公司）。
（2）实验动物分组及处理
5周龄雌性Wistar大鼠，将动物随机分为对照组、RA模型组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组，每组6只。对照组：用75%酒精对大鼠右足趾进行消毒，将0.15ml生理盐水注射于大鼠右足跖皮下。RA模型组：于实验开始第一天每只大鼠进行常规消毒，将FCA0.15ml注射于大鼠右足跖皮下。治疗组：于实验开始后第一天，每只大鼠进行常规消毒，将FCA 0.15mL注射于大鼠右足跖皮下，7天后开始给予药物干预，分别用含赋形剂的WEZ-4（5mg/kg）、WEZ-5（5mg/kg）、WEZ-6（5mg/kg）灌胃，每天两次，连续21天。
WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗干预后第21天对大鼠进行心脏采血3ml，分离血清，ELISA法检测大鼠血清中IL-10、IL-17的水平，按照试剂盒说明书操作。
（3）观察指标
WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6分别干预第21天后，对每组大鼠进行关节炎评分，测量每组大鼠右足趾的关节肿胀度。根据RA大鼠的炎症反应对踝关节的严重程度按0~4级进行评分0分，正常；1分，踝关节有微红及轻微肿胀；2分，踝关节至跖关节或掌关节有红斑及轻微肿胀；3分，踝关节至掌关节或跖趾关节有红斑及中度肿胀；4分，踝关节至趾关节严重红肿。将每只大鼠的四肢评分相加作为关节炎评分，最高分为16分。
（4）数据处理及统计学分析
采用SPSS16统计软件处理数据，采用方差分析对多组计量资料的均数进行比较，数据用（x ± s）表示。检验水准取双侧α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。
2、实验结果
（1）大鼠一般表现
RA模型组大鼠与对照组相比，食欲减退、精神萎靡，活动受限，左右足趾逐渐肿胀。WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6干预21天后均较其他组有所好转。
（2）大鼠的体质量、关节肿胀度和关节炎评分
如表3所示，WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6干预21天后，治疗组体质量高于RA模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；RA模型组右足趾关节肿胀度及关节炎评分高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗组关节肿胀度和关节炎评分均低于RA模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。
表3各组大鼠关节炎指标比较
Figure 439399DEST_PATH_IMAGE010
注：*与RA模型组比较P＜0.05
（3）各组大鼠血清中IL-10、IL-17水平比较
如表4所示，对照组和WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗组大鼠血清中 IL-10含量高于RA模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6治疗组大鼠血清中IL-17水平低于RA模型组，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图2）。
表4各组大鼠血清IL-10和IL-17水平比较
Figure 790746DEST_PATH_IMAGE011
注：*与RA模型组比较P＜0.05
3、实验结论：
结果显示：WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6能改善类风湿关节炎（RA）小鼠的关节症状和炎症指标。
实施例5化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6抑制小鼠银屑病样炎症反应
1、材料：
阳性药（糖皮质激素药）：糠酸莫米松乳膏（艾洛松），上海先灵葆雅制药有限公司产品。
动物：SPF级健康纯系雌性小鼠(C57BL/6)；8周龄（18-23g），来源于上海斯莱克实验动物技术有限公司。
0.5%WEZ-4、0.5%WEZ-5、0.5%WEZ-6乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油 (15%)、硬脂酸 (6%)、白凡士林 (5%)、液体石蜡 (5%)、十八醇 (5%)、甘油 (20%)、烷基芳基聚乙醇醚 (1%)、脂肪醇聚氧乙烯醚 (1%)、吐温-807 (1%)、尼泊金乙酯 (0.1%)、蒸馏水 (约31-55%)，分别与适量的WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6液形成0.5%浓度的混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6的基质成分。
2、实验方法：
（1）C57BL/6小鼠随机分为空白对照组（外用乳膏基质）、模型组（外用乳膏基质）、阳性对照组（外用艾洛松乳膏）、WEZ-4治疗组（外用0.5%WEZ-4乳膏）、WEZ-5治疗组（外用0.5%WEZ-5乳膏）、WEZ-6治疗组（外用0.5%WEZ-6乳膏），每组各5只。戊巴比妥钠 80 mg /kg腹腔注射麻醉后，背部剃毛，面积约为2cm×3cm，单笼饲养1天。
（2）空白对照组局部涂抹凡士林，模型组、阳性对照组和治疗组背部每日定时涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5mg，连续6天，每天拍照，进行PASI评分。
（3）从造模第1天开始，空白对照组和模型组外用乳膏基质，每天2次，治疗组分别外用0.5%WEZ-4、0.5%WEZ-5、0.5%WEZ-6乳膏，阳性对照组外用艾洛松乳膏，每天2次。
3、实验结果：
（1）如图3所示，连续涂抹5%咪喹莫特乳膏6天后，模型组小鼠的背部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及浸润，而各治疗组小鼠的背部涂药区域的红斑、鳞屑及浸润均明显比模型组轻微， WEZ-6治疗组的红斑、鳞屑及浸润接近阳性对照组。
（2）每天对小鼠背部涂药区域皮损进行评分，结果如图4所示，模型组小鼠的红斑、鳞屑、浸润及总分（红斑+鳞屑+浸润）均明显高于各治疗组（P均<0.05），其中WEZ-6治疗组与阳性对照组比较无显著差异（P＞0.05）
4、实验结论：
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能够明显抑制银屑病样小鼠模型的炎症反应，WEZ-6治疗效果与糖皮质激素药相当。
实施例6化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对银屑病患者外周血CD4+T细胞分泌炎症细胞因子的影响
1、实验材料：
活动期银屑病患者10例，10例正常人作为对照，ELISA试剂盒均购自美国Raybiotech公司。
2、实验方法：
（1）外周血CD4+T细胞的分离：
分别采集活动期银屑病患者以及正常人外周血10ml，Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离出外周血单一核细胞（PBMC），加入10倍体积 1xBD磁珠缓冲液洗涤，然后每107细胞加入50µl BD IMag TM CD4+磁珠，充分混匀，室温孵育30分钟后，加入1ml 1xBD磁珠缓冲液，将细胞转移至圆底检测管中，置于磁力架8-10 min。之后弃上清，将检测管移出磁场，用1ml1xBD磁珠缓冲液重悬附于管壁的细胞后，重新置入磁场2-4min，弃上清，移出磁场，再次重悬后置入磁场2-4min，弃上清后所得细胞可用于后续实验。实验所用BD IMag TM CD4+分离系统购于美国BD Biosciences公司。
（2）外周血CD4+T细胞分泌细胞因子的测定
分别加入化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6进行细胞培养后收集上清液，其中以IFN-γ代表TH1型细胞因子，以IL-4代表TH2型细胞因子，以IL-17代表TH17 型细胞因子，采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测上清液中IFN-γ，IL-4，IL-17水平。
3、实验结果：
（1）化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6分别作用银屑病患者外周血CD4+T细胞前IL-17含量分别为765±78pg/ml 、756±71pg/ml 、768±83pg/ml，作用后IL-17含量分别为292±29pg/ml、273±31pg/ml、265±21pg/ml；作用前IFN-γ含量分别为4859±76pg/ml、4852±79pg/ml、4867±83pg/ml，作用后IFN-γ含量分别为2145±38pg/ml 、1686±28pg/ml 、1638±34pg/ml；作用前IL-4含量分别为117±19pg/ml、124±25pg/ml、121±23pg/ml，作用后IL-4含量分别为83±19pg/ml 、72±18pg/ml 、63±16pg/ml。WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6作用后IL-17、IFN-γ和IL-4均显著下调（P均<0.01）（图5）。
（2）WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6作用正常人外周血CD4+T细胞前后IL-17、IFN-γ和IL-4含量均无明显变化（P均＞0.05）。
4、实验结论：
结果显示化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能够显著抑制银屑病患者外周血CD4+T细胞分泌IL-17、IFN-γ和IL-4。
实施例7化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对小鼠湿疹模型的影响
1、实验材料：
卵清蛋白（OVA）：PBS配成20 g/L，保存于-20℃。
卡泊三醇搽剂（达力士搽剂）：丹麦利奥制药有限公司产品。
阳性药：0.1%他克莫司（普特彼），美国Fujisawa Healthcare,Inc.。
0.1%WEZ-4、0.1%WEZ-5、0.1%WEZ-6乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油 (15%)、硬脂酸 (6%)、白凡士林 (5%)、液体石蜡 (5%)、十八醇 (5%)、甘油 (20%)、烷基芳基聚乙醇醚 (1%)、脂肪醇聚氧乙烯醚 (1%)、吐温-807 (1%)、尼泊金乙酯 (0.1%)、蒸馏水 (约31-55%)，分别与适量的WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6液形成0.1%浓度的混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6的基质成分。
动物：SPF级健康纯系雌性小鼠(C57BL/6)；8周龄（19-22g）。
2、实验方法：
购SPF级C57BL/6小鼠，随机分为空白对照组、模型组、阳性药组、WEZ-4治疗组（外用0.1% WEZ-4乳膏）、WEZ-5治疗组（外用0.1% WEZ-5乳膏）、WEZ-6治疗组（外用0.1% WEZ-6乳膏），每组6只。
造模：正常对照组小鼠两侧耳部涂抹75%乙醇14.3µl，同时模型组、阳性药组和各治疗组每日定时先在两侧耳部涂抹1 nmoI/L卡泊三醇搽剂14.3µl，风干后涂抹20 g/L的OVA 25µl，每日1次，连续涂抹12 d造模。
造模开始后4天起，在空白对照组和模型组小鼠耳部皮肤上涂抹治疗组的乳膏基质，阳性药组小鼠耳部皮肤上涂抹0.1%他克莫司，治疗组小鼠耳部皮肤上分别涂抹WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6（浓度均为0.1%），每天2次，连续10天，每天拍照，进行评分。
分别在造模前和第14天用耳厚度测量仪测量记录小鼠耳廓厚度。于第14天测量完毕后脱颈处死小鼠，取血，分离血清。
用兔抗小鼠白介素（IL）-4抗体包被酶标板，4℃过夜，按照ELISA试剂盒说明书操作染色并终止反应，检测血清IL-4水平。ELISA试剂盒均购自美国Raybiotech公司。
3、实验结果：
（1）如图6所示，连续造模9天后，模型组小鼠的耳部涂药区域均出现明显红斑、鳞屑及渗出，而治疗组小鼠的耳部涂药区域的红斑、鳞屑及渗出均明显比模型组轻微，WEZ-5、WEZ-6乳膏治疗组的红斑、鳞屑及渗出较阳性药治疗组轻微。
（2）小鼠耳厚度比较：造模前，6组间耳厚度差异无统计学意义(P＞0.05)。造模后，模型组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组、阳性药组和空白对照组耳厚度分别为(0.381±0.048)mm，(0.268±0.036)mm，(0.256±0.029)mm，(0.243±0.026)mm，(0.276±0.023)mm，(0.218±0.006)mm（图7）。模型组显著高于化合物治疗组、阳性药组和空白对照组（P均＜0.01），阳性药组与化合物各治疗组间差异无统计学意义（P均＞0.05）。
（3）血清IL-4浓度：造模前，6组间血清IL-4浓度差异无统计学意义（P＞0.05）。造模后，模型组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组、阳性药组和空白对照组血清IL-4浓度分别为(9.43±0.69)pg/ml，(6.34±0.32)pg/ml，(5.72±0.28)pg/ml，(5.36±0.21)pg/ml，(6.42±0.22)pg/ml，(5.03±0.08)pg/ml（图8）。模型组显著高于各化合物治疗组、阳性药组和空白对照组（P均＜0.01），阳性药组与各治疗组比较无显著差异（P均＞0.05）。
4、实验结论：
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能够明显抑制湿疹小鼠模型的炎症反应，降低血清IL-4浓度，治疗效果接近非糖皮质激素金标准药0.1%他克莫司软膏。
实施例8、WEZ-6能降低高脂小鼠的胆固醇水平
1、实验方法和结果：
（1）购SPF级C57BL/6小鼠6周龄18只，随机分2组，每组9只，分别使用普通饲料和高脂饲料喂养。喂养45天后，尾静脉采血约100μL，分别检测血浆中总胆固醇TC以及低密度脂蛋白（LDL）胆固醇含量。
（2）将高血脂症小鼠分随机为两组，每组6只，阴性对照组注射生理盐水，治疗组尾静脉注射WEZ-6，注射剂量为10mg/kg，每日1次。小鼠给药后每隔3天取血测定总胆固醇含量。
2、实验结果
（1）对比高脂喂食前的实验数据，高脂饲料喂食后，小鼠的总胆固醇以及低密度脂蛋白胆固醇含量明显升高（图9），说明高脂小鼠模型构建成功。（2）与对照组相比，如图10所示WEZ-6（IFIM-1）治疗组胆固醇含量明显下降，在注射后第3-6天的时候出现最低值。结果提示WEZ-6能显著降低血浆中胆固醇水平。
实施例9化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对豚鼠白癜风模型的影响
1.实验方法
1.1 材料：
（1）0.1%WEZ-4、0.1%WEZ-5、0.1%WEZ-6乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油 (15%)、硬脂酸 (6%)、白凡士林 (5%)、液体石蜡 (5%)、十八醇 (5%)、甘油 (20%)、烷基芳基聚乙醇醚 (1%)、脂肪醇聚氧乙烯醚 (1%)、吐温-807 (1%)、尼泊金乙酯 (0.1%)、蒸馏水 (约31-55%)，分别与适量的WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6液形成0.1%浓度的混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6的基质成分。
（2）阳性治疗药：7%补骨脂乳膏（中国药科大学药物科学研究院）
（3）实验动物：SPF级黑色豚鼠，体重(250 ±21)g，雄性，来源于上海斯莱克实验动物技术有限公司。
1.2动物分组与造模
豚鼠按体重编号，采用随机排列表法分为空白对照组（外用乳膏基质）、模型对照组（外用乳膏基质）、阳性治疗组（外用7%补骨脂乳膏）、WEZ-4治疗组（外用0.1%WEZ-4乳膏）、WEZ-5治疗组（外用0.1%WEZ-5乳膏）、WEZ-6治疗组（外用0.1%WEZ-6乳膏），每组各10只。除空白对照组外，其余各组均在脱毛区涂抹5%氢醌脱色，每次0.5 mL，每天2次，空白对照组动物每天涂抹等量生理盐水。连续涂抹30 d，出现明显白斑表明模型成功。造模结束后，按照以上分组进行给药，每天一次，连续30d。
1.3 观察指标及测试方法
1.3.1组织学观察实验
给药结束后，处死豚鼠后，剪取背部给药部位的皮肤组织约3 cm × 3 cm，用于做组织病理学检查。
1.3.2白癜风动物模型表皮黑素细胞（MC）计数
将剪取的豚鼠皮肤组织置10%福尔马林中固定1 h，后流水冲洗3 ~4 min，放入含0.1%二羟基苯丙氨酸的磷酸盐缓冲液(pH7.4)中，于37 ℃静置1 h。然后换入新鲜的Dopa试剂中，37 ℃静置12h。流水冲洗，用Bouin氏液继续固定24 h。将标本取出后流水冲洗4 h后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，脱蜡至水，用苏木素-伊红对比染色。脱水，常规封固。Dopa - 氧化酶染色后，棕黑色染色为MC阳性。分别于光镜下测定每个高倍镜视野内各组MC数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中MC的平均数量。
1.3.3白癜风豚鼠模型表皮含黑素颗粒基底细胞计数
将剪取的豚鼠皮肤组织置10%福尔马林中固定，脱水，用二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水，蒸馏水洗涤数次后进行Lillie染色，用氯化铁和铁氰化钾混合液浸染15 ~20 min，再以1%醋酸水溶液分化数分钟，蒸馏水洗涤数次，然后用95%乙醇及无水乙醇迅速脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。Lillie 染色后，黑色素呈暗绿色为阳性，分别于光镜下测定各组含黑素颗粒的基底细胞数量，每个标本观察10个高倍镜视野，计算每100个表皮基底细胞中含黑素颗粒的基底细胞的平均数量。
1.3.4白癜风豚鼠模型皮肤组织酪氨酸酶活性的检查
将剪取的豚鼠皮肤组织置10%福尔马林中固定。然后脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制切片，脱蜡至水后，每张切片加过氧化酶阻断剂(3%H2O2)50µL，10 min，阻断内源性过氧化物酶活性。切片浸入0.01 mol·L-1PBS 缓冲液中，微波处理10 min。加鼠抗人酪氨酸酶单克隆抗体50µL，37℃、60 min。加Elivision 试剂50µL，37 ℃30min。然后将切片置新鲜配制的DAB - H2O2显色液中显色，蒸馏水冲洗，苏木素对比染色1 min，中性树胶固封。酪氨酸酶阳性产物定位于细胞的细胞质内，显镜下细胞内出现黄色或棕黄色颗粒、或团块状为阳性表达。用二级计分法判定结果，阳性细胞计数< 5% 为0分;5% ~25%为1分;25% ~50%为2分;50%~75% 为3分; >75%为4分。按染色强度分类:淡黄色1分;黄或深黄2分;褐或棕黄色3分。两者相加小于2分为阴性( - );2 ~3 分为阳性( + );4 ~5 分为中等阳性(2 + );6 ~7 分为强阳性(3 + )。
1.4统计学方法
实验数据采用SPSS 16.0系统软件进行统计学处理。实验数据统计变量以（x±s）表示，采用χ2检验和t检验，动物皮肤组织酪氨酸酶强度比较均用Wilcoxon秩和检验。α值取双侧，P>0.05表示差异无显著性，P<0.05表示差异有显著性，P<0.01为差异有极显著性。
2．实验结果
2.1各组对氢醌脱色所致白癜风豚鼠模型表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数的影响
经氢醌脱色后，与空白对照组比较，模型组豚鼠皮肤组织中表皮MC含量降低(P<0.01)，含黑素颗粒基底细胞计数降低(P<0.01)。各治疗组分别作用于氢醌脱色所致的白癜风豚鼠模型后，各治疗组均可提高白癜风模型动物皮肤组织中表皮MC计数(P <0.01);各治疗组均可提高白癜风豚鼠模型动物皮肤组织中含黑素颗粒基底细胞计数(P<0.01)。见表5。
表5各组对氢醌脱色所致豚鼠表皮MC、含黑素颗粒基底细胞计数的影响(n =10,x± s)
Figure 471126DEST_PATH_IMAGE012
注：*与模型对照组比较P＜0.01。
2.2各治疗组对氢醌脱色所致白癜风豚鼠模型皮肤组织酪氨酸酶强度的影响
经氢醌脱色后，模型组豚鼠皮肤组织中酪氨酸酶强度与空白对照组比较明显降低(P<0.01)。将各种治疗物质分别作用于氢醌脱色所致的白癜风豚鼠模型后，各治疗组白癜风豚鼠模型动物皮肤组织中酪氨酸酶的强度均可提高(P<0.01)。见表6
表6各组对氢醌脱色所致豚鼠皮肤组织酪氨酸酶强度的影响(n =10)
Figure 882516DEST_PATH_IMAGE014
注：*与模型对照组比较，P＜0.01。
3．实验结论
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能明显增加白癜风动物模型表皮黑素细胞（MC）和含黑素颗粒基底细胞的数量，提高皮肤组织中酪氨酸酶的强度，显示对白癜风具有治疗作用。
实施例10化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对兔耳痤疮模型的影响
1.实验方法
1.1材料
（1）0.1%WEZ-4、0.1%WEZ-5、0.1%WEZ-6乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油 (15%)、硬脂酸 (6%)、白凡士林 (5%)、液体石蜡 (5%)、十八醇 (5%)、甘油 (20%)、烷基芳基聚乙醇醚 (1%)、脂肪醇聚氧乙烯醚 (1%)、吐温-807 (1%)、尼泊金乙酯 (0.1%)、蒸馏水 (约31-55%)，分别与适量的WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6液形成0.1%浓度的混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6的基质成分。
（2）阳性治疗药：0.1%阿达帕林凝胶（商品名：达芙文，法国高德美制药公司生产）
（3）实验动物：普通级新西兰家兔，1.9~ 2.3 kg，雄性，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
1.2动物分组与造模
新西兰家兔按体重编号，采用随机排列表法分为模型组（外用乳膏基质）、阳性对照组（外用达芙文）、WEZ-4治疗组（外用0.1%WEZ-4乳膏）、WEZ-5治疗组（外用0.1%WEZ-5乳膏）、WEZ-6治疗组（外用0.1%WEZ-6乳膏），每组各10只。取兔右耳内侧脱毛处理作为观察区，所有家兔左耳内侧作为自身阴性对照，涂抹95%酒精，模型组和治疗组右耳内侧均涂2%煤焦油（Alfa Aesar中国公司，用95%酒精配制成2%的煤焦油溶液），用无菌棉签均匀涂于家兔耳内侧面耳导管开口处约2 cm×2cm 范围，每天1次，每次0.5 mL，并且用温水擦拭前次涂药部位，连续涂14 d，建立痤疮微粉刺模型。肉眼观察局部皮肤的变化，包括耳厚薄、硬度、粗糙程度和毛囊口有无黑色角栓等。末次涂18h后处死取材，使用5 mm 打孔器在涂药部位打孔取皮肤组织，10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后，进行病理组织学观察分析。
1.3观察指标
痤疮模型组织学判定分级标准：按组织学级别为3级。0级“一”为漏斗部仅有松散的角化的细胞，无粉刺生成；1级为兔耳表面皮肤发红，或毛囊漏斗部见少量致密角化物质，漏斗部不扩张“+”；2级为毛囊漏斗部见中等致密角化物质，并向皮脂腺延伸，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张“2+”；3级为毛囊内有广泛的角化物质，毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，皮肤凸起、瘢痕，部分皮脂腺发生退行变“3+”。
在显微镜下观察其组织病理改变情况，并用Biomias99图像分析系统测量一张切片上5处不同表皮的厚度，计算平均值；检测4张切片中位置相同而结构最完整的2个毛囊的面积和4个皮脂腺的直径，计算各自的平均值，然后将各组兔左、右外耳道数据相减，即得各兔的左、右耳表皮厚度差、毛囊面积差和皮脂腺直径差。
1.4统计学处理
用SPSS16软件进行统计分析。自身左右对照采用配对t检验，各组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2．实验结果
肉眼观察：涂煤焦油14 d后，所有组兔左耳皮肤柔软，其外耳道毛囊口排列整齐，未见粉刺、丘疹及脓疱等。模型对照组兔右耳涂煤焦油后耳厚度增加、变硬，表面粗燥，毛囊口有黑色角栓，形成黑头粉刺，毛囊口隆起呈丘疹状，触之较硬，部分融合成片。WEZ-4治疗组右耳表现为皮肤轻度粗燥肥厚，丘疹变平，仍可见少量黑头粉刺，毛孔稍缩小。WEZ-5治疗组表现为兔右耳大部分毛囊性丘疹消退，粉刺减少变平，毛孔缩小。WEZ-6治疗组右耳表现为皮肤变薄柔软，粉刺明显减少，毛孔明显缩小，无脱屑，基本接近正常兔耳。阳性治疗组兔右耳与左耳相比，皮肤轻度发红、干燥，有少许脱屑，可见少量毛囊角栓和粉刺。
组织切片观察：模型组左耳显示表皮较薄，可见毛囊，真皮与表皮交界清楚。模型组右耳造模后见表皮增厚，角化过度，颗粒层和棘层增厚，毛囊扩大，角栓堵塞毛囊口，并向皮脂腺延伸，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状；真皮上层毛细血管扩张，毛囊周围散在炎症细胞浸润，有少量中性粒细胞浸润；皮脂腺数量增多，皮脂腺体积增大。
各组镜下实验性粉刺组织学分级（见表7）：模型组兔右耳（实验对照）与其左耳（空白对照）比较，差异有统计学意义（P<0.05），说明兔耳痤疮模型造模成功；各治疗组兔右耳与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义（P均<0.05），说明阳性对照组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组均能改善痤疮皮损。
模型组兔右耳（实验对照）表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与其左耳（空白对照）进行比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示兔耳痤疮模型复制成功；各治疗组兔右耳表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义(P<0.05)（见表8），说明阳性对照组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组均能改善痤疮皮肤病理损害。
表7各组痤疮粉刺的组织学分级
Figure 664658DEST_PATH_IMAGE016
表8各组耳表皮厚度、毛囊面积和皮脂腺直径
Figure 554117DEST_PATH_IMAGE018
*为与模型组右耳比较P<0.05
3．实验结论
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能明显抑制煤焦油诱导的兔耳痤疮模型症状，减少毛孔堵塞和黑头粉刺形成，并对皮肤温和无刺激，显示对痤疮具有明显的治疗作用。
实施例11化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对大鼠肺纤维化模型的影响
1.实验方法
1.1 材料：
（1）试剂：博来霉素（4 mg/ 支，天津太和制药有限公司），鼠抗鼠MMP单克隆抗体（NEOMark-ers公司），鼠抗鼠TIMP-1多克隆抗体（武汉博士德公司），酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（美国R & D公司），Quantscript RT Kit 逆转录试剂盒（大连TaKaRa公司）。
（2）实验动物：SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，鼠龄51～55d，体重(181±22)g，来源于南京医科大学动物中心。
1.2动物分组与造模
大鼠按体重编号，采用随机排列表法分为空白对照组、模型组、WEZ-4治疗组、WEZ-5治疗组、WEZ-6治疗组，每组各12只，雌雄各半。各组大鼠用2%戊巴比妥钠（120 mg/kg）腹腔注射麻醉后固定于手术台上，颈部气管切开注药。对照组注入生理盐水（1.25 ml/kg），模型组及各治疗组注入5 U/mL博莱霉素溶液（5 mg/kg），于造模后一周开始，治疗组分别尾静脉注射化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6溶液，剂量均为5 mg/kg，对照组及模型组尾静脉注射等量生理盐水，每天1 次，连续14天。
1.3 观察指标及测试方法
各组动物分别于造模后和治疗14 d时经尾静脉取外周静脉血，检测外周血超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平。各组取血后分2次处死大鼠（造模后和治疗14 d，每组6只），取动物右肺组织于-4℃冰箱储存用于检测VEGF。取左侧肺组织常规石蜡包埋、切片，用免疫组织化学染色法观察大鼠肺组织中MMP亚型及TIMP-1表达。检测VEGF时，取出右肺组织进行研磨、组织匀浆，以3000 r/min高速离心，取上清液，采用ELISA法检测肺组织VEGF蛋白，应用反转录聚合酶链应法测定VEGF-mRNA表达。
1.4统计学方法
数据分析采用SPSS 16.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（x±s ）表示，比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，P <0.05 为差异有统计学意义。
2．实验结果
2.1化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对大鼠肺组织MMP的影响
对照组大鼠肺组织TIMP-1和MMP亚型均有少量表达，在造模及治疗14 d后变化不大。模型组大鼠MMP-2、MMP-9表达在造模及治疗14 d后均升高，TIMP-1均降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。治疗14 d后，化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6组的MMP-2、MMP-9表达均降低，TIMP-1表达均上调，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表9
表9 各组大鼠肺组织中TIMP-1和MMP表达的比较(n =6,x ± s)
Figure DEST_PATH_IMAGE020
注：*与模型对照组比较，P<0.05。
2.2化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对肺组织中VEGF的影响
对大鼠肺组织VEGF蛋白及VEGF-mRNA表达的影响见表10。造模及治疗14 d后，对照组大鼠肺组织VEGF蛋白及VEGF-mRNA表达无明显变化（P>0.05）；模型组VEGF蛋白、VEGF-mRNA表达明显降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。治疗14 d后，化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6组VEGF蛋白及VEGF-mRNA表达与造模后比较均增强，与模型组比较差异均有有统计学意义（P<0.05）。
表10各组肺组织中VEGF蛋白及VEGF-mRNA表达水平的比较(n =6,x ± s)
Figure DEST_PATH_IMAGE021
注：*与模型对照组比较，P<0.05。
2.3化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6对外周血中SOD、CAT酶活性的影响
对大鼠外周血SOD、CAT酶活性的影响见表11。造模及治疗14 d后，对照组大鼠外周血SOD、CAT酶活性均无明显变化（P>0.05）。模型组大鼠外周血SOD、CAT酶活性降低，与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；治疗14 d后，化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6组大鼠外周血SOD、CAT酶活性均增强，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。
表11各组外周血中SOD、CAT酶水平的比较(n =6,x ± s)
Figure DEST_PATH_IMAGE022
注：*与模型对照组比较，P<0.05。
3．实验结论
化合物WEZ-4、WEZ-5、WEZ-6均能明显增加肺纤维化小鼠模型肺组织中MMP-2、MMP-9和VEGF水平，降低TIMP-1水平；同时均可提高外周血中SOD、CAT酶水平，显示对肺纤维化具有治疗作用。

Claims (10)

1.具有式I或式Ⅱ或式Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure 358578DEST_PATH_IMAGE001
其中：
R1、R2、R3独立地选自氢、卤素、羟基、氨基、甲氧基或氨甲基；
R4独立地选自氢、甲基、乙基、羧基或羟基；
R5为
Figure 541298DEST_PATH_IMAGE002
；
其中R6和R8各自独立地选自H、甲基、卤素或（C1-C4）烷基，条件是R6和R8不同时为卤素。
2.根据权利要求1所述的具有式I或式Ⅱ或式Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具体为具有式Ⅳ或式Ⅴ或式Ⅵ结构的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure 852193DEST_PATH_IMAGE003
。
3.权利要求2所述的具有式I或式Ⅱ或式Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法：其特征在于，式Ⅳ或式Ⅴ或式Ⅵ结构的化合物制备方法如下：
(S)-2-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯和2-溴-3-氯吡啶反应得到(S)-2-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(S)-2-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(R)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-2-基)苯甲酰胺，即式Ⅳ；
(S)-3-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯和2-溴-3-氯吡啶反应得到(S)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(S)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(S)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺，即式Ⅴ；
(R)-1-叔丁氧羰基-3-氨基吡咯烷和2-溴-3-氯吡啶反应得到(R)-3-((3-氯吡啶-2-基)氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯，再与4-(3H-[1,2,3]三氮唑[4,5-b]吡啶-3-基)苯甲酸制得的酰氯反应合成(R)-3-(4-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)苯甲酰胺)吡咯烷-1-羧酸叔丁基酯，脱保护得到(R)-4-(3H- [1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-N-(3-氯吡啶-2-基)-N-(吡咯烷-3-基)苯甲酰胺，即式Ⅵ。
4.一种药物组合物，以权利要求1或2所述具有式I或式Ⅱ或式Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，辅以药学上可接受的载体。
5.权利要求1或2所述具有式I或式Ⅱ或式Ⅲ结构的化合物或其药学上可接受的盐或权利要求4所述的组合物在制备治疗和/或预防疾病药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病为NK/T细胞淋巴瘤。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病为类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、克隆恩病或溃疡性结肠炎。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病为银屑病、湿疹、白癜风、痤疮、鱼鳞病、毛周角化症、毛发苔藓、毛囊角化病、汗孔角化症、玫瑰糠疹、副银屑病、脂溢性皮炎或糖皮质激素依赖性皮炎。
9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病为高脂血症、高低密度脂蛋白胆固醇血症、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、动脉粥样硬化、冠心病或冠状动脉疾病。
10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肺纤维化。
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