JP6577581B2 - Abh抗原の発現を調節する物質を含む組成物 - Google Patents
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Description
1)試験肌細胞で発現するABH抗原の発現水準を確認する段階;
2)上記試験肌細胞に候補物質を処理する段階;
3)上記2)段階の細胞でABH抗原の発現水準を確認する段階;及び
4)上記1)段階と3)段階の結果を比較してABH抗原の発現を増加させる物質であるか否かを決める段階;
を含む。
多様な種類の化合物がABH抗原の発現に及ぶす影響を実験した。このために、HaCaT細胞(provided by Prof.Dr.N.E.Fusenig、DKFZ Heidelberg、Germany)を35mmディッシュで10%FBS‐DMEMで24時間培養した後、24時間0%FBS‐DMEMで培養して飢餓状態にした。再び0%FBS‐DMEMに培地を取り替えながら試験物質として多様な種類の化合物をそれぞれ2μg/mlの濃度でHaCaT細胞に処理した後、48時間培養した。この時、比較のために対照群はDMSOを試料と同じ濃度で処理した。試験物質の中でABH抗原の発現を有意的に増加させる3つの物質、即ち1,3‐ジカフェオイルキナ酸(1,3‐dicaffeoylquinic acid)、1,5‐ジカフェオイルキナ酸(1,5‐dicaffeoylquinic acid)及びアメントフラボン(amentoflavon)を確認した(データは提示しない)。これら3つの化合物を処理した場合において、細胞でタンパク質を抽出して細胞溶解物を等量にローディングしてウェスタンブロットでB型抗原の発現を調査した。対照群としてはα‐チューブリンタンパク質を用いた。測定結果は図2に示した。
5α‐レダクターゼ活性抑制効果を確認するために、HEK293‐5αR2細胞で[14C]テストステロンが[14C]ジヒドロテストステロンに変換される割合を測定した。HEK293細胞はp3xFLAG‐CMV‐5αR2を形質感染(transfection)させて、24ウェルプレートにウェル当たりに形質感染させた 2.5×105 HEK293細胞で入れて培養した(Park et al.,2003、JDS.Vol.31、pp191‐98)。翌日、酵素基質及び阻害剤が添加された新しい培地に交換した。培地の基質としては、0.05μCi[14C]テストステロン(Amersham Pharmacia biotech、UK)を用いた。阻害程度を確認するために、試験物質として1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンをそれぞれ2μg/ml入れて37℃で、5%CO2培養器で2時間培養した。この時、比較のために、陰性対照群としては上記試験物質の中で何も含有しないものを用い、陽性対照群としてはフィナステリド(Finasteride)を培地に2μg/ml入れて同一条件で培養したものを用いた。培養培地を回収してテストステロンを800μl酢酸エチルで抽出した。上部の有機溶媒層を分離して乾かした後、残った残渣を再び50μl酢酸エチルで溶かしてシリカプラスチックシートカイゼルゲル60F 254(Silica plastic sheet kieselgel F254)上において酢酸エチルヘキサン(1:1)を展開溶媒として展開した。
下記の表2に記載した組成によってローション剤形の実施例1〜3及び比較例1を通常の製造方法で製造した(単位:重量%)。
1)上記11〜14成分を70℃まで加熱しながら均一に混合して水相パートを製造した。
2)上記1〜10成分を70℃まで加熱しながら均一に混合して油相パートを製造した。
3)上記1)の水相パートに上記2)の油相パートを投入し、7,200rpmで6分間ホモミキシングした。
4)上記3)の混合物を室温まで冷却した。
上記実施例1〜3及び比較例1の皮脂分泌抑制効果を調べるために次のように評価した。皮脂の分泌が多いと感じる被験者男女40名を選定して10名ずつ4つの群に分け、各群に対して実施例1〜3及び比較例1のローションをそれぞれ指定された部位に4週間毎日塗るようにした。皮脂減少の効果に対する判定は皮脂量測定器(Sebumeter815、Germany)を用いて測定し、その結果は下記の表3に示した。
本発明の1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンの皮膚炎症因子であるPGE‐2の発現を抑制する効果を測定するために、ELISA(EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay)を実施した(SE Dunsmore、et al.,J Biol Chem、271:24576‐24582、1996)。
人の表皮組職で分離した角質形成細胞(keratinocyte)を24ウェル(well)細胞培養プレートの各ウェルに5×104個を入れて24時間付着させた。培養液を除去した後、各ウェルに100μlのリン酸緩衝塩液(PBS)を入れた。この角質形成細胞に紫外線B(UV B)ランプ(Model:F15T8,UV B15W、Sankyo Dennki社、Japan)を利用して紫外線30mJ/cm2を照射した後、PBSを取り出して各ウェルに角質形成細胞培養液200μlを添加した。ここに試験物質として1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンをそれぞれ2μg/ml処理し、所定時間帯別に紫外線刺激によって増加した活性酸素種(reactive oxygen species、ROS)の量を定量した。この時、比較のために試験物質を処理しないで(無処理)紫外線刺激もしないもの及び試験物質を処理しないで紫外線刺激をしたものに対する活性酸素種の量も測定した。ROSの量はROSによって酸化されるDCF‐DA(dichlorofluorescin diacetate)の蛍光を測定するTanの方法を参考して定量し(Tan et al.,1998、J. Cell Biol. Vol.141、pp1423‐1432)、対照群のROSに対する割合を下記の表5に示した。
本発明で用いられる1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンのコラーゲン生合成促進効果をTGF‐βと比較して測定した。
1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンの毛穴縮小効果をトコフェロール及びEGCGと比較して測定した。ライノマウス60匹を10匹ずつ6つの群に分け、各群のライノマウスに1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボン、トコフェロールまたはEGCGの1%溶液(溶媒として1,3‐ブチレングリコール:エタノール=7:3使用)を0.5mlずつ塗布した。この時、比較のために一つの群には溶媒のみ0.5ml塗布した。物質を1週間処理し、最後の処理24時間後に背中の部分を生検した。表皮を分離して0.5%の酢酸に浸した後、10%ホルマリンに固定して6mmで垂直に切った。ヘマトキシリンとエオシンで染色した後、機械接眼マイクロメーター(Mechanical eyepiece micrometer)を利用して毛穴の大きさを測定した。その結果を下記の表7に示した。
下記の表8に記載した組成によって柔軟化粧水(スキンローション)剤形の実施例4〜6及び比較例2を通常の製造方法で製造した(単位:重量%)。
試験対象としては20〜50歳女性層で脂性肌の人60名を無作為に15名ずつ4つの群に分けた。各群に対して洗顔後所定時間が経った後上記実施例4〜6または比較例2の製品をそれぞれ塗布するようにし、これを朝、夜1日2回実施するようにした後、4週後に毛穴の大きさを肉眼で測定した。その結果は下記の表9に示した(評価等級:0.全く縮小されない;5.非常に縮小した)。
以下の表10に記載した組成で通常の方法によって化粧水を製造する。
以下の表11に記載した組成で通常の方法によって栄養クリームを製造する。
以下の表12に記載した組成で通常の方法によってマッサージクリームを製造する。
以下の表13に記載した組成で通常の方法によってパックを製造する。
以下の表14に記載した組成で通常の方法によってゲルを製造する。
以下の表15に記載した組成で通常的な方法で軟膏を製造する。
1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物0.0025g、ビタミンC0.0025g、パーム油2mg、パーム硬化油8mg、黄蝋4mg及びレシチン6mgを混合して、通常の方法によって1カプセル当たり400mgずつ充填して軟質カプセルを製造した。
1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物0.0025g、ビタミンC0.0025g、葡萄糖100mg、澱粉96mg及びマグネシウムステアレート4mgを混合して、30%エタノールを40mg添加して顆粒を形成した後、60℃で乾燥して打錠機を利用して錠剤に打錠した。
1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物150mg、ビタミンC150mg、葡萄糖100mg、及び澱粉600mgを混合して、30%エタノールを100mg添加して顆粒を形成し、60℃で乾燥して顆粒を形成した後包に充填した。内容物の最終重量は1gにした。
1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物0.0025g、ビタミンC0.0025g、葡萄糖10g、クエン酸2g及び精製水187.8gを混合して瓶に充填した。内容物の最終用量は200mlにした。
Claims (5)
- ABH抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ABH抗原の発現を増加させる物質が、1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が肌細胞の皮脂生成抑制用であることを特徴とする肌外用剤組成物。 - ABH抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ABH抗原の発現を増加させる物質が、1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が毛穴縮小用であることを特徴とする肌外用剤組成物。 - ABH抗原の発現を増加させる物質を有効成分として含む組成物であって、
前記ABH抗原の発現を増加させる物質が、1,3‐ジカフェオイルキナ酸、1,5‐ジカフェオイルキナ酸、及びアメントフラボンからなる群から選択された1種以上の化合物、またはその薬学的に許容可能な塩であり、かつ、
前記組成物が毛穴拡大予防用であることを特徴とする肌外用剤組成物。 - 前記組成物がABH抗原の発現を増加させる物質を組成物総重量に対して0.001重量%〜20重量%の量で含むことを特徴とする請求項1〜3の中の何れか一項に記載の肌外用剤組成物。
- 前記組成物が化粧料組成物または薬学組成物であることを特徴とする請求項1〜4の中の何れか一項に記載の肌外用剤組成物。
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