CN112062873A

CN112062873A - 超高压提取姬松茸多糖的方法及其应用

Info

Publication number: CN112062873A
Application number: CN202011201766.8A
Authority: CN
Inventors: 马吉飞; 谈春季; 李瑞忠; 李桂霞; 钟普鹏; 胡德宝; 洪亮; 秦顺义; 张建斌
Original assignee: Shijiazhuang Feilong Feed Co ltd; Tianjin Agricultural University
Current assignee: Shijiazhuang Feilong Feed Co ltd; Tianjin Agricultural University
Priority date: 2020-11-02
Filing date: 2020-11-02
Publication date: 2020-12-11

Abstract

本发明属于功能性有效成分提取领域，具体公开了一种超高压提取姬松茸多糖的方法及其应用，提取步骤包括将姬松茸子实体粉碎过筛，加水混合后，进行超高压处理，再减压离心，取上清液进行浓缩处理后，加入无水乙醇混合，进行醇沉处理，再离心，溶于水，再加入无水乙醇洗涤，离心，冷冻保存后，再将其干燥，即得姬松茸多糖。本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，提高姬松茸多糖提取的效率，较大程度保留了姬松茸多糖的活性，而且不会对环境造成污染，对治疗结肠炎有作用。本发明的提取方法适用于提取姬松茸多糖，所提取的姬松茸多糖适用于治疗结肠炎。

Description

超高压提取姬松茸多糖的方法及其应用

技术领域

本发明属于功能性有效成分提取领域，涉及姬松茸多糖，具体地说是一种超高压提取姬松茸多糖的方法及其应用。

背景技术

姬松茸（Agaricus Blazei Murill）原产于巴西，又被称为柏氏蘑菇和小松菇，是一种珍稀药食兼用真菌，生活在高温、潮湿和通风的环境中，原产于巴西、秘鲁，在真菌分类上属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，蘑菇科，蘑菇属。姬松茸的子实体粗壮，菌盖直径5-11cm，表面有淡褐色至栗色的纤维状鳞片；菌盖中心的菌肉厚达11mm，菌肉白色，菌褶离生，密集；菌柄圆柱状，菌环大，上位，膜质，初白色，后微褐色；孢子阔椭圆形至卵形，没有芽孔。

姬松茸新鲜子实体含水分85%～87%，可食部分每100g干品中含粗蛋白40～45g、可溶性糖类38～45g、粗纤维6～8g、脂肪3～4g、灰分5～7g；其蛋白质组成中包括18种氨基酸，人体的8种必需氨基酸齐全，还含有多种维生素和麦角甾醇。姬松茸子实体含有丰富的多糖、糖蛋白复合体、甾醇类等活性物质，除了各种珍贵的维生素和矿物质外，姬松茸的多聚糖含量是所有已知保健真菌中最高的，主要是β-葡聚糖D。

姬松茸多糖是姬松茸的最有效成分之一，姬松茸多糖存在于姬松茸的细胞壁内壁，具有螺旋状的三维立体结构，是一种β型的葡聚糖，大分子化合物，不溶于高浓度的酒精，微溶于低浓度的酒精及冷水，在热水中能全部溶解。姬松茸多糖进入人体后不会被消化系统消化、分解，而是直接作用于细胞膜上的受体，使其发生药理作用，其药效显著并多样，而且许多效果是其他真菌多糖所不具备的。

研究表明姬松茸多糖具有抗氧化、调节机体免疫力、降血糖、抗肿瘤、降血脂、降胆固醇、改善动脉硬化的功效，而且，在无法进行手术也无法使用放射或化学疗法的情况下，它也同样有效。姬松茸及其提取物可以迅速有效的降低化学疗法等传统治疗方法所带来的痛苦和危险性。

已经报道的姬松茸多糖的提取方法包括：热水浸提法、溶剂提取法、复合酶提取法、高速剪切提取、超声波循环提取等。常规提取方法易破坏有效成分的生物活性，存在提取时间长，提取率相对较低、提取纯度低的缺点，而采用低温浸泡的方法则溶媒用量大、耗时长、回收成本高。

发明内容

本发明的目的，是要提供一种超高压提取姬松茸多糖的方法，以提高姬松茸多糖的提取效率；本发明的另一个目的，是要提供上述姬松茸多糖的一种应用。

本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：

一种超高压提取姬松茸多糖的方法，包括以下步骤：

S1、将姬松茸子实体粉碎过筛，得到粉末A，加水混合后，进行超高压处理，得到混合液B；

S2、将混合液B减压离心，取上清液进行浓缩处理，得到浓缩液C；浓缩液C中加入无水乙醇混合，进行醇沉处理后，离心，得到沉淀D，取沉淀D溶于水后，得到混合液E；

S3、混合液E中加入无水乙醇洗涤，离心，得到沉淀F；

S4、将沉淀E冷冻保存后，再将其干燥，即得姬松茸多糖。

作为限定：步骤S1中过筛目数为20～80目，粉末A与水的质量比为1：10～1：70，超高压处理的条件为温度23～27℃，压力100～400MPa，保压时间为5～30min。

作为进一步限定：步骤S2中浓缩液C与无水乙醇的体积比为1：3～1：5，醇沉处理的温度为4～8℃，醇沉时间为12～24h。

作为再进一步限定：步骤S3中混合液E与无水乙醇的体积比为1：3～1：5，无水乙醇洗涤次数为1～3次。

作为更进一步限定：步骤S4中冷冻保存温度为-80～-77℃，冷冻保存时间为8～12h，干燥温度为-90～-82℃，干燥时间为12～24h。

本发明还提供了上述提取方法提取的姬松茸多糖的应用，用于治疗结肠炎。

本发明由于采用了上述方案，与现有技术相比，所取得的有益效果是：

（1）本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，直接使用水作为提取液，姬松茸多糖溶于水，高压破坏下细胞结构多糖解离，不需要使用超声处理，不用加入纤维素酶破裂细胞结构，方法简便，成本低；水与姬松茸子实体粉末的比例合适，使细胞内部与外部溶剂间产生较大的浓度差的同时，也不会因为溶剂过多而导致姬松茸多糖成分的损失，能够使姬松茸多糖充分释放出来；

（2）本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，超高压提取过程处于密闭的环境中，没有溶剂挥发，不会对环境造成污染，符合绿色环保要求，而且超高压提取技术属于非热技术，具有升压速度快、萃取温度低、萃取时间短、萃取效率高，不会破坏热敏性活性物质等优点，处理温度为23～27℃，不会破坏姬松茸多糖的结构，在提取过程中对姬松茸多糖结构没有影响，较大程度保留了姬松茸多糖的活性，此外，超高压力使得溶剂进入植物细胞内部，泄压后溶剂可带着有效成分溢出，提高姬松茸多糖提取的效率，超高压压力为100～400MPa，保压时间为5～30min，在此压力范围和时间范围内，姬松茸多糖释放效果明显；

（3）本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，醇沉温度为4℃～8℃，溶液不结冰，杂质更易停留在晶格中不易沉淀，

（4）本发明提供的超高压提取姬松茸多糖的方法，采取低温冷冻保存和低温冷冻干燥，保护了多糖的结构和活性，缩短了提取时间，提高了姬松茸多糖的提取率和品质；

（5）本发明提供了姬松茸多糖在治疗结肠炎中的应用，姬松茸多糖对IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌有抑制作用，减轻了炎症对机体的影响，而且对结肠萎缩具有保护作用；

本发明的提取方法适用于提取姬松茸多糖，所提取的姬松茸多糖适用于治疗结肠炎。

附图说明

下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明。

图1为本发明实施例6中的葡萄糖标准品吸收光谱；

图2为本发明实施例6中的红外光谱检测扫描图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本领域的技术人员应当理解，本发明并不限于以下实施例，任何在本发明具体实施例基础上做出的改进和变化都在本发明权利要求保护的范围之内。

实施例1～5 超高压提取姬松茸多糖的方法

实施例1～5分别为一种超高压提取姬松茸多糖的方法，工艺参数参见表1，具体步骤如下：

S1、将干燥至恒重的姬松茸子实体用粉碎机粉碎，并过筛，得到粉末A，放入耐压袋中，再向耐压袋中加水，用热封机密封，混合均匀后于室温下静置1h，再放入压力容器中进行超高压处理，得到混合液B；

S2、将混合液B减压离心，取上清液置于旋转蒸发仪进行浓缩处理，得到浓缩液C；浓缩液C中加入无水乙醇混合，搅拌均匀，进行醇沉处理后，离心，得到沉淀D，取沉淀D溶于水后，得到混合液E；

S3、混合液E中加入无水乙醇洗涤，离心，得到沉淀F；

S4、将沉淀E冷冻保存后，再将其置于低温冷冻干燥机中干燥，即得姬松茸多糖。

表1 实施例1～5超高压提取姬松茸多糖的工艺参数

实施例6 姬松茸多糖的证明实验

（1）葡萄糖标准曲线

准确配制质量浓度为 0、0.008、0.012、0.016、0.020、0.024、0.028、0.032、0.040mg/mL的标准葡萄糖溶液2mL于具塞管中，进行显色反应，在 490nm 处测吸光度y，重复测量3次，结果如图1所示，图中，以y为纵坐标，标准葡萄糖溶液的质量浓度x为横坐标，进行线性回归拟合，绘制标准曲线，标准曲线方程y=15.36x+0.0686，该方程的相关系数为0.9982。

（2）姬松茸多糖含量测定

分别精密称取实施例1～5提取的姬松茸粗多糖0.1g，配置成2mL溶液于具塞管中，并加入1mL质量分数为6%的苯酚溶液，然后沿着液面滴加5mL浓硫酸溶液混匀，置于40℃水浴锅保温30min后，放于冰水浴中5min，用紫外可见分光光计测量吸收波长为490nm处的吸光值，由图1分别得到实施例1～5的姬松茸多糖浓度，实施例1～5的姬松茸多糖纯度的计算公式如下，计算结果见表2。

姬松茸多糖纯度（%）=CV/m100%，其中,C为姬松茸多糖浓度，V为样品稀释的体积mL，m为样品的质量。

表2 实施例1～5提取的姬松茸多糖纯度

（3）红外光谱测定

取完全干燥的实施例1提取的姬松茸多糖，采用KBr压片法压片，在波长范围4000～500cm^-1内进行红外光谱扫描，扫描图如图2所示，与姬松茸多糖的典型吸收峰相同。

姬松茸多糖在3385.77 cm^-1处有一强且宽的吸收峰为多糖特征的吸收谱带，多糖上的-OH形成分子间、分子内氢键，2924.89 cm^-1附近的肩峰为饱和C-H伸缩振动的信号，中等强度，1643.83 cm^-1为酞胺碳基特征吸收峰,强度较弱，1400 cm^-1处出现的峰为C-H的变角振动,它和C-H键的伸缩振动构成了糖类的特征吸收峰，1154.07 cm^-1、1079.88 cm^-1、1022.39 cm^-1三个峰为毗喃糖环特征吸收峰,是其糖苷C-O-C的非对称振动峰。

分别对实施例2～5提取的姬松茸多糖进行红外光谱扫描，所得红外光谱图与实施例1制备的姬松茸多糖相同，这里不再赘述。

对比例1 姬松茸多糖提取率对比

（1）热水浸提法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体粉碎、过筛，按料液比1：20加去离子水，沸水浴加热2h，过滤后取滤渣重复操作，将滤液合并，浓缩滤液，按1：1加入氯仿与正丁醇为4：1的试剂，在100 r/min条件下震荡25 min，再以4000 r/min离心15 min，取上层溶液重复离心至蛋白层不再有蛋白析出为止，加入95%乙醇使得最终乙醇浓度为85%，沉淀12 h，离心取沉淀冻干，得到0.406g姬松茸粗多糖。

（2）复合酶提法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体粉碎、过筛，加入蒸馏水，调节pH值，再加酶酶解，调pH值至中性，100℃热水浸提2 h，再以4000 r/min转速离心15min，抽滤，滤液醇沉过夜，4000r/min转速离心15min，干燥，0.7255g得到姬松茸粗多糖。

（3）超声波提取法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体粉碎、过筛，加入蒸馏水水煮，再超声波处理，浸提后，冷却至30℃，以4000 r/min离心15min，将上清液取出后加入30℃温水，搅拌，以4000 r/min离心15min，合并两次离心上清液，真空旋转蒸发至原体积的1/4，加入3倍量无水乙醇，沉淀过夜，以4000r/min离心15min，将沉淀在50℃下烘干至恒重，得到0.985g姬松茸粗多糖。

（4）微波提取法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体粉碎、过筛，加入水，微波辐射，降溫后，再继续辐射，如此反复直至达到预定的提取时间，提取液经抽滤、稀释后，清洗残渣，合并洗液及滤液，浓缩，干燥，得到0.452g姬松茸粗多糖。

（5）高速剪切提取法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体经95%乙醇脱脂干燥后，粉碎，加入水，高速剪切提取，提取液以10000r/min速率离心10min，弃去沉淀收集上清液，上清液旋转蒸发浓缩至体积为原体积的1/10后，经醇沉，离心，烘干，得到0.6165g姬松茸粗多糖。

（6）碱提法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体，粉碎，过筛，加入适量氢氧化钠溶液，搅拌混匀，微波提取，冷却至室温后以4000 r/min离心去渣15 min，抽滤，收集滤液，得到0.66g姬松茸粗多糖。

（7）超高压提取法

将5g干燥至恒重的姬松茸子实体用粉碎机粉碎，并过40目筛，得到粉末A，放入耐压袋中，再向耐压袋中加水，用热封机密封，混合均匀后于室温下静置1h，再放入压力容器中在25℃下，以300MPa的压力，保压15min，进行超高压处理，得到混合液B；将混合液B减压离心，取上清液置于旋转蒸发仪进行浓缩处理，得到浓缩液C；浓缩液C中加入浓缩液C3倍体积的无水乙醇混合，搅拌均匀，进行醇沉温度为5℃，时间为20h的醇沉处理后，离心，得到沉淀D，取沉淀D溶于水后，得到混合液E；混合液E中加入混合液E3倍体积的无水乙醇洗涤3次，离心，得到沉淀F；将沉淀E在-80℃下冷冻保存后，再将其置于-90℃的低温冷冻干燥机中干燥14h，得到0.9165g姬松茸多糖。

热水浸提法、复合酶提法、超声波提取法、微波提取法、高速剪切提取法、碱提法和本发明的超高压提取姬松茸多糖的提取率对比，如表3所示。

表3 姬松茸多糖不同提取方法的提取率

由表3可知，本发明的超高压提取姬松茸多糖的方法提取的姬松茸多糖的提取率高于热水浸提法、复合酶提法、微波提取法、高速剪切提取法、碱提法提取姬松茸多糖的提取率，与超声波提取法提取姬松茸多糖的提取率相近，且操作比超声波提取法简单，成本低。

实施例7 姬松茸多糖抗DSS诱导的大鼠结肠炎作用

选取40只SPF 级雌性SD 大鼠，随机分成5个组，每组8只，分别为DSS+多糖低剂量组、DSS+多糖中剂量组、DSS+多糖高剂量组、DSS模型组和空白对照组，其中，DSS+多糖低剂量组、DSS+多糖中剂量组、DSS+多糖高剂量组和DSS模型组均采用4.5%葡聚糖硫酸钠DSS的水溶液诱导小鼠溃疡性结肠炎，DSS+多糖低剂量组每日按50mg/kg的剂量灌胃实施例1提取的姬松茸多糖，DSS+多糖中剂量组每日按100mg/kg的剂量灌胃实施例1提取的姬松茸多糖，DSS+多糖高剂量组每日按200mg/kg的剂量灌胃实施例1提取的姬松茸多糖，DSS+多糖低剂量组、DSS+多糖中剂量组、DSS+多糖高剂量组灌胃的是不同浓度的等体积量的姬松茸多糖水溶液；DSS模型组和空白对照组灌胃等体积量的生理盐水；每日灌胃1次，连续灌胃14d，期间给予充足的饮食、饮水，除灌胃外，自由采食、饮水。实验结束后，在各组大鼠眼眶后静脉丛取血，静置离心取血清，-80℃保存备用，用于检测细胞因子，处死大鼠，取新鲜结肠段部分测量。

（1）姬松茸多糖对结肠炎大鼠结肠长度影响

取出从回盲部游离至肛门口的大肠，去除肠管上的派氏淋巴结，对结肠炎大鼠结肠长度进行检测，并对各组的统计各组的检测结果，并计算均值，具体结果见表4。

表4结肠长度

注：表中数据以平均值±标准误差表示；同行肩标字母相同表示不显著（P > 0.05）；不同表示显著性差异（P < 0.05）。

由表4可以看出，DSS炎症引起的大鼠急性结肠炎会导致结肠水肿出血萎缩变短，DSS模型组的大鼠结肠长度相对于DSS+多糖高剂量组、DSS+多糖中剂量组和DSS+多糖低剂量组均显著变短（p＜0.05），而且大鼠结肠长度随着姬松茸多糖的浓度增加而变长，随着表明姬松茸多糖对抗DSS结肠炎引起的大鼠结肠萎缩有保护作用。

（2）姬松茸多糖对大鼠结肠组织细胞因子分泌水平的影响

根据ELISA检测试剂盒说明书操作，室温下，将待检血清按1:1稀释处理，随后在包被板加100uL待检血清，25～37℃孵育90～120 min，经3次洗涤，加生物素抗体100uL孵育60min，洗涤3次，酶结合物100uL，25min，洗涤3次，显色底物100uL，5～30min，加50uL终止液，立即在450nm波长用酶标仪测量OD值，检测各组大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌水平，统计各组的检测结果,见表5。

表5 细胞因子分泌水平

由表5 可以看出，IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子在DSS模型组浓度显著高于DSS+多糖低剂量、DSS+多糖中剂量和DSS+多糖高剂量的表达量（p＜0.05），而且IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子在DSS+多糖低剂量、DSS+多糖中剂量和DSS+多糖高剂量的表达量随着姬松茸多糖的浓度增加而减小，表明姬松茸多糖对结肠炎大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌有抑制作用，并且抑制效果与浓度呈正相关，减轻了炎症对机体的影响。

综上所述，本发明的姬松茸多糖对IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌具有抑制作用，对肠黏膜屏障具有保护作用。

实施例8 姬松茸多糖的应用

实施例1-5提取的姬松茸多糖用于治疗结肠炎。

Claims

1.一种超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3、混合液E中加入无水乙醇洗涤，离心，得到沉淀F；

S4、将沉淀E冷冻保存后，再将其干燥，即得姬松茸多糖。

2.根据权利要求1所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S1中过筛目数为20～80目，粉末A与水的质量比为1：10～1：70，超高压处理的条件为温度23～27℃，压力100～400MPa，保压时间为5～30min。

3.根据权利要求1或2所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S2中浓缩液C与无水乙醇的体积比为1：3～1：5，醇沉处理的温度为4～8℃，醇沉时间为12～24℃。

4.根据权利要求1或2所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S3中混合液E与无水乙醇的体积比为1：3～1：5，无水乙醇洗涤次数为1～3次。

5.根据权利要求3所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S3中混合液E与无水乙醇的体积比为1：3～1：5，无水乙醇洗涤次数为1～3次。

6.根据权利要求1、2、5中任意一项所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S4中冷冻保存温度为-80～-77℃，冷冻保存时间为8～12h，干燥温度为-90～-82℃，干燥时间为12～24h。

7.根据权利要求3所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S4中冷冻保存温度为-80～-77℃，冷冻保存时间为8～12h，干燥温度为-90～-82℃，干燥时间为12～24h。

8.根据权利要求4所述的超高压提取姬松茸多糖的方法，其特征在于，步骤S4中冷冻保存温度为-80～-77℃，冷冻保存时间为8～12h，干燥温度为-90～-82℃，干燥时间为12～24h。

9.权利要求1-8中任意一项所述的姬松茸多糖的一种应用，其特征在于，姬松茸多糖用于治疗结肠炎。