CN111996278A - 烟草黑胫病预警基因Ntab0295850及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于烟草基因组解析和烟草栽培技术领域，具体涉及一个烟草黑胫病预警基因及其应用专利申请事宜。烟草黑胫病预警基因Ntab0295850的碱基序列如SEQ ID No.1所示，作为预警基因用于指示黑胫病的感染情况。本申请所提供的预警基因，具有响应快速、灵敏度高的技术优点，而且由于是检测烟草基因组（现有技术，多是检测病菌基因组），因此具有便捷的技术优势。本申请不仅可为黑胫病的监测和早期预防奠定一定技术基础，也为其他烟草病害防控提供了借鉴和参考，因此具有较好的应用和科研价值。

Description

烟草黑胫病预警基因Ntab0295850及其应用
技术领域
本发明属于烟草基因组解析和烟草栽培技术领域，具体涉及一个烟草黑胫病预警基因及其应用专利申请事宜。
背景技术
烟草栽培中，真菌、细菌和病毒等多种微生物都会导致烟草病害的发生，同时，蚜虫等具有刺吸式口器的昆虫也会向烟草传播病原体并进而导致其产生病害。而由于微生物个体小，再加上烟草病害的传播途径多样，给烟草病害的发生和流行规律研究带来不小的困难。现有技术中，一般采用病情指数等指标来反映病害的发生、发展和流行规律，但这种评价方法通常要等到发病、甚至开始蔓延后才能够对病害的发生或流行做出判断，而这往往容易延误后续的防治。理论而言，如果能在病原体侵染烟草早期时，就能够通过及时检测到并做出预警，可为后续病害跟踪、病害发展及流行趋势判断奠定良好基础，也可为控制病害大规模的蔓延争取到足够的时间。
烟草黑胫病是一类土传真菌性病害，又称烟草疫病，是世界烟草生产中最具毁灭性的病害之一，也是危害我国烟叶生产的主要病害，在国内主要产烟区均有发生，发病后主要症状为：烟草矮化、根和茎基部坏死、叶片发黄萎蔫，平均发病率为3%～12%，严重时可达50%以上。烟草黑胫病能够使烟株根系活力下降，水分和营养物质运输受阻，直接或间接地影响到烟叶的产量和质量，造成严重的经济损失。
研究表明，烟草黑胫病的传播途径多样，主要初侵染源是带菌的土壤、粪肥及灌溉水，其次为带病烟苗，其产生的孢子囊和游动孢子借雨水或灌溉水传播，可引起再浸染。由于该病害传播范围广，传播途径多样，在烟株体内增殖和转移速度很快，因此提前预防和尽早预警是该病防治的关键。
现有研究中，针对烟草真菌性病害分子生物学检测技术大多数是基于核糖体内转录间隔区（rDNA-ITS）序列设计开发特异性引物，再利用PCR扩增技术进行检测判定。当然，也有根据某些特定保守基因序列比对后结果再设计特异性引物进行PCR扩增、检测和判定所感染真菌类型的。但这些方法多是基于所鉴定病菌真菌自身基因所进行的病害鉴定，实际应用中，也就意味着，只有当烟草感染这种病原真菌、且能够提取获得该病原真菌基因组后才能利用PCR方法进行鉴定，从而导致该此类方法在应用时具有很大局限性。因此，如何更为快速的对烟草所能遭受的病原真菌进行鉴定，对于相关病害防控具有十分重要的技术意义。
发明内容
针对烟草黑胫病，本申请目的在于提供两个能够在黑胫病感染早期即可快速响应的预警基因，从而为黑胫病的早期预防奠定良好技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
烟草黑胫病预警基因Ntab0295850和Ntab0278480，其碱基序列分别如SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示，具体如下：
Ntab0295850基因序列（237 bp，SEQ ID No.1），具体如下：
GGCTATGGAAATGTATCGGCGAATCATCGGAACATGAACAAGAGGATGATGGAGTTTTTGAAAAAGAGTTGGATTCCTAAAATTGGAGAAGTGAAAATGGAAAGAGAGAAAGTGCATAAACATATGATTAAAGAGAGGATTAGAAGAGAAAAGCAGAAGCAGAGTTATTTGGATTTGCATAAATTGCTCCCAATGGGAACCAAGGGTGAGAAGAATGCTATAGTCCAAACAGCAGCA；
Ntab0278480基因序列（191 bp，SEQ ID No.2），具体如下：
GTTTAGAACTCGGCAGCGTTTCGATACGTTCGTACGCTTTCGATATCGTCAGAGACGAAATAAGAAATCGGCTCATTCCACTTTTAGAAAGTAACCAGAATGGCACCGTTTTGGATTTGCAAGATGTTTTTAGGCGATTCTCGTTTGATAGTATATGTAAATTCTCTTTTGGAATGGATCCGGGTTGCTTG。
所述烟草黑胫病预警基因Ntab0295850和Ntab0278480在烟草黑胫病防治中应用，作为预警基因用于指示黑胫病的感染情况。
针对所述烟草黑胫病预警基因Ntab0295850和Ntab0278480的检测用PCR引物，
Ntab0295850-F：5’-GGCTATGGAAATGTATCGGCG-3’，
Ntab0295850-R：5’-TGCTGCTGTTTGGACTATAGC-3’；
Ntab0278480-F：5’-GTTTAGAACTCGGCAGCGTT-3’，
Ntab0278480-R：5’-CAAGCAACCCGGATCCATTC-3’。
利用所述针对所述烟草黑胫病预警基因Ntab0295850和Ntab0278480的检测用PCR引物所制备的qRT-PCR检测试剂盒，还包括检测参考基因L25用引物，具体引物序列为：
L25-F：5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’，
L25-R：5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’。
利用所述qRT-PCR检测试剂盒的烟草黑胫病检测方法，包括如下步骤：
（一）提取待检烟叶样品总RNA，并反转录cDNA；
（二）以正常生长未感染烟株烟叶样品作为对照，以L25为参考基因，利用Ntab0295850-F/R、Ntab0278480-F/R引物对进行qRT-PCR检测，计算Ntab0295850、Ntab0278480的相对表达量；
（三）依据步骤（三）中表达量情况判定待检样品黑胫病感染情况，具体而言：
相较于对照组，如果Ntab0295850、Ntab0278480的相对表达量变化不具有统计学意义，则表明待检样品未感染黑胫病；
如果Ntab0295850、Ntab0278480的相对表达量升高低于1.5倍，则需停留不少于6h后重新检测判定（如果表达量仍未发生明显变化，则可认为并未感染黑胫病，如果表达量超过1.5倍，则参考如下标准进行判定）；
如果Ntab0295850、Ntab0278480的相对表达量升高不低于1.5倍，则按照如下情况判定黑胫病发病阶段，后续可依据此发病阶段采取对应的防治措施；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
。
就黑胫病菌感染研究而言，依据现有研究报道，黑胫病菌块接种烟草叶片，病菌需要经过16 h才能开始从烟草气孔侵入叶表皮中，20～24 h病菌菌丝能够长入叶片叶肉组织，30～48 h菌丝数量逐渐增多，56～72 h菌丝密度进一步增大，对烟叶危害加剧。也即，如果采用常规病理解剖手段进行鉴定分析，至少要黑胫病菌侵染16h后才能初步判定。
就预警基因而言，此类基因一般可能是植物体内某些信号通路中的转录因子基因或关键酶基因，因此对于病原真菌天然具有响应速度快、响应更为灵敏的特点。正是基于此特点，本申请中，发明人基于前期烟草全转录组芯片表达谱数据，初步筛选获得了若干特异性响应黑胫病菌感染的差异表达基因。进一步结合实时荧光定量PCR技术检测结果表明，Ntab0295850、Ntab0278480基因能够特异性响应黑胫病菌侵染，而且具有响应速度快、响应灵敏的特点（从实施例结果来看，Ntab0295850和Ntab0278480基因能够在短时间内（＜6 h）响应黑胫病菌丝的侵染，远远提前于现有黑胫病菌开始从烟草气孔侵入叶表皮中的时间（16 h）），因此适于作为黑胫病的预警基因加以应用。
总之，本申请所提供的预警基因，具有响应快速、灵敏度高的技术优点，而且由于是检测烟草基因组（现有技术，多是检测病菌基因组），因此具有便捷的技术优势。本申请不仅可为黑胫病的监测和早期预防奠定一定技术基础，也为其他烟草病害防控提供了借鉴和参考，因此具有较好的应用和科研价值。
附图说明
图1为Ntab0295850基因表达量检测结果，图中6 h、1 d、3 d分别表示接种黑胫病菌丝6 h、1 d、3 d后检测情况，Con：健康烟株（以下各图含义类似，不再重复）；
图2 为Ntab0278480基因表达量检测结果；
图3 为Ntab0146890基因表达量检测结果；
图4为 Ntab0329770基因表达量检测结果；
图5为Ntab0295850基因在CMV病株中的表达量检测结果；
图6为Ntab0295850基因在PVY病株中的表达量检测结果；
图7为Ntab0278480基因在CMV病株中的表达量检测结果；
图8为Ntab0278480基因在PVY病株中的表达量检测结果；
图9为部分感染黑胫病的烟株表型变化实情；
图10为Ntab0295850基因表达量情况；
图11为Ntab0278480基因表达量情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请技术方案做进一步的解释说明。在进一步介绍相关实验前，就下述实施例中涉及的部分生物材料、实验试剂等背景情况简要说明如下。
生物材料：
普通烟草红花大金元，在郑州烟草研究院国家烟草基因研究中心的温室内种植，种植条件为温度（23±1）℃，相对湿度（60±2）%，光照培养16 h，黑暗培养8 h；
相关引物合成及测序工作，由生工生物工程（上海）股份有限公司完成和提供；
实验试剂：
RNA反转录试剂盒、DL2000 DNA Marker和SYBR Green等，均购自宝生物工程（大连）有限公司。
实施例1
本实施例首先就本申请所得烟草黑胫病预警基因的筛选过程简介如下。
针对烟草基因组的前期研究过程中，基于Affymetrix烟草全基因组芯片的表达谱分析结果，结合归一化后数据的显著性分析和MeV方差分析，选取P≤0.01、且处理组和对照组表达值变化≥2倍（lg2以后）作为基因表达显著变化（表达上调）的筛选标准，同时结合WEGO、KEGG对于基因功能预测和代谢途径的预测分析，初步筛选获得了4个明显响应黑胫病的功能基因（Ntab0146890、Ntab0295850、Ntab0278480、Ntab0329770）。
基于现有烟草全基因组数据，最终确定了Ntab0295850、Ntab0278480基因序列为：
Ntab0295850基因序列（237 bp）如SEQ ID No.1所示，具体如下：
GGCTATGGAAATGTATCGGCGAATCATCGGAACATGAACAAGAGGATGATGGAGTTTTTGAAAAAGAGTTGGATTCCTAAAATTGGAGAAGTGAAAATGGAAAGAGAGAAAGTGCATAAACATATGATTAAAGAGAGGATTAGAAGAGAAAAGCAGAAGCAGAGTTATTTGGATTTGCATAAATTGCTCCCAATGGGAACCAAGGGTGAGAAGAATGCTATAGTCCAAACAGCAGCA；
Ntab0278480基因序列（191 bp）如SEQ ID No.2所示，具体如下：
GTTTAGAACTCGGCAGCGTTTCGATACGTTCGTACGCTTTCGATATCGTCAGAGACGAAATAAGAAATCGGCTCATTCCACTTTTAGAAAGTAACCAGAATGGCACCGTTTTGGATTTGCAAGATGTTTTTAGGCGATTCTCGTTTGATAGTATATGTAAATTCTCTTTTGGAATGGATCCGGGTTGCTTG。
为对这4个候选基因针对黑胫病的响应情况进行进一步判定（即，考察其对黑胫病的敏感情况，从而判定其是否适合作为预警基因），基于实时荧光定量PCR技术，发明人进一步进行了相关实验，具体过程简介如下。
（一）设计引物
基于现有烟草全基因组数据和候选基因组序列，针对不同候选基因分别设计qRT-PCR时特异性扩增用引物序列如下：
Figure 589459DEST_PATH_IMAGE002
。
（二）模拟染病
参考《烟草黑胫病的烟株叶腋人工接种方法》（林湘云，中国烟草，1982），对健康烟株红花大金元进行接种感染黑胫病，以便对候选的预警基因进行验证；具体操作也可参考如下：
（1）采集大田新发病（烟草黑胫病）的烟株髓部置于（25±1）℃保湿2d（在显微镜下可观察到长出的密集白色菌丝和孢子囊），然后把病组织切碎成菌丝块作为接种材料；
（2）选择同一批次种植的长势一致、旺长期阶段的健康烟株进行接种，具体操作时，用无菌尖头镊子斜刺入准备接种的叶腋处（如有腋芽需事先切除），深至髓部，形成伤口，然后再用镊子将准备好的菌丝块完全塞进伤口，并在伤口处滴少许清水保湿；
（3）将接种后的烟株置于（25±1）℃继续培养，并经常在伤口处喷淋清水继续保湿，通常情况下一周左右即会出现病斑。
作为对照，为确保本申请候选预警基因的特异性（即特异性响应黑胫病，而非响应其他病害），发明人同时对健康烟株分别接种了黄瓜花叶病毒（CMV）和马铃薯Y病毒（PVY），以验证候选基因预警响应的特异性。
具体接种时，参考《烟草病毒病快速摩擦接种方法》（申请号201210466245.4） 和《烟草病毒病砂纸摩擦接种方法》（申请号200710077661.4）中方法进行操作，或者具体参考如下：
（1）取典型的新鲜病叶组织放入无菌研钵中，加入0.1 mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液研磨，无菌纱布过滤，最终按照病叶与磷酸缓冲液的质量体积比（W/V）为1:30～40定容后作为接种液（注意，需要现用现配）；
（2）选择同一批次种植的长势一致、有5～6片真叶的健康烟苗进行接种，具体操作时：每株烟苗选择2片叶子，均匀喷撒600目石英砂，再每片叶子上分散滴加150～200 μL接种液，使用无菌毛刷轻轻来回摩擦叶片表面，以造成叶表皮细胞微伤为宜，最后用无菌水喷洒冲洗叶表面残留液；
（3）将接种后的烟株置于（25±1）℃、相对湿度（60±2）%培养，4～6 d后观察确认发病即可。
（三）提取总RNA并反转录成cDNA备用
对步骤（二）中病株，分别在接种6 h、1 d、3 d后取叶片作为样品，液氮冷冻并研磨成粉后，采用Trizol法提取总RNA，随后利用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测所提取总RNA浓度和纯度，并对提取物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测以判定所提取总RNA完整性，确认满足后续使用需要后，对所提取总RNA直接进行后续实验或者-80 ℃保存备用。
进一步地，参考RNA反转录试剂盒说明书，将所提取的病株烟草叶片的总RNA反转录成cDNA，以作为后续qRT-PCR扩增用模板。
（四）实时荧光定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）分析
以步骤（三）所制备cDNA为模板，利用步骤（一）所设计的特异性PCR引物进行PCR扩增；同时以L25作为内参基因进行PCR扩增，以对候选预警基因表达量变化情况进行检测判定。
针对L25内参基因，PCR扩增时，引物序列设计如下：
上游引物：5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’，
下游引物：5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’；
qRT-PCR扩增时，20 μL反应体系设计如下：
cDNA，2 µL（50 ng/µL）；
SYBR Green（Vazyme，南京，中国），10 µL；
上、下游引物，各0.5 µL（10 µmol/L）；
ddH2O，7 µL。
荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）中，反应条件为：95℃，3 min；95℃、20 s，60℃、20s，40个循环；4℃保存；
每个组织样品重复检测3次，计算平均值，利用2-△△C T法计算相对表达量（相关数据利用统计学软件SPSS 19.0处理，并进行单因素方差分析（One-way ANOVA）；P＜0.05表示显著性差异；P＞0.05，表示无显著性差异）。
实验过程中，以健康烟株作为对照。
图1、图2、图3、图4分别为4个候选预警基因在烟株感染黑胫病菌后不同时间段的基因表达情况。具体而言：
与对照组（Con）相比，Ntab0295850和Ntab0278480基因在接种黑胫病菌丝6 h时，表达量就显著升高，随着接种时间的增加（1 d，3 d），表达量持续升高（P＜0.05），表明这两个基因在健康烟株遭受黑胫病病原菌侵袭时，能够在短时间内（＜6 h）响应，初步具有作为烟草黑胫病的候选预警基因的潜力；
Ntab0146890基因在接种黑胫病菌丝6 h时，表达量升高不显著（P＞0.05），但随着接种时间的增加（1 d，3 d），表达量也开始逐渐升高（P＜0.05），表明该基因在健康烟株遭受黑胫病病原菌侵袭时，并未在短时间内（＜6 h）响应，从预警基因响应速度要求角度而言，暂不考虑其作为烟草黑胫病的预警基因的应用；
而Ntab0329770基因则在接种6h~1d范围内，基因表达量并非发生明显变化，仅在3d时发生了明显降低，这些结果表明该基因在健康烟株遭受黑胫病病原菌侵袭时并未及时产生响应，显然不适合作为预警基因进行应用。
进一步地，就Ntab0295850和Ntab0278480这两个候选预警基因在CMV 、PVY病株中的表达情况进行分析，结果如图5、图6、图7、图8所示，具体而言：
就Ntab0295850基因而言：
与对照组（CMV-Con）相比，Ntab0295850基因在CMV病株中4d时的表达量很低（P＜0.05），而在接种10 d、15 d的烟株中表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05）；与此类似，与对照组（PVY-Con）相比，Ntab0295850基因在PVY病株中4d时的表达量较低（P＜0.05），在接种10 d、15 d的烟株中表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05），这一结果表明该基因对CMV、PVY不能及时响应，也即，该基因对于黑胫病感染的响应是具有特异性的。
就Ntab0278480基因而言：
与对照组（CMV-Con）相比，Ntab0278480基因在CMV 病株中4 d、10 d时的表达量很低（P＜0.05），而在接种15 d的烟株中表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05）；与此类似，与对照组（PVY-Con）相比，Ntab0278480基因在PVY 病株中4 d时的烟株中表达量较低（P＜0.05），在接种10 d、15 d的烟株中表达量有所升高，但仍显著低于对照组（P＜0.05）；这一结果表明该基因对CMV、PVY不能及时响应，也即，该基因对于黑胫病感染的响应是具有特异性的。
综合上述结果而言，Ntab0295850、Ntab0278480这两个基因均能特异性地、尤其是较为快速地响应黑胫病病原体的侵染，从而可为烟草黑胫病的早期预防发出及时预警信号，从而为后续病害的准确鉴定和防治奠定良好技术基础。
实施例2
在实施例1基础上，为便于预警基因实际检测应用，进一步地，发明人结合其他耗材和试剂制备成了检测试剂盒，从而便于相关检测工作较为便捷和快速开展。所述检测试剂盒中，主要为实验试剂，同时也可设计包含若干仪器耗材，具体而言：
仪器耗材包括：10 μL、200 μL和1000 μL规格移液器吸头（无DNase、RNase）各一个，1.5mL离心管（无DNase、RNase）若干，研钵1个，一次性乳胶手套若干副，Marker笔1杆，荧光定量PCR用96孔板（无DNase、RNase）若干；
实验试剂包括：
RNA提取用试剂：
Trizol、氯仿、异丙醇、75%乙醇（In DEPC-treated water）、无RNase水；
RNA反转录用试剂：
5× SuperMix for qPCR（包含反转录所需的全部试剂SuperRT、RNase Inhibitor、Oligo(dT)18 Primer、Random Primer(N9)、dNTPs、Buffer）、gDNA Remover、RNase-freeWater；
qRT-PCR检测用试剂：
SYBR Green荧光染料；
Ntab0295850基因上、下游引物，Ntab0278480基因上、下游引物，L25内参基因上、下游引物，分别为10 μml/L。
具体检测应用时，可参考如下操作步骤。
（一）待测样品提取总RNA
以待测烟株烟叶作为待检样，液氮冷冻后，取样50～100 mg研钵中研磨成粉；
将磨粉后样品转移至1.5 mL离心管中，加入1 mL的Trizol（Trizol用量比例为，每50～100mg粉末中加入1 mL的Trizol，且样本量不超过Trizol体积的10%，以降低DNA污染概率），室温静置5 min，以彻底分离核蛋白复合体；
随后，向离心管中加入0.2 mL氯仿，加盖后剧烈摇晃15 s，室温放置2～3 min；
4℃、12000 rpm离心15 min（离心后分为三层，RNA只存在于最上面的无色水相中）；转移上层水相至一新的1.5 mL离心管中，加入0.5 mL异丙醇，室温静置10 min；
再4℃、12000 rpm离心10 min，小心地弃去上清，随后加入1 mL的 75%乙醇洗涤沉淀；
再4℃、12000 rpm离心5 min，小心地吸干净上清，再室温放置5～10 min以干燥RNA（注意，不能干燥过度）；
最后，加入50～70 μL无RNase水充分溶解RNA，进行后续检测判定、实验应用或者-80℃保存备用。
具体检测时，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测所提取总RNA浓度和纯度（A260/A280在1.8～2.0之间表明纯度较高，可以满足后续使用需要），并进行1%琼脂糖凝胶电泳检测以判定所提取总RNA完整性。
（二）RNA反转录为cDNA
利用RNA反转录用试剂，将步骤（一）中所提取RNA反转录为cDNA，具体20µL反应体系设计如下：
总RNA，1 μg；
5× SuperMix for qPCR，4 μL；
gDNA Remover，1 μL；
RNase-free Water，加至20μL；
轻轻混匀后，42℃反应15 min，再加热至85℃保持5s以使SuperRT和gDNA Remover失活；反应后产物直接用于后续qRT-PCR检测。
（三）利用qRT-PCR对待测样本中预警基因相对表达量的检测
以L25作为内参基因，利用qRT-PCR对预警基因Ntab0295850、Ntab0278480的相对表达量进行检测；qRT-PCR检测时，20 μL反应体系设计如下：
步骤（二）所制备cDNA模板，2 µL（50 ng/µL）；
SYBR Green，10 µL；
上、下游引物，各0.5 µL（10 µmol/L）；
ddH2O，7 µL；
反应条件为：95℃，3min；95℃、20 s，60℃，20s，40个循环；4℃保存；
根据检测结果，利用2-△△C T法计算相对表达量。
（四）具体判定
具体判定待测样品的黑胫病感染情况时，具体判定标准考虑如下：
参考前述基因表达变化含量检测结果（如图1、图2所示），可以看出，与对照组（Con）相比，Ntab0295850基因在接种黑胫病菌丝6 h后，表达量就显著升高，是对照组的2.61倍；接种1 d后其表达量是对照组的3.40倍；接种3 d后其表达量是对照组的12.48倍；与对照组（Con）相比，Ntab0278480基因在接种黑胫病菌丝6 h后，表达量就显著升高，是对照组的1.59倍；接种1 d后其表达量是对照组的5.04倍；接种3 d后其表达量是对照组的4.07倍。因此，综合而言，根据基因表达量可以确定黑胫病发病阶段判定标准如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
为进一步验证这两个预警基因“预警”效果的稳定性和可靠性，以实际感染黑胫病后的烟株样本为例（分别命名为HJB烟株1、2、3，主要表型表现为：茎基部出现污黑色病斑，茎秆也有染病黑斑，底部叶片萎蔫甚至死亡，部分叶片黄褐色坏死、边缘不清晰、呈“膏药”状黑斑，由此可以判定黑胫病病菌已经开始侵染并在烟叶内部生长，部分表型实情如图9所示），发明人对这样样品材料中Ntab0295850和Ntab0278480基因表达情况进行了检测，具体结果如图10、图11所示。具体而言：
就图10而言，与对照组（Con）相比，感染黑胫病的烟株中Ntab0295850基因的表达量显著升高（P＜0.05），HJB烟株1、2、3中Ntab0295850基因的表达量分别是对照组的11.87倍、15.08倍和13.03倍；结合前述标准也可以判定，此时黑胫病病菌已经在烟叶内部生长，这也进一步说明上述标准的制定是较为合理和准确的；
就图11而言，与对照组（Con）相比，感染黑胫病的烟株中Ntab0278480基因的表达量显著升高（P＜0.05），HJB烟株1、2、3中Ntab0278480基因的表达量分别是对照组的36.76倍、25.72倍和60.50倍，结合前述标准也可以判定，此时黑胫病病菌已经在烟叶内部生长，这也进一步说明上述标准的制定是较为合理和准确的。
综合上述判定标准和判定结果而言，可以看出，本申请所选择的Ntab0295850和Ntab0278480基因在作为烟草黑胫病预警基因进行应用时，预警效果具有持续性、稳定性和可靠性，而且相关判定标准也是具有较强参考价值的，可为黑胫病的预防和控制奠定一定技术基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国烟草总公司郑州烟草研究院
<120> 烟草黑胫病预警基因Ntab0295850及其应用
<130> none
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 237
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 1
ggctatggaa atgtatcggc gaatcatcgg aacatgaaca agaggatgat ggagtttttg 60
aaaaagagtt ggattcctaa aattggagaa gtgaaaatgg aaagagagaa agtgcataaa 120
catatgatta aagagaggat tagaagagaa aagcagaagc agagttattt ggatttgcat 180
aaattgctcc caatgggaac caagggtgag aagaatgcta tagtccaaac agcagca 237
<210> 2
<211> 191
<212> DNA
<213> Nicotiana tabacum
<400> 2
gtttagaact cggcagcgtt tcgatacgtt cgtacgcttt cgatatcgtc agagacgaaa 60
taagaaatcg gctcattcca cttttagaaa gtaaccagaa tggcaccgtt ttggatttgc 120
aagatgtttt taggcgattc tcgtttgata gtatatgtaa attctctttt ggaatggatc 180
cgggttgctt g 191

Claims (6)

1.烟草黑胫病预警基因Ntab0295850，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，具体如下：
GGCTATGGAAATGTATCGGCGAATCATCGGAACATGAACAAGAGGATGATGGAGTTTTTGAAAAAGAGTTGGATTCCTAAAATTGGAGAAGTGAAAATGGAAAGAGAGAAAGTGCATAAACATATGATTAAAGAGAGGATTAGAAGAGAAAAGCAGAAGCAGAGTTATTTGGATTTGCATAAATTGCTCCCAATGGGAACCAAGGGTGAGAAGAATGCTATAGTCCAAACAGCAGCA。
2.权利要求1所述烟草黑胫病预警基因Ntab0295850在烟草黑胫病防治中应用，其特征在于，作为预警基因用于指示黑胫病的感染情况。
3.针对权利要求1所述烟草黑胫病预警基因Ntab0295850的检测用PCR引物，其特征在于，具体引物序列为：
Ntab0295850-F：5’-GGCTATGGAAATGTATCGGCG-3’，
Ntab0295850-R：5’-TGCTGCTGTTTGGACTATAGC-3’。
4.利用权利要求3所述检测用PCR引物所制备的qRT-PCR检测试剂盒。
5.如权利要求4所述qRT-PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括检测参考基因L25用引物，具体引物序列为：
L25-F：5’-CCCCTCACCACAGAGTCTGC-3’，
L25-R：5’-AAGGGTGTTGTTGTCCTCAATCTT-3’。
6.利用权利要求3所述检测用PCR引物的烟草黑胫病检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（一）提取待检烟叶样品总RNA，并反转录cDNA；
（二）以正常生长未感染烟株烟叶样品作为对照，以L25为参考基因，利用Ntab0295850-F/R引物对进行qRT-PCR检测，计算Ntab0295850的相对表达量；
（三）依据步骤（三）中表达量情况判定待检样品黑胫病感染情况，具体而言：
相较于对照组，如果Ntab0295850的相对表达量变化不具有统计学意义，则表明待检样品未感染黑胫病；
如果Ntab0295850的相对表达量升高低于1.5倍，则需停留不少于6h后重新检测判定；
如果Ntab0295850的相对表达量升高不低于1.5倍，则按照如下情况判定黑胫病发病阶段；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
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