CN111995667A - 一种乳酸链球菌素山梨酸盐的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

一种乳酸链球菌素山梨酸盐的制备方法和应用，所述制备方法包括：(1)将乳酸链球菌素盐酸盐用盐酸溶液溶解，加入山梨酸钾，充分搅匀后得到溶液；(2)采用两隔室电渗析装置，在淡水室通入步骤(1)获得的溶液，浓水室通入纯水，控制电渗析装置中的料液温度在5‑10℃之间，启动电渗析装置进行处理，处理至淡水室的物料中氯离子含量低于0.01％，结束电渗析；(3)取步骤(2)得到的淡水室中的物料进行喷雾干燥，收集粉末，获得乳酸链球菌素山梨酸盐。本发明提供了制得的乳酸链球菌素山梨酸盐在制备抑菌剂中的应用，具有良好的抑菌活性。本发明的制备方法操作简便，有效去除了Clˉ，适用于大规模的工业化生产。

Description

一种乳酸链球菌素山梨酸盐的制备方法和应用
(一)技术领域
本发明涉及一种乳酸链球菌素盐，特别涉及一种不含氯离子的Nisin盐的制备方法和应用。
(二)背景技术
乳酸链球菌素(Nisin)是由34个氨基酸组成的一种细胞素，分子量为3.5kDa，呈现阳离子和酸性特性，等电点约为9。它能有效抑制引起食品腐败的嗜热脂肪芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭杆菌等各种革兰氏阳性细菌的营养细胞和芽孢，并对人体安全无毒，因此广泛应用于食品行业，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。
市场上的乳酸链球菌素为乳酸链球菌素盐酸盐和氯化钠的混合物，乳酸链球菌素与Clˉ结合，研究表明，乳酸链球菌素盐酸盐与硝酸、乙酸复配后的抑菌活性较乳酸链球菌素盐酸盐高(刘丽莉,马美湖,杨协力.非生物性因素对乳酸链球菌素抗菌活性的影响[J].食品科学,2009,05):46-9.)，即将乳酸链球菌素盐酸盐与硝酸、乙酸直接混合，得到的产品抑菌活性更高。但是乳酸链球菌素与酸的直接混合，不能去除乳酸链球菌素中的Cl—，产品中存在过量的酸根离子，产品成份不明确，同时后期工艺收得率低，单位成本高，影响了产品质量，使得产品难以被广泛应用到食品加工业。
(三)发明内容
本发明目的是为了解决乳酸链球菌素与酸复配后存在过量游离酸，不能去除与Nisin结合的Clˉ的问题，提供了一种去除Clˉ制备乳酸链球菌素山梨酸盐的方法及应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供了一种乳酸链球菌素山梨酸盐的制备方法，包括以下步骤：
(1)将乳酸链球菌素盐酸盐(含量98％)用盐酸溶液溶解，加入山梨酸钾，充分搅匀后得到溶液，其中乳酸链球菌素的质量浓度为2-10wt％，山梨酸钾与乳酸链球菌素的质量比在0.1以上；
(2)电渗析处理：采用两隔室电渗析装置，所述电渗析装置的阳离子交换膜和阴离子交换膜采用合金离子交换膜(半均相离子交换膜)，在淡水室通入步骤(1)获得的溶液，浓水室通入纯水，控制电渗析装置中的料液温度在5-10℃之间，启动电渗析装置进行处理，处理至淡水室的物料中氯离子含量低于0.01％，结束电渗析；
(3)取步骤(2)得到的淡水室中的物料进行喷雾干燥，收集粉末，获得乳酸链球菌素山梨酸盐。
本发明步骤(1)中，所述的乳酸链球菌素为乳酸链球菌素盐酸盐，由浙江新银象生物工程有限公司提供(含量98％)。
本发明步骤(1)中，山梨酸钾与乳酸链球菌素的质量比需在0.1以上，山梨酸钾的加入量不够的话，会导致氯离子替换不完全，从而影响最后制备的乳酸链球菌素山梨酸盐的品质。基于降低成本的考虑，优选山梨酸钾与乳酸链球菌素的质量比为0.1。
本发明步骤(1)中，用盐酸溶液溶解乳酸链球菌素盐酸盐，所述的盐酸溶液优选0.02M。步骤(1)制得的溶液中乳酸链球菌素盐酸盐的浓度需落在2-10wt％之间，基于提高生产效率的考虑，优选步骤(1)的溶液中乳酸链球菌素的浓度为9％。
本发明步骤(2)中，所述的电渗析处理在电渗析装置中进行，所述电渗析装置包括电源、阳极板、阴极板和电渗析膜堆，所述电渗析膜堆设于阳极板和阴极板之间，所述的电渗析膜堆由阴离子交换膜(简称阴膜)和阳离子交换膜(简称阳膜)交替间隔排列而成且最外层均为阳膜，相邻的阳膜和阴膜形成隔室，每个阴膜与相邻的两个阳膜形成两个隔室，靠近阳极的隔室为浓水室，靠近阴极的为淡水室；阳极板和阴极板分别与相邻的阳离子交换膜形成极水室。极水室中的极水的作用是提供电场，一般通入NaCl水溶液。本发明使用的电渗析装置可使用市售商品。
作为优选，步骤(2)中，浓水室和淡水室的液体流速设置在300-600L/h，且需保持一致，以避免隔室间存在压差而产生渗透；极水室的液体流速为100-300L/h。进一步优选浓水室和淡水室的液体流速在500-600L/h，此时处理速度显著加快。
作为优选，步骤(2)中，控制两隔室电渗析装置中的料液温度为5℃。
作为优选，步骤(2)中，所述的电渗析脱盐采用恒定电压法，电压设置在40-45V之间，处理至淡水室的物料中氯离子含量低于0.01％，一般处理时间＞5h，优选处理时间为6h。
作为进一步的优选，步骤(2)中，所述的电渗析的工艺条件设置如下：所述两隔室电渗析装置的阳离子交换膜和阴离子交换膜采用合金离子交换膜，控制两隔室电渗析装置中的料液温度在5-10℃之间，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均在500-600L/h，极水室的液体流速为100-300L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在40-45V之间，处理时间＞5h。
本发明步骤(3)中，优选将步骤(2)得到的淡水室中的物料浓缩至固含物含量高于15％后再进行喷雾干燥。
本发明步骤(3)中，喷雾干燥的进口温度设置在200-210℃。
本发明还提供上述制备方法制得的乳酸链球菌素山梨酸盐在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为黄色微球菌或李斯特氏菌抑菌剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
1.本发明提供的不含氯离子Nisin盐抑菌活性更高，比现有产品提高了28％，比Nisin盐酸盐和山梨酸钾直接复配的产品提高了15％的抑菌活性，能够有效抑制和灭杀多种有害菌，可以应用于食品防腐领域，作为一种新的食品防腐剂。
2.本发明不含氯离子Nisin盐的制备方法操作简便，有效去除了Clˉ，适用于大规模的工业化生产，具有很高的经济价值。
(四)附图说明
图1是本发明使用的电渗析装置的示意图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明采用的电渗析脱盐的示意图见图1，实施例使用的电渗析装置购自杭州埃尔环保科技有限公司，型号为IONLYZER-2040-20/40。实施例使用的阳膜和阴膜由杭州埃尔环保科技有限公司提供，合金膜的型号分别是Ionsep-AMA阴膜和Ionsep-AMC阳膜。
实施例1
分别称取1000g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L0.02M HCl溶解，加入100g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，得到6份相同的溶液。
参见图1，使用电渗析装置进行电渗析脱盐，阴阳膜均采用合金膜，淡水室通入上述溶液，浓水室通入纯水，极液室通入4％NaCl水溶液，工艺条件设置为：控制电渗析装置中的料液温度分别在0、5、10、15、20、30、40℃，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均为500L/h，极水室的液体流速为200L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在45V，处理6h后，测定电渗析淡水室中氯离子的含量，其中，仅5℃和10℃样品中，氯离子含量较低(低于0.01％)，其他样品中，氯离子均大量检出。
实施例2
称取1000g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L0.02M HCl溶解，加入100g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，得到溶液。
参见图1，使用电渗析装置进行电渗析脱盐，阴阳膜均采用合金膜，淡水室通入上述溶液，浓水室通入纯水，极液室通入4％NaCl水溶液，工艺条件设置为：控制电渗析装置中的料液温度在5℃，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均为500L/h，极水室的液体流速为200L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在45V，于不同时间点(0、1、2、3、4、5、6、7、8h)对淡水室中的料液进行取样分析，测定其中的氯离子含量(硝酸银沉淀法)，结果表明，当处理时间超过5h后，氯离子含量低于0.01％。
实施例3
分别称取200、400、600、800、1000、1500g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L 0.02M HCl溶解，加入100g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，得到6份不同的溶液；
参见图1，使用电渗析装置进行电渗析脱盐，阴阳膜均采用合金膜，淡水室通入上述溶液，浓水室通入纯水，极液室通入4％NaCl水溶液，工艺条件设置为：控制电渗析装置中的料液温度在5℃，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均为500L/h，极水室的液体流速为200L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在45V，处理6h，测定淡水室中的氯离子含量(硝酸银沉淀法)，结果表明，当乳酸链球菌素量加入量达到1500g时，电渗析设备运行出现异常，氯离子大量残留，其他处理组氯离子含量均低于0.01％。
实施例4
称取1000g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L0.02M HCl溶解，分别加入50、75、100、125g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，得到四份不同的溶液。
参见图1，使用电渗析装置进行电渗析脱盐，阴阳膜均采用合金膜，淡水室通入上述溶液，浓水室通入纯水，极液室通入4％NaCl水溶液，工艺条件设置为：控制电渗析装置中的料液温度在5℃，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均为500L/h，极水室的液体流速为200L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在45V，处理6h后，对淡水室料液进行分析，测定其中的氯离子含量(硝酸银沉淀法)，结果如下表1所示：
表1
山梨酸钾加量(g) 氯离子残留量(％)
50 3
75 1.1
100 <0.01
125 <0.01
实施例5
将1000g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L0.02M HCl溶解，加入100g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，得到溶液。
参见图1，使用电渗析装置进行电渗析脱盐，阴阳膜均采用合金膜，淡水室通入上述溶液，浓水室通入纯水，极液室通入4％NaCl水溶液，工艺条件设置为：控制电渗析装置中的料液温度在5℃，使浓水室和淡水室的液体流速保持一致，均为500L/h，极水室的液体流速为200L/h，对阳极板与阴极板施加直流电场，采用恒定电压法，电压设置在45V，处理6h后，停止电渗析。
将淡水室得到的料液浓缩至5L，喷雾干燥，进口温度210℃，出口温度80℃，收集产品。
对比例1
将1000g乳酸链球菌素(浙江新银象生物工程有限公司提供，含量98％)用10L0.02M HCl溶解，加入100g山梨酸钾，溶解后充分搅匀，浓缩至5L，喷雾干燥，进口温度210℃，出口温度80℃，收集产品。
实施例6
抑菌活性分析方法采用抑菌圈法，方法参照GB 1886.231—2016食品添加剂乳酸链球菌素。
准确称取一定量乳酸链球菌素盐酸盐(含量98％)，溶于水中，使其终浓度为0.1mg/mL，摇匀用水稀释25倍，得到标准溶液。准确称取一定量山梨酸钾溶于水中，使其终浓度为0.1mg/mL，摇匀用水稀释25倍，得到试样溶液。准确称取一定量实施例5制备的乳酸链球菌素盐酸盐，溶于水中，使其终浓度为0.1mg/mL，摇匀用水稀释25倍，得到试样溶液。准确称取对比例1制备的产品溶于水中，使最终浓度为0.1mg/mL，再用水稀释25倍，得到试样溶液。
配制S1培养基200mL(质量组成：胰蛋白胨0.8％；酵母膏0.5％；葡萄糖0.5％；氯化钠0.5％；磷酸氢二钠0.2％；琼脂粉1.2％，溶剂为去离子水，灭菌后pH6.8～7.0)，经121℃、20min灭菌后，放冷至70℃左右，加入4mL体积浓度50％吐温20水溶液，充分摇匀，等冷却到50℃～55℃左右，加入黄色微球菌(NCIB8166)菌株悬浮液适量，使培养基中检测菌的最终浓度为1.0×106CFU/mL，摇匀，倒入水平放置的已灭菌的S1培养基平板中，等完全凝固后，用直径为7mm打孔器，在平板上打出所需的孔数，小心挖掉孔内琼脂，移入洁净工作台中吹风1.5～3.0h(吹风时间按空气中的湿度大小而定，同时控制室内温度最低，尽量不要让检测菌生长)。取100μL标准品溶液，随机滴加在平板的孔中，再取试样溶液100μL随机滴加到同一平板其余孔中。等孔内溶液完全渗透后，将平板移入30℃恒温箱中培养16～24h后，测定抑菌圈直径，取其平均值。
按照黄色微球菌作为检测菌的方法使用李斯特氏菌作为检测菌，测定抑菌圈。
表2 Nisin盐对不同微生物的抑菌情况
Figure BDA0002074312090000051
Figure BDA0002074312090000061
统计学分析，用spss 20.0经t-test检验，实施例5所得产品的抑菌活性显著高于其他实验组，p<0.05，存在显著性差异。

Claims (10)

1.一种乳酸链球菌素山梨酸盐的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括以下步骤：
(1)将乳酸链球菌素盐酸盐用盐酸溶液溶解，加入山梨酸钾，充分搅匀后得到溶液，其中乳酸链球菌素的质量浓度为2-10wt％，山梨酸钾与乳酸链球菌素的质量比在0.1以上；
(2)电渗析处理：采用两隔室电渗析装置，所述电渗析装置的阳离子交换膜和阴离子交换膜采用合金离子交换膜，在淡水室通入步骤(1)获得的溶液，浓水室通入纯水，控制电渗析装置中的料液温度在5-10℃之间，启动电渗析装置进行处理，处理至淡水室的物料中氯离子含量低于0.01％，结束电渗析；
(3)取步骤(2)得到的淡水室中的物料进行喷雾干燥，收集粉末，获得乳酸链球菌素山梨酸盐。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，山梨酸钾与乳酸链球菌素的质量比为0.1。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，盐酸溶液为0.02M。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)的溶液中乳酸链球菌素的浓度为9％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，浓水室和淡水室的液体流速设置在300-600L/h，且需保持一致；极水室的液体流速为100-300L/h。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：浓水室和淡水室的液体流速在500-600L/h。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，控制两隔室电渗析装置中的料液温度为5℃。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述的电渗析脱盐采用恒定电压法，电压设置在40-45V之间。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，将步骤(2)得到的淡水室中的物料浓缩至固含物含量高于15％后再进行喷雾干燥，喷雾干燥的进口温度设置在200-210℃。
10.根据权利要求1所述制备方法制得的乳酸链球菌素山梨酸盐在制备抑菌剂中的应用，所述抑菌剂为黄色微球菌或李斯特氏菌抑菌剂。
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