CN114431227A - 一种生物膜杀菌增效剂、杀菌组合物及生物膜去除方法 - Google Patents

一种生物膜杀菌增效剂、杀菌组合物及生物膜去除方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物膜治理技术领域，公开了一种生物膜杀菌增效剂、杀菌组合物及生物膜去除方法。本发明的生物膜杀菌增效剂由多种D‑氨基酸混合构成，能够与非氧化性杀菌剂混用起到增效效果。相对于单独的D‑氨基酸而言，本发明的生物膜杀菌增效剂对杀菌剂的增效范围更高，对于复杂微生物菌落的杀菌效果更有效，能够有效减少杀菌剂的使用量，缓解生物膜的耐药性问题。

Description

一种生物膜杀菌增效剂、杀菌组合物及生物膜去除方法
技术领域
本发明涉及生物膜治理技术领域，特别是涉及一种生物膜杀菌增效剂与杀菌剂混用去除生物膜。
背景技术
生物膜是生长在多种表面上的诸如细菌、古细菌、真菌、霉菌、藻类或原生动物，或上述混合物的微生物粘胶状群落，当微生物本身建立在表面上并激活参与产生包括多糖的基质的基因时，生物膜形成。这种基质可以对生物膜提供保护免遭杀生物剂作用。
生物膜可以发育成厚度几微米或几厘米的宏观结构并覆盖巨大的表面积。出于非生活目的，这些构造物可以在限制或完全阻塞管道系统中流动、减少热交换器中传热或引起市政供水、食品加工、医疗器械(例如导管、骨科装置、植入物)中病原性问题方面起到作用。另外，生物膜常常通过包埋微生物所介导的腐蚀作用缩短材料寿命。这种生物污垢在工业水处理系统、制浆及造纸工艺、冷却水系统、用于石油回收的注入井、冷却塔、多孔介质(沙和土)、海洋环境和空调系统及任何封闭水再循环系统中造成严重经济问题。生物膜也是医学科学和工业中的严重问题，据称引起牙菌斑、感染、内窥镜及隐形眼镜污染、假体装置定植和在医用植入物上的生物膜形成。
众多出版物描述了涉及致力于摧毁生物膜及聚藏于生物膜内细菌的组合物和方法。如四羟甲基硫酸磷(THPS)作为杀菌剂、微生物杀灭剂、阻垢剂和处理垃圾杀菌防臭方面广泛应用于海底石油开采、水虾养殖、垃圾处理中；二甲基乙内酰脲(DMH)用在某些卤化杀生物性水处理产品中；二溴二甲基乙内酰脲(DBDMH)处理与生物膜接触或偶然接触的水。
目前这些杀生物剂所面临的最大问题是成本高，杀菌效果差，一般在3个数量级的杀菌效果。长期使用单一杀菌剂，导致微生物的耐药性提高，从而导致只有采用更高得杀菌剂剂量才有效果，进一步提高了成本问题，由此也会带来更大的环境负担。杀菌剂复配能够在一定程度上提高杀菌效果，然而仍然不能从根本上解决成本问题和接菌耐药性问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种生物膜杀菌增效剂，本身不具有杀菌效果。与非氧化性杀菌剂混用，能够使杀菌剂的有效浓度较低，减少杀菌剂的使用量，缓解生物膜的耐药性问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种生物膜杀菌增效剂，包括D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸。
作为一种优选的实施方案，上述生物膜杀菌增效剂还包括D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸和D-丝氨酸。
作为一种更优选的实施方案，上述生物膜杀菌增效剂进一步还包括D-组氨酸、D-谷氨酸、D-天冬酰胺和D-天门冬氨酸。
本发明中所提及的“D-酪氨酸”“D-缬氨酸”“D-组氨酸”“D-蛋氨酸”“D-苯丙氨酸”“D-谷氨酸”“D-色氨酸”“D-苏氨酸”“D-天冬酰胺”“D-亮氨酸”“D-丝氨酸”和“D-天门冬氨酸”均为本领域中已知的D-氨基酸种类，如无特殊说明，可作本领域中的常规理解。本发明对上述D-氨基酸的来源不做特殊限定，可以为人工合成的D-氨基酸，或直接商业购买。
本发明上述生物膜杀菌增效剂中的氨基酸比例没有特殊限定，优选为所述含有的氨基酸质量浓度相等，也可以不相等。
上述生物膜杀菌增效剂的制备方法为：将称好的氨基酸混合物溶于溶剂，优选为去离子水中，配制成增效剂母液。较佳的，将配制好的氨基酸溶液用灭菌过滤器过滤，达到灭菌效果。使用时，将增效剂母液稀释至使用浓度即可。本发明对增效剂母液的浓度没有特殊限制，可以配制成如1000ppm、5000ppm、8000ppm、10000ppm、20000ppm等浓度。配制过程中需注意，D-酪氨酸溶解度低，需要调整pH值至8-9左右，增加溶解度。
本发明中涉及的“ppm”意指浓度单位，ppm浓度(parts per million)是用溶质质量占全部溶液质量的百万分比来表示的浓度，也称百万分比浓度。本领域技术人员可根据不同的浓度单位进行换算，经变换或换算得到的与本发明中相等的浓度均在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种生物膜杀菌组合物，包括非氧化性杀菌剂和上述的生物膜杀菌增效剂。制备过程中将非氧化性杀菌剂和生物膜杀菌增效剂混合即可。本发明的生物膜杀菌组合物还可以包括溶剂、助溶剂、乳化剂、稳定剂、润湿剂、分散剂、消泡剂、防冻剂等其他一些不降低杀菌效果的可选助剂，以提高生物膜杀菌组合物的使用及贮存性能。
本发明的生物膜杀菌增效剂能够有效提高非氧化性杀菌剂的杀菌效果。在本发明中，生物膜杀菌增效剂在1-100ppm的浓度下即能有效提高非氧化性杀菌剂的效果，降低非氧化性杀菌剂的使用浓度，优选的为1-50ppm，更优选的为10-40ppm。
本发明中的“非氧化性杀菌剂”不是以氧化作用杀死微生物，而是以致毒作用于微生物的特殊部位，因而，它不受水中还原物质的影响。本发明中非氧化性杀菌剂通常是氯酚类和季铵盐类的非氧化性化合物。非氧化性杀菌剂的杀生作用有一定的持久性，但处理费用相对氧化性杀菌灭藻剂较高，容易引起环境污染，水中的微生物易产生抗药剂型。本发明中的“生物膜杀菌增效剂”与“非氧化性杀菌剂”混用能够有效降低非氧化性杀菌剂的使用量，延缓抗药性的产生。
作为一种可实施的方式，所述非氧化性杀菌剂包括以下任意一种：四羟甲基硫酸磷(THPS)、苯扎氯胺(ADBAC)、三正丁基十四烷基氯化膦(TTPC)。
本发明提供了一种生物膜去除方法，使用非氧化性杀菌剂和上述的生物膜杀菌增效剂混用与生物膜接触，达到去除生物膜的效果。
其中，所述生物膜杀菌增效剂的浓度优选为1-100ppm，更优选的为1-50ppm，进一步优选的为10-40ppm；所述非氧化性杀菌剂的浓度视具体药物种类及生物类型做调节，可选的为10-100ppm，更优选的为30-50ppm。
本发明的有益效果：
本发明的生物膜杀菌增效剂由多种D-氨基酸混合构成，本身不具有杀菌效果。本发明的生物膜杀菌增效剂与非氧化性杀菌剂混用，能够使杀菌剂的有效浓度较低，减少了杀菌剂的使用量，缓解了生物膜的耐药性问题。
本发明的生物膜杀菌增效剂由D-氨基酸混合构成，相对于单独的D-氨基酸而言，对杀菌剂的增效范围更高，对于复杂微生物菌落的杀菌效果更有效。
本发明的生物膜杀菌增效剂因为使用混合氨基酸，所以对于戊二醛这种有交联作用的杀菌剂无效。本发明的生物膜杀菌增效剂对于氧化性的杀菌剂没有效果。
附图说明
图1：D-mix I和THPS对生物膜处理的SEM效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)100ppm THPS,(C)50ppm D-mix I,(D)50ppm THPS+10ppm D-mix I,(E)75ppm THPS+10ppm D-mix I,(F)50ppm THPS+50ppm D-mix I。
图2：D-mix II和THPS对生物膜处理的SEM效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)50pm THPS,(C)100ppm D-mix II,(D)50ppm THPS+30ppm D-mix II,(E)50ppm THPS+50ppm D-mix II。
图3：D-mix III和THPS对生物膜处理的SEM效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)50pm THPS,(C)100ppm D-mix III,(D)50ppm THPS+30ppm D-mix III,(E)50ppm THPS+50ppm D-mix III。
图4：D-mix II/D-mix III和THPS对碳钢生物膜处理的荧光效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)50ppm THPS,(C)50ppm THPS+50ppm D-mix II,(D)50ppm THPS+50ppmD-mix III。
图5：D-mix II/D-mix III和ADBAC对生物膜处理的SEM效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)30pm ADBAC,(C)30ppm ADBAC+50ppm D-mix II,(D)30ppm ADBAC+50ppm D-mix III。
图6：D-mix II/D-mix III和ADBAC对碳钢生物膜处理的荧光效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)30pm ADBAC,(C)30ppm ADBAC+50ppm D-mix II,(D)30ppm ADBAC+50ppm D-mix III。
图7：D-mix II/D-mix III和TTPC对生物膜处理的SEM效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)10pm TTPC,(C)10ppm TTPC+50ppm D-mix II,(D)10ppm TTPC+50ppm D-mixIII。
图8：D-mix II/D-mix III和TTPC对碳钢生物膜处理的荧光效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)10pm TTPC,(C)10ppm TTPC+50ppm D-mix II,(D)10ppm TTPC+50ppmD-mix III。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
配制增效剂溶液D-mix I
称取等质量的D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸，将称好的氨基酸混合物溶于去离子水中，配置成10000ppm的增效剂母液。将配置好的增效剂母液用灭菌过滤器过滤，达到灭菌效果。
实施例2
配制增效剂溶液D-mix II
称取等质量的D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸和D-丝氨酸，将称好的氨基酸混合物溶于去离子水中，配置成10000ppm的增效剂母液。将配置好的增效剂母液用灭菌过滤器过滤，达到灭菌效果。
实施例3
配制增效剂溶液D-mix III
称取等质量的D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸、D-亮氨酸、D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸、D-丝氨酸、D-组氨酸、D-谷氨酸、D-天冬酰胺和D-天门冬氨酸，将称好的氨基酸混合物溶于去离子水中，配置成10000ppm的增效剂母液。将配置好的增效剂母液用灭菌过滤器过滤，达到灭菌效果。
实施例4
D-mix I、D-mix II和D-mix III对THPS的增效效果
碳钢表面微生物来自油田采出水富集培养的硫酸盐还原菌(混合菌)。
培养基成分为：MgSO4·7H2O 4.1g，柠檬酸钠5.0g，CaSO4 1.0g，NH4Cl1.0g，K2HPO40.5g，乳酸钠4.5ml，酵母粉1.0g，1L去离子水，以及5％(w/w)Fe(NH4)2(SO4)2 20ml，将培养基的pH值调节至7.2±0.1。
将培养基加入到微生物厌氧培养瓶中，在121℃和15psi压力下灭菌20分钟，降至室温后，向培养基中通入氮气1小时，以消除溶液中的溶解氧。
在厌氧操作箱中将增效剂与杀菌剂THPS按照设定比例混合，一同与混合微生物菌种加入到微生物培养厌氧瓶中，在38℃恒温培养箱下培养7天。采用荧光观察的方法来确定碳钢表面微生物存活情况。
表1 D-mix I和THPS混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) ≥10<sup>7</sup>
100ppm THPS ≥10<sup>6</sup>
50ppm D-mix I ≥10<sup>5</sup>
50ppm THPS+10ppm D-mix I ≥10<sup>4</sup>
75ppm THPS+10ppm D-mix I ≥10<sup>4</sup>
50ppm THPS+50ppm D-mix I ≥10<sup>3</sup>
由表1和图1的SEM图像可以看出，单独添加THPS和D-mix I的效果并不明显，细菌数目只下降了一两个数量级，但通过合理的搭配THPS和D-mix I后，更少的用量就能达到更好的杀菌效果，细菌数目可以控制至下降4个数量级的效果。
表2 D-mix II和THPS混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) &gt;10<sup>7</sup>
50ppm THPS &gt;10<sup>5</sup>
100ppm D-mix II &gt;10<sup>6</sup>
50ppm THPS+30ppm D-mix II &gt;10<sup>2</sup>
50ppm THPS+50ppm D-mix II &gt;10<sup>2</sup>
由表2和图2的SEM图像可以看出，单独添加THPS和D-mix II的效果并不明显，细菌数目只能下降了一两个数量级，但通过合理的搭配THPS和D-mix II后，更少的用量可以达到更好的杀菌效果，细菌数目可以控制至下降5个数量级的效果。
表3 D-mix III和THPS混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) &gt;10<sup>7</sup>
50ppm THPS &gt;10<sup>5</sup>
100ppm D-mix III &gt;10<sup>7</sup>
50ppm THPS+30ppm D-mix III &gt;10<sup>2</sup>
50ppm THPS+50ppm D-mix III &gt;10<sup>2</sup>
由表3和图3的SEM图像可以看出，单独添加THPS和D-mix III的效果并不明显，细菌数目只能下降了一两个数量级，但通过合理的搭配THPS和D-mix III后，更少的用量可以达到更好的杀菌效果，细菌数目可以控制至下降5个数量级的效果。
采用Live/
Figure BDA0003433335460000071
BacLightTM Bacterial Viability Kits L7012活死细胞荧光染色剂对碳钢生物膜样品进行染色。染色时间为15分钟。染色成功后，活细胞呈现为绿色，死细胞呈现为红色。荧光染色样品在激光共聚焦显微镜下观察，荧光激发波长为480/500nm和490/635nm。
图4为D-mix II/D-mix III和THPS对碳钢表面生物膜处理的荧光效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)50ppm THPS,(C)50ppm THPS+50ppm D-mix II,(D)50ppm THPS+50ppm D-mix III。图中绿色代表活着的微生物，红色代表死亡的微生物，橙色代表杀菌剂已经作用在微生物上，但是还未杀死微生物。由图4可知，在未采用杀菌剂四羟甲基硫酸磷(THPS)时，活着的微生物占很大比例，当采用50ppm的杀菌剂THPS时，不能全面杀死微生物，而当采用增效剂时，试样表面几乎没有活的微生物。
为验证杀菌增效配方的抗菌广谱性，采用与上述实验不同的油田回注水样品对碳钢表面微生物进行富集分离，并采用同样的实验操作流程进行杀菌性能检测。从表4中的细胞计数也可以看出，50ppm THPS对生物膜仅有2个数量级的杀菌效果，D-mix III氨基酸混合物不具备杀菌效果。而二者混合有5个数量级的杀菌效果。
表4 D-mix III和THPS混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) &gt;10<sup>7</sup>
50ppm THPS &gt;10<sup>5</sup>
100ppm D-mix III &gt;10<sup>7</sup>
50ppm THPS+50ppm D-mix III &gt;10<sup>2</sup>
实施例5
D-mix II和D-mix III对ADBAC的增效效果
培养基配制方法和实验过程同实施例4。
在厌氧操作箱中将增效剂D-mix II和D-mix III与杀菌剂ADBAC按照设定比例混合，一同与混合微生物菌种加入到微生物培养厌氧瓶中，在38℃恒温培养箱下培养7天。采用荧光观察的方法来确定碳钢表面微生物存活情况。
表5 D-mix II、D-mix III和ADBAC混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) ≥10<sup>6</sup>
30ppm ADBAC ≥10<sup>4</sup>
50ppm D-mix II ≥10<sup>6</sup>
50ppm D-mix III ≥10<sup>6</sup>
30ppm ADBAC+50ppm D-mix II ≥10<sup>2</sup>
30ppm ADBAC+50ppm D-mix III ≥10<sup>2</sup>
由表5和图5的SEM图像可以看出，单独添加ADBAC或者D-mix II、D-mix III的效果并不如少量的ADBAC搭配一定量的D-mix II或者D-mix III，合理搭配后可达到下降4个数量级的杀菌效果。
图6为D-mix II/D-mix III和ADBAC混合处理碳钢表面生物膜的荧光效果图，染色方法同实施例4；其中，(A)空白对照(control),(B)30pm ADBAC,(C)30ppm ADBAC+50ppm D-mix II,(D)30ppm ADBAC+50ppm D-mix III。具体数据如表6所示。可见，当增效剂与苯扎氯胺(ADBAC)混合作用生物膜后，取得了4个数量级的增效效果。
实施例6
D-mix II和D-mix III对TTPC的增效效果
培养基配制方法和实验过程同实施例4。
在厌氧操作箱中将增效剂D-mix II和D-mix III与杀菌剂TTPC按照设定比例混合，一同与混合微生物菌种加入到微生物培养厌氧瓶中，在38℃恒温培养箱下培养7天。采用荧光观察的方法来确定碳钢表面微生物存活情况。
表6 D-mix II、D-mix III和TTPC混合培养7天后碳钢表面固着微生物数量
处理 固着细胞数(cells/cm<sup>2</sup>)
空白对照(control) &gt;10<sup>6</sup>
10ppm TTPC ≥10<sup>4</sup>
50ppm D-mix II ≥10<sup>6</sup>
50ppm D-mix III ≥10<sup>6</sup>
10ppm TTPC+50ppm D-mix II <10
10ppm TTPC+50ppm D-mix III <10
由表6和图7的SEM图像可以看出，同样的，当少量的TTPC和一定量的D-mix II或者D-mix III搭配后，杀菌效果达到最佳，细菌数目下降至小于10的效果。
图8为D-mix II/D-mix III和TTPC混合处理碳钢表面生物膜的荧光效果图；其中，(A)空白对照(control),(B)10pm TTPC,(C)10ppm TTPC+50ppm D-mix II,(D)10ppm TTPC+50ppm D-mix III。具体数据如表7所示。可见，当增效剂与十四烷三丁基氯化膦(TTPC)混合作用生物膜后，取得了5个数量级的增效效果。
对比例
采用单一氨基酸D-蛋氨酸(D-Met)和D-酪氨酸(D-Tyr)分别与杀菌剂THPS联用处理生物膜。其中，生物膜Ⅰ和生物膜Ⅱ均为碳钢表面微生物的硫酸盐还原菌，用不同批次的油田采出水富集培养。
在厌氧操作箱中将单一氨基酸与杀菌剂THPS按照设定比例混合，一同与混合微生物菌种加入到微生物培养厌氧瓶中，在38℃恒温培养箱下培养7天。采用荧光观察的方法来确定碳钢表面微生物存活情况。
从表7可以看出，采用单一氨基酸与杀菌剂联用细菌数仅降低一二个数量级，而杀菌效果要求在10的3次方以上才可以，4次方比较好，5次方是优秀。因此只有超过3个数量级才有意义。说明单一氨基酸与杀菌剂联用对于混合微生物没有增效效果。
表7单一氨基酸与THPS联用的效果
Figure BDA0003433335460000101
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物膜杀菌增效剂，其特征在于，包括D-酪氨酸、D-蛋氨酸、D-色氨酸和D-亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的生物膜杀菌增效剂，其特征在于，还包括D-缬氨酸、D-苯丙氨酸、D-苏氨酸和D-丝氨酸。
3.根据权利要求2所述的生物膜杀菌增效剂，其特征在于，还包括D-组氨酸、D-谷氨酸、D-天冬酰胺和D-天门冬氨酸。
4.根据权利要求1～3所述的生物膜杀菌增效剂，其特征在于，所述氨基酸的质量浓度相等或不等。
5.一种生物膜杀菌组合物，其特征在于，包括非氧化性杀菌剂和权利要求1～4任意一项所述的生物膜杀菌增效剂。
6.根据权利要求5所述的生物膜杀菌组合物，其特征在于，所述生物膜杀菌增效剂的有效浓度为1-100ppm。
7.根据权利要求5所述的生物膜杀菌组合物，其特征在于，所述非氧化性杀菌剂包括氯酚类和季铵盐类的非氧化性化合物。
8.根据权利要求5所述的生物膜杀菌组合物，其特征在于，所述非氧化性杀菌剂包括以下任意一种：四羟甲基硫酸磷、苯扎氯胺和三正丁基十四烷基氯化膦。
9.一种生物膜去除方法，其特征在于，非氧化性杀菌剂和权利要求1～4任意一项所述的生物膜杀菌增效剂混用与生物膜接触。
10.根据权利要求9所述的筛选方法，其特征在于，所述生物膜杀菌增效剂的浓度为1-100ppm。
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