CN111982757A - 一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法。它包括如下步骤：1)将粉末铺满平面承载物体的表面形成单层，并称量获得该单层的所述粉末质量；2)采用显微成像技术对步骤1)中铺有所述粉末的平面承载物体的选定面积进行拍摄，得到图片，然后对所述图片中的颗粒进行计数，得到所述选定面积上的颗粒数量，且通过所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系换算，即得到所述平面承载物体总面积上的所述粉末的总颗粒数；3)根据步骤1)中所述单层的所述粉末质量除以步骤2)中得到的所述粉末的总颗粒数，即得到每单位质量粉末中颗粒数。本发明方法能有效解决了粉末极轻极小，难以称重的难题，并且测定的结果准确，效率高。

Description

一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法

技术领域

本发明涉及一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法，属于计量测试领域。

背景技术

目前一般检测粉末时主要表征指标通常包括质量、粒度、堆密度、震实密度等项目，但是在一些情况下，也需要知道每单位质量中的有多少颗粒，以便更好地分析并获取更细致的数据。比如微载体作为一种粉末或颗粒物质用于细胞培养时，需要知道培养体系中具体有多少颗粒的微载体才能更好地研究细胞与微载体的关系，或者用于优化培养工艺中细胞接种于微载体的比例。有研究报道，微载体数量和细胞个数之间的比例是促进细胞接种成功与否的关键，一般接种比例是1-100个细胞比1颗微载体。而由于微载体颗粒较小，操作人员无法逐个清点颗粒，一般通过称量重量，因此亟需一种可以计算每个质量单位中的颗粒数以供研究人员或者生产人员计算粉末中颗粒数的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法，本发明方法能有效解决了粉末极轻极小，难以称重的难题，并且测定的结果准确，效率高。

本发明提供的一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法，包括如下步骤：1)将粉末铺满平面承载物体的表面形成单层，并称量获得该单层的所述粉末质量；

2)采用显微成像技术对步骤1)中铺有所述粉末的平面承载物体的选定面积进行拍摄，得到图片，然后对所述图片中的颗粒进行计数，得到所述选定面积上的颗粒数量，且通过所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系换算，即得到所述平面承载物体总面积上的所述粉末的总颗粒数；

3)根据步骤1)中所述单层的所述粉末质量除以步骤2)中得到的所述粉末的总颗粒数，即得到每单位质量粉末中颗粒数。

本发明中，所述单层的所述粉末质量通过减重法获得，即为铺满所述粉末的平面承载物体的质量减去所述平面承载物体的质量。

上述的方法中，所述粉末选自微载体、蛋白纯化介质或层析介质中的微粒、可吸收止血颗粒和可降解止血粉中的至少一种；

所述粉末中颗粒的粒径可为1nm～999μm。

本发明中，所述粉末为生物医药领域中所用材料的粉末，均为本领域公知的常用的材料。

上述的方法中，所述平面承载物体为平板上黏覆双面胶制成。

上述的方法中，所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形。

上述的方法中，所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形通过激光雕刻机实现。

本发明中，所述平面承载物体为可以使粉末或颗粒以单层的形式附着与其表面；其大小、形状等物理特性没有特殊要求，使用适合显微技术的承载物即可。

上述的方法中，步骤1)中将所述粉末在均匀的、无强压条件下使其铺满所述平面承载物体的双面胶表面，然后吹走多余的所述粉末，得到所述单层。

上述的方法中，所述图片采用普通显微镜、扫描电镜和透射电镜中的至少一种进行拍摄得到。

上述的方法中，当所述粉末中颗粒的粒径可为1μm～999μm时，采用普通显微镜、电镜和透射电镜中至少一种进行拍摄；如当采用普通显微镜拍摄时，所述平面承载物体为透光的；和/或

当所述粉末中颗粒的粒径可为1nm～999nm时，采用扫描电镜和/或透射电镜进行拍摄，且所述平面承载物体为扫描电镜的载物台或透射电镜的铜网承载的支持膜。

上述的方法中，对所述图片中的颗粒采用人工或图像分析软件进行计数。

上述的方法中，所述图像分析软件为imageJ、Imlab和image-pro中至少一种软件。

上述的方法中，采用所述图像分析软件计数的过程如下：先将所述图片输入所述图像分析软件，再对所述图片的对比度、圆度及有效面积范围进行设定，计数结果 Count值即为所述选定面积上的粉末中颗粒数量。

本发明中，采用所述图像分析软件计数时，对图片对比度、圆度及有效面积范围进行设定的方法为本领域的公知常识，如与检测的颗粒大小、颗粒是否圆润有关，以及拍照的时候是否光线、对焦等有关系，根据现有技术中的方法即可对每次实验的数值进行设定。

上述的方法中，通过所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形辅助进行所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系换算；

当通过所述扫描电镜得到的所述图片，能根据其比例尺得到固定倍数视野下面积与总导电胶面积之比，即为所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系。

本发明还提供了一种用于单位质量粉末中颗粒数的测定的平面承载物体，该平面承载物体为平板上黏覆双面胶制成。

上述的平面承载物体中，所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形。

上述的平面承载物体中，所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形通过激光雕刻机实现。

本发明具有以下优点：

通过本发明的技术方法，能有效解决了粉末极轻极小，难以称重的难题。同时对粉末中颗粒预处理及计数软件有效值设定，避免了颗粒大小形态存在差异对数值造成的差异，测定得到的结果更准确。当使用ImageJ软件计数功能时，能尽量避免人工计数所产生的主观差异，且大大降低人员、时间成本。

本发明计数方法整体人工参与较少，效率更高，得出结果数据结论便于留存且有说服力。

附图说明

图1为本发明实施例1中计数板实物图。

图2为本发明实施例2中带网格计数板在固定视野下图片。

图3为本发明实施例3中空计数板实图。

图4为本发明实施例3中满载颗粒计数板实图。

图5为本发明实施例3中显微镜下固定视野下照片实图。

图6为本发明实施例3中手工计数图。

图7为本发明实施例4中自动计数结果图。

图8为本发明实施例4中图片对比度、圆度采用imageJ进行自动计数时的参数设置操作图。

图9为本发明实施例4中图片有效面积范围采用imageJ进行自动计数时的参数设置操作图。

图10为本发明实施例5中电镜原图(300倍)。

图11为本发明实施例5中手工计数。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、制作一种用于可附着粉末或颗粒单层的平面承载物

制作该平面承载物主要是利用2mm透明板(具体采用亚克力板)、特定双面胶纸(具体采用M透明无基材双面胶)以及激光雕刻机辅助作用得到。首先使用雕刻机对需要打的图形进行设计编辑，处理完成后，先将透明板使用雕刻机打成多个大小相同、形状相同的40mm正方形透明板，再将双面胶纸打成多个大小相同、形状相同的30mm 正方形胶纸块备用。

将30mm正方形胶纸块一面揭开露出胶层，并使其完整、无褶皱的黏附在40mm 正方形透明板上，此处胶纸最好在正方形透明板正中心位置，便于后期贴附粉末且便于观察。如图1为计数板实物图所示。

实施例2、制作一种带有网格的用于可附着粉末或颗粒单层的平面承载物

为验证固定视野的面积，对计数板进行了验证。通过使用激光雕刻机在40mm正方形透明板的中心打出数个正方形印记(不穿透)，最后组成一个30mm的正方形，将 30mm正方形胶纸块一面揭开露出胶层，并使其完整、无褶皱的黏附在30mm正方形透明板的所有网格上。通过显微镜观察的固定倍数拍摄固定视野面积。已知每个小正方形的面积，通过人工计数总的小正方形数量，便可计算出该视野实际面积。该视野实际面积与30mm正方形面积之比便可得出。如图2所示为带网格计数板在固定视野下图片。

实施例3、使用显微镜计算粉末单位质量的颗粒数

使用万分之一精密天平称取本发明实施例1中制备的空计数板的重量M1并做好记录，再将准备好的粉末均匀贴至透明胶层，要均匀的、无强压的使颗粒粉末铺满透明胶层，使用洗耳球吹走多余的粉末。将处理后的计数板使用万分之一精密天平称重 M2并做好记录，此处通过计算M2及M1差值，便可得出该计数板上粉末总质量M3。将处理后的计数板放至光学显微镜下，使用固定倍镜对固定视野面积下的粉末拍照留存。通过人工计数标记方法可以得出该视野下颗粒数量。如图3所示为空计数板实图，如图4所示为满载颗粒计数板实图，如图5所示为显微镜下固定视野下照片实图，如图6所示为手工计数图。如表1所示为计算表格。

通过上述结果可知，一个计数板上承载的颗粒质量为5.4mg，而显微镜视野下计数出来时448个颗粒，而显微镜的视野面积是整个载满颗粒面积的1.86％，所以整个载满计数板上的颗粒数应该是24086颗粒，因而每mg质量的颗粒数量为4460。而这个方法可以通过光学显微镜辅助计算计数板上的颗粒数量，配合天平计算的质量即可简便的获得单位质量的颗粒数，是依赖于成像和图像分析的一种检测方法，相比于现有技术中使用激光粒度仪(通过光散射)或电阻法粒度分析进行颗粒计数的方法，本发明方法普适性强，采用光学显微镜和天平这些常见的实验设备即可完成，适用于更多的普通实验室。

表1使用显微镜计算粉末单位质量的颗粒数结果

计算公式为：单位质量颗粒数＝(颗粒数量/面积(数量)占比)/计数颗粒总质量，其中，计数颗粒总质量＝满载计数板质量-空计数板质量，面积(数量)占比表示选定面积与总面积的比。

实施例4、使用显微镜和软件辅助计算粉末单位质量的颗粒数

与本发明实施例3中其他步骤相同，不同的是人工计数标记方法替换为软件辅助计算粉末单位质量的颗粒数。

软件辅助计算粉末单位质量的颗粒数具体步骤如下：将本发明实施例3中测得的图片输入imageJ软件中，再对图片对比度、圆度及有效面积范围进行设定，便可快速、 准确得到颗粒数量。如图7所示为自动计数结果图，如表2所示为计算表格(如图7 中右侧为计数结果Count值)。

在本实施例里，使用imageJ进行自动计数时，对图片对比度、圆度及有效面积范围进行设定，其参数的设置如下：

1.将图像转为8-bit(Image-Type-8-bit)；

2.调整阈值，去除背景，选中载体(Image-Adjust-Threshold)；

3.Threshold有两个调节框，拖动上面一条向右移动去除比例尺；

拖动下面一条向右适当移动，增加选中区域，尽可能少的减少背景；拖动完成后点击Apply；如图8所示；

5、填补空隙(Process->Binary->Fill Holes)

在调节阈值减少背景的同时，可能载体的一些不均匀部分也减弱了，酌情使用此功能，一般不使用；

6、打断重叠部分(Process->Binary->Watershed)可以利用Watershed自动识别重叠部分，并将两个载体分离开来；

7、自动分析、计数颗粒(Analyze->Analyze Particles)

设置参数包括分析的面积范围(size)，这个size是按颗粒的大小规定的，是一个面积范围(因为颗粒投射成二维图片就是一个面，所以应该根据所计数的颗粒大小和图像分辨率(选设置的时候选择pixel units就是按照图片像素分析)进行设置。比如本实施例中是200-无限大，如图9所示)；设置圆度(Circularity)：如果颗粒为圆形或类圆形颗粒可以通过设置圆度使软件更加精准地分析(0＝不圆，1.0＝完美的圆)，若过是无规则，则建议放宽此参数至0-1。Exclude edge是把边缘不完整的颗粒不进行计数。设置完成后，点击OK，即出现图7中所示结果。

自动计数时，如果发现自动计数与实践明显出现偏差，出现多数或者漏数，需要优化阈值(Threshold)和颗粒尺寸的判断标准(Size以及Circularity)

表2使用显微镜和软件辅助计算粉末单位质量的颗粒数结果

通过上述结果与本发明实施例3中人工计数方法相比，两者的方差为6.4，而变异系数为0.14％，是极为微小的差异，因此可以说明本发明采用软件自动计数和人工计数均能作为显微成像后图像分析的方法。

实施例5、使用扫描电镜计算粉末单位质量的颗粒数

首先将载物台中心贴上10mm×20mm的导电胶，同样要求是平整无褶皱。使用万分之一精密天平称量空载物台重量，再将颗粒均匀、无强压的铺满导电胶层，洗耳球除去多余颗粒使其保持单层粘附即可称量有颗粒后的载物台重量。将载物台及颗粒进行喷金等预处理后进行观察。可通过扫描电镜图片快速得出固定倍数视野下面积与总导电胶面积之比(根据比例尺得出)。通过人工计数得出该视野面积下颗粒数量，便可知道该导电胶总颗粒数，同样单位质量颗粒的数量便可得出。如图10所示为电镜原图(300倍)，如图11所示为手工计数。

表3使用扫描电镜计算粉末单位质量的颗粒数结果

本发明主要是通过使用定制的平面承载物(此处称之为“计数板”)，再加以显微镜及计数软件辅助，达到快速、准确得出一定或单位质量粉末中颗粒的数量。

(1)该方法使用的特定计数板，为2mm厚的透明板(形态规则且大小尺寸均一致)，再附以形态规则且大小尺寸均一(面积为A1)的透明胶层，此处需注意点为透明胶层需完整、无褶皱的贴附在透明板上。首先使用万分之一精密天平称取空计数板的重量 M1并做好记录，再将准备好的粉末均匀贴至透明胶层，要均匀的、无强压的使颗粒粉末铺满透明胶层，使用洗耳球吹走多余的粉末。将处理后的计数板使用万分之一精密天平称重M2并做好记录，此处通过计算M2及M1差值，便可得出该计数板上粉末总质量M3；

(2)将处理后的计数板放至光学显微镜下，使用固定倍镜对固定视野面积A2下的粉末中颗粒拍照留存。使用ImageJ软件的相应计数功能，可取得A2上粉末中颗粒的数量N2，可通过软件对颗粒二维平面面积的有效值设定，使过大、过小、形状不规则的颗粒不计入结果内。

(3)由于粉末中颗粒为均匀单层的铺满在透明胶层的，因此认定A2比A1的值即为N2比该计数板粉末中颗粒总数量N1的值。已知N1和M3之后，通过计算N1/M3 的值便可以轻松得到一定或单位质量的粉末中颗粒数量。

(4)为保证数据准确性、代表性，测一批粉末中颗粒会通过使用多组平行计数板，每个计数板拍摄多组照片(多个视野)的方式进行组内组外，去除过大过小无效值多方面的方法得到较为准确的值，为之后的细胞培养等研究使用一共强有力的数据支持。

Claims (10)

1.一种单位质量粉末中颗粒数的测定方法，包括如下步骤：1)将粉末铺满平面承载物体的表面形成单层，并称量获得该单层的所述粉末质量；

2)采用显微成像技术对步骤1)中铺有所述粉末的平面承载物体的选定面积进行拍摄，得到图片，然后对所述图片中的颗粒进行计数，得到所述选定面积上的颗粒数量，且通过所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系换算，即得到所述平面承载物体总面积上的所述粉末的总颗粒数；

3)根据步骤1)中所述单层的所述粉末质量除以步骤2)中得到的所述粉末的总颗粒数，即得到每单位质量粉末中颗粒数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述粉末选自微载体、蛋白纯化介质或层析介质中的微粒、可吸收止血颗粒和可降解止血粉中的至少一种；

所述粉末中颗粒的粒径为1nm～999μm。

3.根据权利要求1所述的方法，所述的平面承载物体其特征在于：该平面承载物体为平板上黏覆双面胶制成；和/或

所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形；和/或

所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形通过激光雕刻机实现。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)中将所述粉末在均匀的、无强压条件下使其铺满所述平面承载物体的双面胶表面，然后吹走多余的所述粉末，得到所述单层。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于：所述图片采用普通显微镜、扫描电镜和透射电镜中的至少一种进行拍摄得到。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：当所述粉末中颗粒的粒径为1μm～999μm时，采用普通显微镜、电镜和透射电镜中至少一种进行拍摄；如当采用普通显微镜拍摄时，所述平面承载物体为透光的；和/或

当所述粉末中颗粒的粒径为1nm～999nm时，采用扫描电镜和/或透射电镜进行拍摄，且所述平面承载物体为扫描电镜的载物台或透射电镜的铜网承载的支持膜。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其特征在于：对所述图片中的颗粒采用人工或图像分析软件进行计数。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述图像分析软件为imageJ、Imlab和image-pro中至少一种软件；和/或

采用所述图像分析软件计数的过程如下：先将所述图片输入所述图像分析软件，再对所述图片的对比度、圆度及有效面积范围进行设定，计数结果Count值即为所述选定面积上的粉末中颗粒数量。

9.根据权利要求3-8任一项所述的方法，其特征在于：通过所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形辅助进行所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系换算；

当通过所述扫描电镜得到的所述图片，能根据其比例尺得到固定倍数视野下面积与总导电胶面积之比，即为所述选定面积与所述平面承载物体总面积的比例关系。

10.一种用于单位质量粉末中颗粒数的测定的平面承载物体，其特征在于：该平面承载物体为平板上黏覆双面胶制成；和/或

所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形；和/或

所述平面承载物体的表面上设计网格、标尺或图形通过激光雕刻机实现。

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