CN111979325B - 一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛选及模型建立的方法 - Google Patents

一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛选及模型建立的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛选及模型建立的方法，分子标记物组合为QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM，包括获取样本的单核白细胞PBMCs：清晨收集空腹静脉血2‑4ml，PBS与人外周血等体积混匀，加入等体积淋巴细胞分离液液面上，室温，离心，取中间白膜层，加入PBS洗去淋巴细胞分离液，重复两次后，计数并加入RPMI 1640完全培养基重悬备用等步骤，本发明为肺腺癌气阴两虚证的辨证论治提供临床辅助工具，提升中医药治疗的科学内涵，促进中医、中西医结合防治肺癌水平的提升。

Description

一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛 选及模型建立的方法
技术领域
本发明属于临床医学、分子医学、检验医学、中医学或中西医结合医学领域，具体的说，是一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛选及模型建立的方法。
背景技术
气阴两虚证是非小细胞肺癌的中医典型证候这一观点为业内的共识。其判断方式为中医临床医师经四诊合参后得出主观判断结论，这一模式延续至今，其主要内容即参考《中药新药临床研究指导原则(2002)》、《恶性肿瘤中医诊疗指南》中的相关内容，但缺乏客观量化的标准，且结果的准确性因中医医生临床水平的高低而表现出显著差异性，开展临床研究及推广均受到限制。中医证型的客观量化是目前制约中医学进一步发展的科学难题，也是中医学难以纳入现代科学评价体系并与其他学科进行直接交流的重要原因。但是，中医、中西医结合对于肺癌的临床疗效肯定，尤其是气阴两虚证人群，诸多临床研究表明其可以作为判断预后的独立因素，且可能是靶向治疗获益的优势人群。因此，进一步研究非小细胞肺癌气阴两虚证的生物学内涵可为解决上述科学难题提供研究依据。针对非小细胞肺癌的科学研究表明，在蛋白、基因等各个分子层面均可找到能反映恶性肿瘤生物学特征的分子标记物，如驱动基因EGFR等及其相关的蛋白及miRNA等。基础研究表明，气阴两虚证的生物学内涵比较复杂，可能涉及免疫、炎症、肿瘤血管生成等多个内容。因此，将上述两者相结合并运用科学方法从中筛选出具有客观表征中医证型作用的分子标记物是科学可行的。目前，已有运用多组学技术探索中医证型生物学内涵的研究并发现了诸多分子标记物，但可表征非小细胞肺癌气阴两虚证的分子标记物的研究未见报道；人体的代谢产物、蛋白表达等因易受到疾病阶段、生活环境等较多因素的影响，其在表征中医证型上的特异性和准确性不足；而作为其上游的基因，其功能结构及表达具有较好的稳定性，可通过转录组第二代测序技术(RNA-Sequenc,RNA-Seq)进行检验，进而通过生信分析后有助于揭示特定疾病阶段的内在分子机制及发生发展的过程，也是目前探究中医证型生物学基础的重要技术手段。在此基础上，运用统计学方法及数学建模等方式，有助于将筛选得到分子标记物转化为客观量化非小细胞肺癌气阴两虚证的核心参数，有助于开展临床研究及推广。
发明内容
本发明针对目前肺腺癌气阴两虚证缺乏客观分子标记物的现状，作出了改进，提供了一种基因组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途及筛选及模型建立的方法，通过前期研究已证实，肺腺癌气阴两虚证是EGFR-TKIs的优势人群，其OS达到了21.9个月。进一步运用RNA-Seq技术表征了肺腺癌气阴两虚证患者、非气阴两虚证患者以及健康人群的单核白细胞的转录组，运用ROC曲线判定方法筛选得到了QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2等9个差异表达基因，经过PCR组外验证及分析后得到了两个特别显著基因SP1，EREG和三个一般显著基因QSOX1，KPNA4，SLC7A11，并以SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值作为自变量建立了逻辑斯蒂回归模型，实现了客观量化非小细胞肺癌气阴两虚证这一目标，并为临床推广提供了方法及检验核心参数，这一分子标记物组合的碱基序列及其在本领域中的合理变形，均属于本发明技术方案要保护的内容。
这9个基因的具体的碱基序列为：
GTGATTCCATCATGTATCCCAGGAG AGATGCACTGTCCATGCAAACAA
GGGCTTTGACAAACATTGCATC CCCACACTGCTTGCTCACAGA
GGCTATGTGCTGACAAATGTGG GGGCAACAAAGATCGGAACTG
AGGCTGGACACAGAGTCAGCAA GTGTGCATAGCCAAAGCGAGAA
GGATGCCCACTACCACGTCA TGCCAAACAGGCCATCCA
GCCTTGGGACCTGTGTGAA TCATTTGCCTGAGGTCACTCTG
TTGCACCAACCACTGCTAACAAG GTAGTGCAGTGCAGATTCCAGGTC
AATCTGTGTTGCCTCGGCTTC GATGTTGTAGCACTTGGCTTTGGA
TCACACGTTCGGATGAGCTACAG ATGAAGCGCTTAGGACACTCAGG
本发明是通过以下技术方案来实现的：
本发明公开了一种分子标记物组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途，分子标记物组合为QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM。
作为进一步地改进，本发明所述的分子标记物组合中，两个特别显著基因是SP1，EREG，三个一般显著基因是QSOX1，KPNA4，SLC7A11。
本发明还公开了一种表征肺腺癌气阴两虚证的分子标记物组合的筛选方法，包括如下步骤：
1)、获取样本的单核白细胞PBMCs：清晨收集空腹静脉血2-4ml，PBS与人外周血等体积混匀，加入等体积淋巴细胞分离液液面上，室温，离心，取中间白膜层，加入PBS洗去淋巴细胞分离液，重复两次后，计数并加入RPMI 1640完全培养基重悬备用；
2)、Trizol法提取PBMCs的总RNA，检测其纯度及完整性，完成质控；
3)、纯化提取的总RNA，破碎后，逆转录得到cDNA样本；
4)、移入PCR仪中经纯化后建立高通量测序的mRNA库，使用Qubit 2.0及
Figure BDA0002656783550000031
dsDNAHS Assay kit(Life Technologies,USA)对文库进行定量；使用Agilent 2100-DNA1000芯片(Agilent,Germany)对文库进行质检；
5)、将mRNA库经处理后得到的变性文库在Illumina Hiseq x-10上进行2×150bp的配端测序，用Hiseq Control软件控制；
6)、筛选分子标记物，得到QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM的分子标记物；
7)、通过PCR验证，得到两个特别显著基因SP1，EREG，和三个一般显著基因QSOX1，KPNA4，SLC7A11。
作为进一地改进，本发明所述的步骤6)中，筛选分子标记物依据最大的样本区分能力和最大的组间表达差异显著性和表达量相关性Pearson系数最低来这三大特性。
作为进一步地改进，本发明所述的最大的样本区分能力是指从检验数据中选取具有最大ROC曲线下面积的基因。
作为进一步地改进，本发明所述的最大的组间表达差异显著性，是指当两个基因具有相同的ROC曲线下面积，则优先选取组间差异p值较小的基因，确保候选标记物的抗检测误差的能力。
作为进一步地改进，本发明所述的表达量相关性Pearson系数最低是指选取与已选取标记物在所有样本中的表达量相关性Pearson系数低于0.50的基因，确保选取的多个候选标记物能够提供尽可能互补的信息。
作为进一步地改进，本发明所述的步骤7)中，经PCR验证后，根据重复样本间最大ct差值>1的标准来筛选得到五个基因。
本发明还公开了一种表征肺腺癌气阴两虚证的模型建立方法，使用SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值作为自变量，建立逻辑斯蒂回归模型；
Figure BDA0002656783550000041
Figure BDA0002656783550000042
Figure BDA0002656783550000043
Figure BDA0002656783550000044
Figure BDA0002656783550000045
其中b1，b2，b3，b4分别为SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值，Y为逻辑斯蒂的运算值，e为自然对数。
本发明的有益效果如下：
本发明通过RNA-Seq方法检验了肺腺癌气阴两虚证患者、非气阴两虚证患者以及健康人群的血液中单核白细胞上的转录组，其样本的测序深度中位数为79.09millionreads，最低为41.61million reads；经清理和去冗余后，与参考基因组的比对率中位数为89.94％，最低为82.00％。测序数据在每个样本中覆盖的基因中位数为12149，最低为10671，能较好地表征样本的转录组特征，论证了本方法科学性与可行性。从检验数据中选取具有最大ROC曲线下面积的基因，确保候选标记物具有最大的样本区分能力；若两个基因具有相同的ROC曲线下面积，则优先选取组间差异p值较小的基因，确保候选标记物的抗检测误差的能力；选取与已选取标记物在所有样本中的表达量相关性Pearson系数低于0.50的基因，确保选取的多个候选标记物能够提供尽可能互补的信息。从而选取并公开了一种以SP1、EREG、QSOX1、KPNA4、SLC7A等9个差异表达基因为组合的、具有客观量化肺腺癌气阴两虚证作用的表征方法与检验技术，于临床中推广则通过荧光定量PCR方法检测即可实现、操作简易快捷，并为临床中西医结合治疗肺腺癌提供更为丰富客观的研究依据。
本发明对筛选得到的分子标记物进行了组外样本PCR验证，进一步发现了两个特别显著基因SP1，EREG(p<0.0005)，三个一般显著基因QSOX1，KPNA4，SLC7A11(p<0.05)，使用上述基因的PCR相对表达量，并以SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值(记作b1，b2，b3，b4)作为自变量，建立了逻辑斯蒂回归模型用于客观量化非小细胞肺癌气阴两虚证，经检验，发现组样本AUC＝0.780，组外验证样本AUC＝0.706，证明该模型用于表征气阴两虚证结论稳定可靠，明显优于简单罗列几个基因表达的表征形式，得到了深入研究与临床推广中医证型的核心参数，具有普适性和科学性，并可基于此设计与构建检验试剂盒运用于临床检验、实验研究及推广应用等。
本发明较现有的临床常规检验水平深入一个层次，临床检验为白细胞水平，本发明选用单核白细胞，准确性更优，可反映机体免疫情况，目前并没有相关临床报道。
本发明筛选得到了客观的分子标记物，证明了中医证型存在客观生物学基础。
本发明建立了一套辅助提高医师主观判断准确性、具有高准确度、高一致性的标准化肺腺癌气阴两虚证的工具，为后续研发检验试剂盒等转化提供研究基础与核心操作参数，同时为肺腺癌气阴两虚证的辨证论治提供临床辅助工具，提升中医药治疗的科学内涵，促进中医、中西医结合防治肺癌水平的提升。
附图说明
图1是RNA-Seq表征发现组肺腺癌气阴两虚证、肺腺癌非气阴两虚证PBMC的转录组后经筛选得到的10个差异表达基因及其相应的基因表达量；
图2是发现组肺腺癌气阴两虚证10个差异表达基因的ROC曲线及相应的AUC值；
图3是PCR组外验证后得到的肺腺癌气阴两虚证的9个分子标记物及其在发现组、验证组中相应的基因表达量；
图4是PCR组外验证的肺腺癌气阴两虚证9个分子标记物的ROC曲线及相应的AUC值；
图5是实施例中发现组肺腺癌气阴两虚证的逻辑斯蒂回归模型的AUC值；
图6是实施例中组外验证肺腺癌气阴两虚证的逻辑斯蒂回归模型的AUC值。
具体实施方法：
下面通过具体实施例，结合说明书附图对本发明的技术方案作进一步地说明：
本发明公开了一种基因组合用于表征肺腺癌气阴两虚证的用途，基因组合为QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM，其中两个特别显著基因是SP1，EREG，三个一般显著基因是QSOX1，KPNA4，SLC7A11。
本发明还公开了一种表征肺腺癌气阴两虚证的基因组合的筛选及模型建立的方法，包括如下步骤：
1)、获取样本的单核白细胞PBMCs：清晨收集空腹静脉血2-4ml，PBS与人外周血等体积混匀，加入等体积淋巴细胞分离液液面上，400g，室温，离心30min，取中间白膜层，加入10倍体积PBS洗去淋巴细胞分离液，重复两次后，计数并加入RPMI 1640完全培养基重悬备用；
2)、Trizol法提取PBMCs的总RNA，检测其纯度及完整性，完成质控；
3)、纯化提取的总RNA，破碎后，逆转录得到cDNA样本；
4)、移入PCR仪中经纯化后建立高通量测序的mRNA库，使用Qubit 2.0及
Figure BDA0002656783550000061
dsDNAHS Assay kit(Life Technologies,USA)对文库进行定量；使用Agilent 2100-DNA1000芯片(Agilent,Germany)对文库进行质检；/>
5)、将mRNA库经处理后得到的变性文库在Illumina Hiseq x-10上进行2×150bp的配端测序，用Hiseq Control软件控制；
6)、筛选分子标记物，得到QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM的分子标记物；
7)、通过PCR验证，得到两个特别显著基因SP1，EREG，和三个一般显著基因QSOX1，KPNA4，SLC7A11。
具体包括如下步骤：
1)、收集单核白细胞PBMC：
运用抗凝采血管抽取肺腺癌气阴两虚证患者的清晨空腹静脉血2ml；
将抗凝血样与PBS溶液等体积稀释混匀；
按1:0.5-1(稀释血液：淋巴细胞分离液)比例，将稀释后血液缓慢加入装有淋巴细胞分离液(Ficoll)的离心管；
将离心机的升速与降速调至最低，20℃，400g/min离心30min；离心结束后，用1000ul枪头吸取中间白膜层于新的50ml离心管，加入3-4倍体积的无菌PBS溶液，颠倒混匀后300g/min离心10min，弃上清。细胞沉淀加无菌PBS溶液5ml-10ml混匀，取10ul细胞悬液计数后300g/min离心10min，弃上清；
加入适量的无血清冻存液于离心管中，使细胞浓度约为1-5×106cells/ml，缓慢混合均匀，制成细胞混合液；
将离心管中的细胞混合液分装于已标示完全的冻存管中，放入-80℃冰箱保存。
2)、提取RNA：
于4℃离心机中已经预冷的研钵的中倒入适量冷却液，加入样本研磨，将研磨好的样品在冷却液中暂存；
加入提取试剂，剧烈混匀，瞬时离心，室温孵育，随即向离心管中加入萃取试剂，涡旋混匀；
离心，取上清，转移到新管，加相容试剂，颠倒混匀；
沉淀后离心，弃上清，漂洗试剂漂洗一遍，室温晾干，加入R-f-w溶解；
移至冰盒上，运用Nanodrop定量检测RNA纯度，Qubit精确定量，凝胶电泳检测RNA完整性。(质控合格标准：A.OD260/OD280介于1.8～2.2之间，B.OD260/OD230≥2.0，C.RIN≥7，D.28S:18S≥1.0)。
3)、纯化RNA：
提取Total RNA样本，进行孵育；
取出反应管，加入Buffer R2，轻弹混匀，瞬时离心；
加入250ul ethanol(96-100％)，枪头混匀；
转移样本至离心柱，离心15s，弃掉废液；
加入500ul Buffer R3，离心15s，弃掉废液；
转移离心柱至新的收集柱，离心1min；
转移离心柱至新的1.5ml离心管，使用10ul移液器环吸，敞口室温干燥3min；
加入30ul RNase-Free Water，室温放置3min，10000rpm离心1min，离心结束后，弃掉RNeasy Mini spin column，逆转录得到cDNA，放置备用。
4)、建立高通量测序的mRNA库：
O-Beads经试剂漂洗后重悬，加入cDNA，混匀；
转移至PCR仪中，室温，孵育；
弃上清，洗涤2遍，加T-Buffer，混匀；
移至PCR仪中，运行结束后，加入B-Buffer，室温孵育；
弃上清，洗涤磁珠，加入B-mix，转移上清至新管中，加入F-Mix，混匀，运行程序，结束后瞬时离心，将MIX 1和MIX 2加入含有产物的PCR管中，轻弹混匀，瞬时离心，将PCR管转移至PCR仪中，运行程序，结束后补ddH2O，加X-Beads，纯化；
将纯化产物中加入A-Mix，移至PCR仪上进行纯化；
将L-mix加入所得产物中，混匀，移至PCR仪上，进行纯化和筛选；
将P-mix加入上步所得产物中，混匀，移至PCR仪上，进行纯化；
使用Qubit 2.0及
Figure BDA0002656783550000081
dsDNAHS Assay kit(Life Technologies,USA)对文库进行定量；
使用Agilent 2100-DNA 1000芯片(Agilent,Germany)对文库进行质检。
5)、高通量测序：
使用10mm/LpH 8.5的Tris-HCl将文库标准化为所需的混合文库浓度，将每种浓度≥1nm/L的标准化文库分别取适量装入一个新的微量离心管中，向混合后的标准化文库注入1％未变性PhiX，用0.2M/LNaOH溶液使混合文库和PhiX对照品变性。将变性文库装入文库试管，装入簇生成夹盒；
于2℃至6℃条件下取出新的流动槽包装，置于室温下10-15分钟；
将准备好的夹盒装入试剂冷却器抽屉中放入指定位置；
将装有已取下管帽的文库试管的簇生成夹盒放入指定位置。将抽屉滑入冷却器，然后关闭试剂冷却器门。于测试仪界面选择双流动槽运行；
连接到Illumina测序适配器上，PCR扩增，在Illumina Hiseq x-10上进行2×150bp的配端测序，用Hiseq Control软件(HCS)控制。
6)、筛选分子标记物：
计算每个基因区分气阴两虚证与非气阴两虚证的ROC曲线下面积。在表达差异显著的基因中首先选取具有最大ROC曲线下面积的基因。为保证选取的多个候选标记物能够提供尽可能互补的信息，仅选取与已选取标记物在所有样本中的表达量相关性Pearson系数低于0.50的基因。采用每个基因相对GAPDH的表达量作为选取分子标记物的依据。图1是RNA-Seq表征发现组肺腺癌气阴两虚证、肺腺癌非气阴两虚证PBMC的转录组后经筛选得到的10个差异表达基因及其相应的基因表达量；图2是发现组肺腺癌气阴两虚证10个差异表达基因的ROC曲线及相应的AUC值；基于以上步骤，筛选出QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2等10个气阴两虚证的分子标记物。
7)、PCR验证：
使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取Total RNA；
使用RT试剂盒(TaKaRa，中国大连)使RNA逆转录为cDNA；
使用SYBR Green master mix(TaKaRa)进行聚合酶链反应(PCR)；
我们使用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)和U6作为内参；
mRNA水平分析比较2-ΔΔCt方法。
图3是PCR组外验证后得到的肺腺癌气阴两虚证的9个分子标记物及其在发现组、验证组中相应的基因表达量；
图4是PCR组外验证的肺腺癌气阴两虚证9个分子标记物的ROC曲线及相应的AUC值；
经验证后，根据重复样本间最大ct差值>1的标准，在气阴两虚的9个分子标记物中(1个无法转录，予以舍弃)，得到两个特别显著基因SP1，EREG，三个一般显著基因QSOX1，KPNA4，SLC7A11(差异检验方法：wilcoxon rank-sum test检验，使用SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值，记作b1，b2，b3，b4作为自变量，建立逻辑斯蒂回归模型。
Figure BDA0002656783550000101
Figure BDA0002656783550000102
Figure BDA0002656783550000103
Figure BDA0002656783550000104
Figure BDA0002656783550000105
其中b1，b2，b3，b4分别为SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值，Y为逻辑斯蒂的运算值，e为自然对数。
图5是实施例中发现组肺腺癌气阴两虚证的逻辑斯蒂回归模型的AUC值，为0.780；
图6是实施例中组外验证肺腺癌气阴两虚证的逻辑斯蒂回归模型的AUC值，为0.706；
其经运算验证，发现样本组中AUC＝0.780，验证样本组中AUC＝0.706。Abu代表abundance，指测序得到的基因的PCR相对表达量，AUC值是评估标记物的一个业界标准，AUC值越接近1，说明标记物的区分力越强；根据AUC的值来确定是否选择该分子标记物；逻辑斯蒂模型的AUC值越高，表示该模型的运算结果更为准确。
以上为本发明的优选实施方式，本发明不局限于以上内容，本领域技术人员在不脱离本发明的精神和构思的额前提下直接导出的或联想到的其他改进和变化，均应认为包含在本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种分子标记物组合在制备用于表征肺腺癌气阴两虚证产品的用途，其特征在于，所述的分子标记物组合为QSOX1、FLJ20021、IFITM5、SP1、HRASLS2、EREG、KPNA4、SLC7A11、RIPK4、OCLM。
2.根据权利要求1所述的分子标记物组合在制备用于表征肺腺癌气阴两虚证产品的用途，其特征在于，所述的分子标记物组合中，两个特别显著基因是SP1，EREG，三个一般显著基因是QSOX1，KPNA4，SLC7A11。
3.一种表征肺腺癌气阴两虚证的模型建立方法，所述方法用于非诊断治疗目的，其特征在于，使用SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值作为自变量，建立逻辑斯蒂回归模型；
Figure FDA0004183612860000011
Figure FDA0004183612860000012
Figure FDA0004183612860000013
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Figure FDA0004183612860000015
其中b1，b2，b3，b4分别为SP1/KPNA4、SP1/QSOX1、SP1/SLC7A11、SP1/EREG的对数值，Y为逻辑斯蒂的运算值，e为自然对数，Abu代表abundance，指测序得到的基因的PCR相对表达量。
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