CN111979143A - 一株溶杆菌新菌种及其生产应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株溶杆菌新种A6，该菌株于2018年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018905。该株溶杆菌新种A6可产明胶水解酶和β‑半乳糖苷酶，可应用于食品工业、生化制药业和饲料生产业等行业，具有广阔的市场应用前景。

Description

一株溶杆菌新菌种及其生产应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一株溶杆菌新菌种及其生产应用。
背景技术
溶杆菌属的分离源十分广泛，包括土壤、河流、深海热泉、缺氧低氧环境等。1978年，由Christensen和Cook分离得到溶杆菌并阐明其分类地位。溶杆菌属现隶属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，溶杆菌目(Lysobacterales)，溶杆菌科(Lysobacteraceae)。该属菌株的细胞呈杆状或细丝状单细胞，两端钝圆，无鞭毛，辅酶Q8为唯一或主要的呼吸醌。
多相分类的概念最初由Colwell于1970年提出，是指利用微生物多种不同的信息，包括表型、基因型与系统发育的信息，综合研究微生物分类和系统进化的过程。其中DNA同源性分析是确定正确的分类地位的最直接的方法，而DNA-DNA杂交可以在总体水平上研究微生物间的关系，用于种水平上的分类学研究。1987年，国际系统细菌学委员会(International Committee on Systematic Bacteriology,ICSB)规定，DNA同源性≥70％为细菌种的界限。2018年，众多学者发表在International Journal of Systematic andEvolutionary的文章指出，可利用ANI(average nucleotide identity)与dDDH(digitalDNA-DNA hybridization)取代传统的DNA杂交手段，表示不同菌株在基因水平上的差别。
微生物种类丰富，长期以来，人们利用各种培养技术对环境中的微生物进行分离鉴定与开发利用，随着科学技术的发展，微生物资源在科技研究及生物产业中的重要性日益凸显。溶杆菌具有高效抗菌活性和植物病害防治潜力，是有较强抗逆能力的细菌，在环境污染治理方面也具有广泛的应用前景，同时可产生多种酶类物质，如碱性磷酸盐酶，淀粉酶，明胶水解酶等，可为工业，食品，医药和农业等行业应用提供菌种资源。
发明内容
本发明的目的在于为多行业提供更为丰富的菌种资源，提供一株可产明胶水解酶和β-半乳糖苷酶的溶杆菌新菌种。
本发明的技术方案为：本发明所述的一株溶杆菌新种A6已经于2018年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2018905。
该株溶杆菌新种A6分离自河南省南阳市镇平县农田土壤中。
该株溶杆菌新种A6为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，无鞭毛，在R2A固体培养基上恒温培养，菌落边缘整齐，凸起,光滑，粘稠，不透明，黄色。
该株溶杆菌新种A6的最适生长温度为30℃，最适生长pH＝7.0，最适生长NaCl浓度为2％。
该株溶杆菌新种A6可产明胶水解酶和β-半乳糖苷酶，可应用于食品工业、生化制药业和饲料生产业。
本发明的有益效果是：
分离得到新菌株Lysobacter zhenpingensis.A6隶属于γ-变形菌纲(Gammaproteobacteria)，溶杆菌目(Lysobacterales)，溶杆菌科(Lysobacteraceae)溶杆菌属的一株新种，可产明胶水解酶和β-半乳糖苷酶，可应用于食品工业、生化制药业和饲料生产业等，具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是菌株A6在R2A平板上的纯培养菌落图；
图2是菌株A6的16S rRNA序列图；
图3是基于16S rRNA基因序列的菌株A6的系统发育树；
图4是菌株A6与菌株DS-58T，KVB24T在生理生化特征上的差异比较图；
图5是菌株A6的极性酯双向薄层层析图谱；
图6是菌株A6与菌株DS-58T，KVB24T的脂肪酸分析(％)比较图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
供试土壤及培养基
供试土壤来自河南省南阳市镇平县农田土壤
MSM基础盐培养基(g/L)：NaCl 1.0，(NH4)2SO41.0，K2HPO4 1.5，KH2PO4 0.5，MgSO40.2，酵母膏0.1，pH值7.0-7.5，121℃灭菌30min。
R2A培养基(g/L)：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酪蛋白0.5，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸钠0.3，K2HPO4 0.3，MgSO4 0.05，固体培养基加入1.5％的琼脂粉，115℃灭菌30min。
1、实验方法
1.1菌株A6的分离与筛选
取适量土壤样品(约10g)，加入到100mL MSM基础盐培养基中，30℃，200rpm振荡培养1h。吸取100μL至无菌水中，稀释至适当浓度后，涂布于R2A固体培养基平板上，30℃培养3d，待平板上出现单菌落。分离得到一株细菌，初步鉴定为溶杆菌属(Lysobacter)，命名为A6，后续对其进化关系和分类地位进行鉴定。
1.2菌株A6的分类鉴定
1.2.1菌落特征观察
将菌株A6划线于R2A固体培养基上，30℃培养3d，观察其菌落特征，包括大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等。
1.2.2菌株A6的生长特性
挑取在R2A固体培养基上培养3d的新鲜单菌落，接种至R2A液体培养基，30℃摇床培养24h，作为种子液。
将所培养的A6种子液按1％(v/v)的比例转接至新鲜的R2A液体培养基中，混匀。分别置于4℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、37℃、42℃摇床培养3d，测定其生长情况(OD600)。
调节R2A培养基中氯化钠浓度，分别为0.0％、1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％和6.0％，按1％(v/v)的比例转接种子液至培养基中，30℃摇床培养3d，测定其生长情况(OD600)，研究NaCl浓度对A6生长的影响。
调节R2A培养基的pH值，分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，按1％(v/v)的比例转接种子液至培养基中，30℃培养3d，测定生长情况(OD600)，探究pH对菌株A6生长的影响。
1.2.3菌株A6的16S rRNA基因序列的扩增、测序及系统发育树的构建
利用16S rRNA基因扩增通用引物(27f 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r 5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)，以菌株A6的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL：2×PCR Mix25μL，27f和1492r各1μL，DNA模板1μL，加超纯水至50μL。
反应程序如下：
Figure BDA0002616619870000041
PCR回收试剂盒回收16S rRNA基因片段，送往南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序分析，并通过在线比对(www.ezbiocloud.net)，构建系统发育进化树。
1.2.4菌株A6的生理生化特性
根据《常见细菌系统鉴定手册》和《Bergey’s Manual of DeterminativeBacteriology》，结合API 20E，API ZYM和Biolog GENIII的结果，对菌株的生理生化特性进行分析和鉴定。
其中API 20E试条由20个含干燥底物的微量小管组成。将菌悬液接种到管内，使小管内底物溶解。孵育过程中，所产生的代谢产物通过自发反应或加入附加试剂后而变色。鉴定结果可根据说明书的判读表进行读出，也可参照生化谱检索手册或鉴定软件，得到鉴定结果。
API ZYM是一个半定量的微量方法系统，专为研究酶活所设计的。该技术对各种标本(组织、细胞、生物体液、洗涤水、土、油，等)都适用。它可系统和快速地研究19种酶的活性。用样量极少。
Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司研制开发的新型自动化快速微生物鉴定系统，以细菌对微平板上95种碳源的利用情况为基础从而进行微生物鉴定。
1.3化学分类学分析
1.3.1脂肪酸分析：
Reagent#1(皂化试剂)：45g氢氧化钠(分析醇)溶于150mL甲醇(Methanol，HPLC级)及150mL去离子蒸馏水中，将水与甲醇混合，搅拌过程中加入氢氧化钠，直至氢氧化钠颗粒完全溶解；
Reagent#2(甲基化试剂)：325mL 6N盐酸，275mL甲醇(Methanol，HPLC级)，在搅拌过程中将酸加入甲醇中；
Reagent#3(提取试剂)：200mL正己烷(Hexane，HPLC级)，200mL甲基正丁醚(Methyl-tert Butyl Ether，HPLC级)乙醚混合均匀，将甲基正丁醚加入正己烷中并搅拌。
Reagent#4：10.8克氢氧化钠，900mL去离子蒸馏水，搅拌过程中加入氢氧化钠，直至完全溶解；
Reagent#5：饱和氯化钠溶液，加40g分析纯氯化钠于100mL重蒸水中。
脂肪酸的提取过程包括5个步骤：
(1)菌体收集：用接种环从培养基表面刮取适量培养物，置于螺口玻璃管中；
(2)皂化(裂解细胞以使脂肪酸从细胞质中释放出来)：加入1mL Reagent#1，振荡5-10s，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5-10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min；
(3)甲基化(形成脂肪酸甲基脂)：待样品管冷却后，加入2mL Reagent#2，盖严振荡5-10s，随后精确控制80℃水浴10min，冰浴冷却；此步骤需严格控制温度和时间，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏；
(4)提取(脂肪酸甲基脂从水相转移到有机相)：在冷却的样品管中加入1.25mLReagent#3，慢慢振荡10min左右，加2-3滴饱和氯化钠溶液，弃下层水相；
(5)碱洗在剩余有机相中加入3mL Reagent#4，慢慢振荡5min左右，加几滴饱和氯化钠溶液(目的是使分层更明显)，取三分之二上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。
使用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器(FID)及HP气相色谱化学工作站(HP CHEMSTATION ver A 5.01)；色谱柱为Ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，以5℃/min的速率升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2μL；检测器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气(氮气)流速30mL/min。校准标样(Calibration standard)为MIDI,Inc.提供的MIDI Calibration Mix 1。
1.3.2呼吸醌测定：
(1)菌体的收集制备
待测菌株用液体培养基培养，离心收集菌体，用蒸馏水洗涤两次，菌体于-80℃冷冻3d，冷冻干燥机抽干菌体，冻干菌体4℃干燥器保存备用。
(2)醌的提取及纯化
取冻干菌体约100mg，加入V氯仿：甲醇＝2：1的混合溶液40mL，在黑暗处磁力搅拌10h左右。在黑暗处用滤纸过滤收集滤液，40℃减压旋转薄膜蒸发至干，用少量(1mL)丙酮重新溶解干燥物，长条状点样于GF254硅胶板上(青岛海洋化工厂分厂，100×200mm)，硅胶板事先65℃活化0.5h。同时在一端点VK做对照。以甲苯作展层剂展层约20min。取出风干后在254nm紫外灯下观察，在绿色萤光背景下呈暗褐色的带即为泛醌位置，Rf＝0.4～0.5。刮下目的条带，用1mL丙酮溶解，然后用含脱脂棉的1mL枪头去硅胶，收集滤液(可适当浓缩至200μL-300μL)，即得醌组分的丙酮溶液。置于4℃，黑暗处保存。
(3)HPLC测定呼吸醌组分
用反相高效液相色谱分析法测定呼吸醌。高效液相色谱仪为Agilent公司产，反相高压液相柱为十八烷基硅烷(ODS 5μm，250×4.6mm id)，进样量一般为10μL，流动相为甲醇(分析纯)：异丙醇(分析纯)＝2:1溶液，流速为1.0mL/min，柱温40℃，240nm和270nm紫外检测，使用Agilent Chemstation软件完成测定并记录数据。
(4)结果分析
根据标准条件下不同醌组分与洗脱时间的关系，结合参照对照菌株，分析实验菌株的醌类型。
1.3.3极性酯分析：
(1)收集菌体；
(2)磷酸类脂的提取：称取100mg冻干菌体放入1mL的0.3％NaCl研磨10min，用10mL甲醇将磨碎的菌体洗入到50mL的耐有机溶剂螺口离心管中。沸水浴加热5min，再加入3mL0.3％NaCl溶液和5mL氯仿，上下颠倒5min。4000rpm离心5min弃去细胞残渣和上层水相，收集氯仿层。加入5mL 0.3％NaCl溶液和5mL氯仿。上下颠倒5min，4000rpm离心5min，收集氯仿层。45℃减压蒸馏，干燥物即为磷酸类脂，将干燥的极性脂重新溶于约0.1mL氯仿/甲醇(2:1，v/v)中，备用。
(3)点样、展层分离：用毛细管点样于10cm×10cm硅胶板的一角(型号为Art 5554，DC-AlufolienKieselgel 60F 254，Merck)，距离硅胶板下缘及左边边缘均1cm。第一向展层剂层析约25min。取出硅胶板，晾干后将硅胶板旋转90度，使用第二向展层剂层析约30min，晾干后显色。
(4)显色
配制下列显色液：
A：Dragendorff试剂(D试剂)。溶液A：次硝酸铋1.7g溶于100mL 20％冰醋酸中。溶液B：碘化钾40g溶于100mL蒸馏水中。将3.5mL溶液A依次加5mL溶液B，20mL冰醋酸和50mL蒸馏水后即为D试剂。
B：Ninhydrin试剂(N试剂)。0.4g茚三酮溶于100mL水饱和正丁醇。
C：Anisaldehyde试剂(A试剂)。270mL 95％乙醇，15mL浓硫酸，15mL p-茴香醛，3mL冰醋酸。
D：Dittmer and lester试剂(P试剂)。溶液A：称取1.6g钼酸铵溶于12mL水中。溶液B：在4mL浓盐酸中加入1mL液体汞和8mL溶液A，混匀，摇动30min，过滤。液体汞在移取过程中如果泄露，应立即用单质硫(硫磺)覆盖。在剩余的溶液A中加入20mL浓硫酸和全部的溶液B，冷却、4度保存(储存液为亮绿色，稳定性不明)。用前，将储存液：水以1：3(v/v)的比例稀释，配成的显色剂为琥珀色。如需剧烈染色，可在100mL喷显剂中加入2.5mL浓硫酸。
E：磷钼酸试剂：磷钼酸10g溶解于95％的乙醇中。D试剂显色，不需加热，对PC、PE、PME特异性显色，在黄色的背景上呈现桔黄色的斑点。N试剂显色，需60-70℃加热4-5min，PE、PME与某些含葡萄糖胺未知结构的磷酸类脂显红色。A试剂显色，65-70℃加热10-15min，此条件下显黄绿色斑点的为含糖的磷酸类脂或PIMS。P试剂显色不需加热，所有的磷酸类脂和P试剂均显蓝色。磷钼酸试剂显色：70℃加热5-15min，所有极性脂在黄绿色背景上呈现灰褐色斑点
提取菌株A6基因组DNA，并通过文库构建、库检、上机测序、生物信息学分析，得到菌株的基因组序列，并与菌株DS-58T进行Average Nucleotide Identity(ANI)和digitalDNA-DNA hybridizations(dDDH)数据分析。
1.4菌株A6的保藏信息
菌株A6已于2018年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为：CCTCC NO：M2018905，该菌株的分类命名是Lysobacterzhenpingensis.A6。
1.5 A6菌剂的制备与应用
将R2A固体培养基上的A6单菌落接种至R2A液体培养基，培养至对数中期，作为种子液备用。发酵罐500升，投料量400升，发酵培养基为R2A液体培养基。投料完毕后115℃高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升发酵罐，接种后的发酵罐温度控制在25℃，30℃，35℃，培养过程中无菌空气的通气量分别为1:0.4，1:0.6，1:0.8，搅拌速度分别为150，180，200转/分。整个工艺流程培养时间为72h。发酵结束后测定明胶酶和β-半乳糖苷酶的活性。
利用含底物SDS-PAGE检测明胶酶活性：分离胶8％，含明胶2g/L(w/v)，浓缩胶5％。取上述发酵液(超声波破碎菌体细胞)与等体积的2×SDS非还原加样缓冲液(100mmol/LTris-HCl，pH 6.8，4％SDS，0.2％溴酚蓝，20％甘油)在室温下混匀后直接点样，4℃条件下恒压120V电泳至溴酚蓝走至凝胶底部，约2h，电泳结束后，凝胶置2.5％Triton X-100中漂洗15min×2次，浸入反应缓冲液(50mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50mmol/L NaCl，10mmol/LCaCl2)，37℃孵育9h，取出凝胶，用0.5％考马斯亮蓝R250染色0.5h，脱色液(30％甲醇，10％乙酸)脱色至蓝色背景下显现出清晰的白色条带为止。显影条带经数码成像系统输入计算机进行分析定量。
β-半乳糖苷酶的活性的检测：取1mL待测酶液加入10mL的具塞比色管中，37℃恒温水浴，平衡15min，快速加入5.0mL ONPG(邻-硝基酚-β-D-半乳糖苷)底物溶液，加盖颠倒混匀。在37℃恒温条件下，精确反应10min后，迅速加入2.0mL碳酸钠溶液，晃动混合，静置。将添加ONPG底物和碳酸钠溶液的顺序颠倒，其余步骤与样品处理方式相同，作为空白对照。在30min内，用1cm的石英比色皿，在420nm处测定样品试验液和空白液的吸光度。样品试验液和空白液的吸光度之差即△A，将△A带入标准曲线线性回归方程计算试验液中邻硝基苯酚的浓度。
2、实验结果
菌株A6为革兰氏阴性菌，严格需氧。细胞呈杆状(0.4-0.7μm×1.8-2.2μm)，两端钝圆，无鞭毛，无运动性，不产孢子。在R2A固体培养基上，30℃培养4d后，菌落直径为0.8-1.5mm，边缘整齐，凸起，光滑，粘稠，不透明，黄色(图1)。
菌株A6生长发生在10-37℃，最适温度为30℃。菌株可以在pH＝6.0-8.0，最适pH＝7.0，0-2％NaCl，最适2％NaCl的条件下生长。
菌株的氧化酶阳性、过氧化氢酶阴性，酪蛋白和明胶水解阳性，吐温20、吐温80、淀粉水解、黄嘌呤、次黄嘌呤、酪氨酸的水解呈阴性，H2S产生、VP实验为阴性，明胶水解为阳性。碱性磷酸盐酶、类脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖甙酶呈阳性，酯酶(C4)、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶呈弱阳性，类脂酶(C14)、α-半乳糖甙酶、α-葡萄糖甙酶、β-葡萄糖甙酶、N-乙酰-葡萄糖胺酶、α-甘露糖甙酶、β-岩藻糖甙酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、色氨酸脱氨酶、脲酶呈阴性。D-葡萄糖、D-甘露醇、肌醇、D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁苷、L-阿拉伯糖发酵均为阴性，可以利用葡糖醛酰胺、四唑蓝、亚碲酸钾为碳源进行生长。
以菌株A6的基因组DNA为模板，16S rRNA基因通用引物为引物进行PCR扩增，得到总长为1568bp的基因序列。将该序列在EzBioCloud数据库(https://www.ezbiocloud.net)中进行比对，结果表明菌株A6与Lysobacter属的亲缘关系最近，其中与Lysobacterdokdonensis DS-58T的16S rRNA序列相似度最高，达到99.45％，与Lysobactercaseinilyticus KVB24T的序列相似度为98.57％，与其他菌株的相似度均低于97％。通过Neighbor-Joining法构建菌株A6的系统进化树(图3)表明，菌株A6位于Lysobacter属进化分支内部，并与Lysobacter dokdonensis DS-58T与Lysobacter caseinilyticus KVB24T构成了一个亚分支。因此，本研究以菌株Lysobacter dokdonensis DS-58T和Lysobactercaseinilyticus KVB24T作为参比菌株，与A6进行比较分析，其在生理生化特征上的差异如图4所示。
根据实验结果，菌株A6的呼吸醌为Q-8，G+C％为67.2％，极性酯包括二磷脂酰甘油(DPG)，磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰乙醇胺(PE)(图5)。
菌株A6与DS-58T，KVB24T在脂肪酸组成上的差异如图6所示。可知菌株A6的脂肪酸组成(>5％)主要包括iso-C16:0(25.8％)，iso-C15:0(19.9％)，Summed feature 9(17.3％)以及Summed feature 3(6.3％)，虽然在个别脂肪酸的组成和含量上有所差别，但是符合Lysobacter属脂肪酸的特征。此外，Average Nucleotide Identity(ANI)是在核酸水平，两两基因组之间所有直系同源蛋白编码基因的相似性，常用于研究基因组之间的进化距离。相较于传统的DNA-DNA hybridization(DDH)，ANI指标计算简单省时，且ANI指标有助于构建结构性数据库，方便生物信息学者的后续研究。相较于传统的DNA杂交数值(DDH)，digital DNA-DNA hybridizations(dDDH)能更真实反应不同菌株之间基因组的差异。本实验中菌株A6与模式菌株DS-58T的ANI为82.67％，低于新种临界值95％，dDDH为26.2％，远低于临界值70％。结合菌株A6的系统发育关系，生理生化特征以及化学分类特征，将菌株A6归于Lysobacter属的一株新种，命名为Lysobacter zhenpingensis.A6T。
API ZYM酶学实验以及菌株发酵液中均检测到明胶水解酶和β-半乳糖苷酶活性。其中明胶水解酶可在一定的温度和pH条件下对各类动物蛋白进行水解，能把动物蛋白通过控制水解度，从而达到大分子蛋白质分解，得到需要的多肽、小肽、氨基酸产物，使产品的得率、溶解性、风味、口感达到新的产品等级，可广泛制成各种品质优良的食品工业原料、生化制药与饲料。
β-半乳糖苷酶属于糖苷水解酶，在食品加工方面有着重要应用：1、解决乳糖不耐受患者的乳品消费问题，世界上平均约70％～90％的成年人(尤其是亚洲和非洲人)喝牛奶后会因缺乏β-半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而产生乳糖不耐受，我国乳糖不耐受症的发生率为90％左右。用β-半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖，可将乳糖含量降低70％～80％，解决乳糖不耐受患者的乳品消费问题；2、用于提高乳制品的甜度，乳糖的甜度较低，只有蔗糖的20％，依靠β-半乳糖苷酶水解后1分子乳糖生成1分子葡萄糖和1分子半乳糖，可以明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量；3、防止乳制品冷冻时出现结晶，乳糖的溶解度较低，在制作冷冻乳制品时容易结晶析出，影响产品质量。在加工中添加25％～30％的乳糖水解酶，可防止这类问题的出现；4、生产低聚半乳糖，低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖为底物，经β-半乳糖苷酶催化生成的，低聚半乳糖的甜度为蔗糖的20％～40％，热稳定性较好，在酸性条件下也是如此，可作为双歧杆菌增殖因子，促进钙质吸收和有机酸生成、降低肠道pH、抑制外源菌生长和改善脂质代谢；5、应用于发酵乳制品，用β-半乳糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脱脂乳制备酸乳可以缩短乳凝固时间约15％～20％，且节省蔗糖用量，能改善酸乳的风味和口感。另外，由于乳酸菌生长快，菌数多，还能延长酸乳的货价期。6、应用于乳清加工，乳清中含有乳清蛋白、乳糖、矿物质和维生素等营养成分，其中乳清蛋白是完全蛋白质。世界年产乳清约为9×107吨，其中50％当废水排放，不仅造成浪费，而且污染环境。用β-半乳糖苷酶将乳清中的乳糖水解，可去除乳清浓缩时乳糖结晶析出给加工带来的不便。另外，用此水解物还可生产乳清饮料、糖浆和食品添加剂等。
Lysobacterzhenpingensis.A6在500升发酵罐中进行发酵量产，当发酵温度为30℃，无菌空气通气量为1:0.6，搅拌速度180转/分，培养72h时，发酵液中明胶酶的活性最高，达到0.21U/mL。而在发酵温度30℃，无菌空气通气量为1:0.8，搅拌速度200转/分条件下，培养72h，β-半乳糖苷酶活性最高，达到0.33U/mL
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (5)

1.一株溶杆菌新种A6，其特征在于，该菌株于2018年12月17日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为位于中国武汉的武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2018905。
2.如权利要求1所述的一株溶杆菌新种A6，其特征在于，该株溶杆菌新种A6分离自河南省南阳市镇平县农田土壤中。
3.如权利要求1所述的一株溶杆菌新种A6，其特征在于，该株溶杆菌新种A6为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，无鞭毛，在R2A固体培养基上恒温培养，菌落边缘整齐，凸起，光滑，粘稠，不透明，黄色。
4.如权利要求1所述的一株溶杆菌新种A6，其特征在于，该株溶杆菌新种A6的最适生长温度为30℃，最适生长pH＝7.0，最适生长NaCl浓度为2％。
5.如权利要求1-4中任一项所述的一株溶杆菌新种A6在食品工业、生化制药业和饲料生产业中的应用，其特征在于，该株溶杆菌新种A6可产明胶水解酶和β-半乳糖苷酶。
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