CN104371942A - 一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用 - Google Patents

一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株可降解石油烃的溶杆菌——海连溶杆菌2-5，及其在微生物降解石油烃中的应用。海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏编号CGMCC No.7164。本发明的海连溶杆菌2-5是溶杆菌属的新菌种，分离自石油污染的海绵样品，能够有效降解石油烃并利用石油作为生长的唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃（初始浓度为1000mg/L）的平均降解率为67.8%。本发明的海连溶杆菌2-5可用于石油烃的降解。

Description

一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株可降解石油烃的溶杆菌及其应用。 
背景技术
随着石油工业的迅速发展，人们越来越多地涉及海上石油开发，因此，井喷、运输船舶的石油泄漏、撞船、沉船以及输油管道的泄漏等事故，造成的海上溢油事故也时有发生，严重污染了海洋环境，给海洋的生态平衡带来了极大危害。因此，需要采取及时有效的措施对石油污染进行迅速处理。而目前公认的处理海洋石油污染最环保的方法就是利用微生物降解石油。据统计已经发现能够降解石油的微生物超过了200多种，在海洋环境石油烃降解占主导地位的微生物主要包括：无色杆菌属（Achromobacter）、不动杆菌属（Acinetobacter）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、芽孢杆菌属（Bacillus）、黄杆菌属（Flavobacterium）、棒杆菌属（Coryneforms）、微杆菌属（Microbacterium）、放线菌属（Actinomycetes）、诺卡氏菌属(Nocardia)、假单胞菌属（Pseudomonas）、食烷菌属（Alcanirorax）、解环菌属（Cycloclasticus）、海杆菌属（Marinobacter）、海细菌属（Marinobacterium）、油螺旋菌属（Oleispira）、海旋菌属（Thalassospira）和微球菌属（Mirococcus）等。目前对降解微生物资源的研究已成为一个新的重要方向，越来越多的石油降解微生物被发现，国际上已建成了专门的降解微生物菌群资源库。分离筛选对石油烃具有降解能力的菌株，是研究微生物降解石油机理及对石油烃污染环境进行生物修复的基础。石油降解菌的研究已经从近海环境扩展到大洋、极地等环境，这些降解菌主要是从海水、海泥样品中分离获得，而从石油污染后引发一系列变化的生物体内筛选降解菌的研究并不多见。 
海绵作为滤食性的低等海洋动物，体内共生着丰富的微生物菌群，菌群的多样性与海绵种属及其生存环境密切相关。同时海绵生存环境的变化（包括环境恶化），将会导致其共生微生物多样性的变化。海绵微生物和海绵互利共生，不仅能为海绵提供营养物质和能量，还可通过生产和释放一些具有生物活性的化合物，参与海绵对抗化学污染的生物防御系统，其中一个重要的功能是降解污染。从海绵中筛选出具有高效石油降解能力的微生物，探索该类海绵相关微生物对环境的修复作用，及其与宿主在生物修复方面的协同作用，形成一种高度符合自然规律的生物修复方法，为海洋石油污染的生物修复提供理论和技术基础。 
发明内容
本发明的目的是提供一株可降解石油烃的溶杆菌。 
本发明所提供的溶杆菌是从大连湾潮间带原油污染的海绵样品中筛选到的。根据其形态特征、培养特性、生理生化特性和16S rRNA基因序列分析等证实属于溶杆菌属（Lysobacter）新种，命名为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5。海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5已于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC N0.7164。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164为革兰氏阴性菌，细胞呈杆状，无鞭毛，没有运动性，大小为（1.1～1.2）μm×（0.2～0.3）μm。在LB培养基上培养3天，该菌株的菌落呈大圆形、光滑、较大、隆起、浅棕黄色、半透明、边缘整齐等特征。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164属于好氧菌，可生长的pH范围为6.0～8.0，最适生长pH值为7.2；可生长温度范围为15～42℃，最适生长温度为30℃；该菌株能在0～6%(w/v)盐度范围内生长，最适生长盐度为3%。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164接触酶和氧化酶阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶阴性；该菌株的柠檬酸盐利用、七叶灵水解、V.P.反应、明胶液化阳性，淀粉水解和硝酸盐还原阴性。该菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-环糊精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纤维二糖、D-果糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、D-绵子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、顺-阿康酸、柠檬酸、甲酸、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羟基丁酸、b-羟基丁酸、g-羟基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羟基脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、D,L-肉碱、肌苷和尿苷作为唯一碳源和能源。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164细胞中的脂肪酸主要包括异式十六碳饱和脂肪酸（15.10%）、异式十五碳饱和脂肪酸（14.35%）、ω9c异式一十七碳单不饱和脂肪酸（9.45%）、3-羟基异式十三碳饱和脂肪酸（8.37%）、异式十一碳饱和脂肪酸（7.66%）、ω7c-十六碳单不饱和脂肪酸/ω6c-十六碳单不饱和脂肪酸（6.45%）、十六碳饱和脂肪酸（5.33%）、ω8c型环式一十九碳饱和脂肪酸（5.20%）、ω7c异式一十八碳单 不饱和脂肪酸（3.95%）、异式十七碳饱和脂肪酸（2.54%）、环式十七碳饱和脂肪酸（2.30%）、反异式十五碳饱和脂肪酸（2.11%）、3-羟基十碳饱和脂肪酸（1.66%）、异式十碳饱和脂肪酸（1.33%）、反异式十七碳饱和脂肪酸（1.32%）、3-羟基十八碳饱和脂肪酸（1.30%）、异式十四碳饱和脂肪酸（1.23%）、I型-异式/B型-反异式十七碳单不饱和脂肪酸（1.22%）和3-羟基八碳饱和脂肪酸（1.00%）。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164的G+C摩尔百分含量为63.88%；该菌株的16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，与已发表的溶杆菌属的模式菌Lysobacter concretionis KCTC12205、Lysobacter.daejeonensis DSM17634、Lysobacter defluvii IMMIB APB-9T和Lysobacter spongiicola KMM329的16S rRNA基因序列的同源性分别为96.0%、96%、96%和95%。 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164与上述模式菌株Lysobacter concretionis KCTC12205DNA杂交的同源性比较低，为23%；同时，该菌株的生理生化特性、细胞壁脂肪酸组成也与上述模式菌株有明显差异，说明海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164是溶杆菌属的一个新菌种。 
本发明的另一个目的是提供一种降解石油烃的方法。 
本发明所提供的降解石油烃的方法，是用所述海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164对待测样品进行处理，使石油烃得到降解。 
上述方法中，所述的应用为：以2216E为基础培养基，对海连溶杆菌2-5菌种进行扩大培养，以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到以原油为唯一碳源和能源的人工海水培养基中，使海水培养基中的原油得到降解。 
以海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164为活性成分制备的生物制剂也属于本发明的保护范围。 
本发明的海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164是溶杆菌属的新菌种，分离自石油污染的海绵样品，能够有效降解石油烃并利用石油烃作为生长的唯一碳源。在人工海水培养基中，7天内对石油烃（初始浓度为1000mg/L）的平均降解率为67.8%。本发明的海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164可用于石油烃的降解。 
下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，并非对本发明的限制。 
附图说明
图1为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164在扫描电子显微镜下的形态照片； 
图2为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164在透射电子显微镜下的形态照片； 
图3为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164的16S rRNA基因序列系统发育树分析图； 
图4为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164对石油烃的降解曲线图； 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5已于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC N0.7164。 
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 
实施例1：海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164的分离及鉴定 
一、降解石油烃菌株的分离 
分离培养基：（1）人工海水培养基（ASM）：MgSO4·7H2O7.0g/L，KCl0.7g/L，KH2PO42.0g/L，Na2HPO43.0g/L，NH4NO31.0g/L，NaCl30g/L，Crude oil 1g/L，PH7.2；微量元素溶液10mL。微量元素组成为：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuSO40.5mg/L，MnCl2.4H2O0.5mg/L，ZnSO4.7H2O10mg/L。（2）固体平板分离培养基（ASM1）：上述人工海水培养基加18g/L琼脂；（3）固体平板纯化培养基：2216E（Difco）。 
将石油溶于石油醚中，配制成浓度为100mg/mL的石油溶液。 
将采自大连湾石油污染海域海绵样品，用无菌手术刀切成小块，在烧杯中用无菌海水将样品洗涤3次，以除去样品表面附着的微生物和其它杂质，在无菌研钵中研磨5min，使之成匀浆状，取5mL，加入到灭菌的含100mL人工海水培养基ASM的500mL摇瓶中，以石油（浓度0.5～1g/L）为唯一碳源进行富集培养，置于28℃，200r/min摇床中培养，做为第一次富集培养液，7天后，取5mL的第一次富集培养液转接入新鲜的人工海水培养基中，再进行富集培养，做为第二次富集培养液，7天后，取第二次富集培养液5mL，转接入新鲜的人工海水培养基中，共转接3次。将最终的富集培养液进行10―1、10―2、10―3梯度稀释，涂布固体平板分离培养基ASM1上；以不加原油的人工海水培养基为空白对照平板，28℃培养7～10天，挑取单菌落于2216E纯化平板，划线分离单菌，得到纯化的单菌落。挑取纯化后的单菌落接种在装有5mL液体培养基的2216E试管中，将试管置于200r/min振荡培养箱中，28℃振荡培养72h左右，取200μL菌液加入装有含1.8mL20%甘油水溶液的冻存管中，–70℃放置保存备用。 
结果表明，空白对照平板上没有任何菌落生长，说明没有外加石油作为碳源的平板上，海水样本中的微生物无法生长；相应的，在加有石油的平板上有菌株能够生长，说明这些单菌落对应的菌株能够降解石油烃并以 石油烃为唯一碳源生长。挑取能够降解石油烃的单菌落2-5作进一步研究。 
二、菌株的形态特征 
将上述步骤一分离得到的菌株2-5接种到2216E培养基中，当细胞生长至对数生长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态（是否平坦、突起、褶皱、凹陷等）、菌落边缘状态（是否整齐、不规则、放射状等）。 
将处于对数生长期的细胞，采用扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察细胞形态，结果如图1和图2所示；同时进行革兰氏染色，于40×100倍的光学显微镜下观察菌体细胞的形态。 
结果表明，上述步骤一筛选到的菌株菌落直径为2.5～3mm，呈圆形、光滑、隆起、黄色、有光泽、半透明、边缘整齐；在电子显微镜下观察，菌体细胞呈杆状、无鞭毛，没有运动性，大小为（1.1～1.2）μm×（0.2～0.3）μm。 
三、菌株的生长特性 
上述步骤一筛选到的菌株属于革兰氏阴性、好氧细菌。该菌株最适生长pH值是7.2，可生长pH范围是6.0～8.0；最适生长温度为30℃，可生长的温度范围为15～42℃。该菌株属于海洋细菌，生长依赖于盐的存在，能在0～6（w/v）盐度范围内生长繁殖，最适生长盐度3%。 
四、菌株的生化特征 
1、碳源利用 
利用Biolog微生物自动鉴定系统测试菌株对95种碳源的利用情况。先将待测菌株的纯培养菌落制成细胞悬液，然后接种于GN2鉴定板上培养，再用Biolog Microstation软件读取数据，确定碳源利用情况。 
2、其它生化特征 
该菌株的接触酶、氧化酶、β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶活性利用API20E生化试剂盒检测；菌株的柠檬酸盐利用、七叶灵水解、淀粉水解、V.P.反应、明胶液化和硝酸盐还原反应利用API20NE生化试剂盒检测。 
以上实验结果表明，上述步骤一筛选到的菌株能利用糖原、L-阿拉伯糖、a-环糊精、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、核糖醇、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-纤维二糖、D-果糖、a-D葡萄糖、m-肌醇、a-D-乳糖、乳果糖、麦芽糖、D-甘露糖、D-蜜二糖、甲基葡萄苷、D-绵子糖、L-鼠李糖、D-山梨醇、D-海藻糖、松二糖、木糖醇、乙酸、顺-阿康酸、柠檬酸、甲酸、D-半乳糖酸内酯、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸、b-甲基葡糖苷、D-葡糖醛酸、a-羟基丁酸、b-羟基丁酸、g-羟基丁酸、a-氧代丁酸、a-氧代戊二酸、D,L-乳酸、丙二酸、丙酸、奎尼酸、D-已糖酸、琥珀酰胺酸、葡糖醛酰胺、L-丙氨酰胺、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酰天冬氨酸、甘氨酰谷氨酸、羟基脯氨酸、L-亮氨酸、L-鸟氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-焦谷氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、D,L-肉碱、肌苷和尿苷作为唯一碳源和能源。该菌株的接触酶和氧化酶阳性，β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、脲酶和色氨酸脱氨酶阴性；该菌株的柠檬酸盐利用、七叶灵水解、V.P.反应、明胶液化阳性，淀粉水解和硝酸盐还原阴性。 
五、与溶杆菌属模式菌株生理生化特征比较 
将上述步骤一筛选到的菌株生理生化特征与溶杆菌属模式菌株（L.spongiicola DSM 21749T、L.concretionis KCTC 12205T、L.daejeonensis DSM 17634T、L.defluvii DSM 18482T）的生理生化特征相比较，结果见表1所示。 
表1 筛选到的菌株与溶杆菌属模式菌株的生理生化特征比较 
注：编号1代表本研究筛选到的菌株2-5；编号2代表模式菌株L.spongiicola DSM 21749T；编号3代表模式菌株L.concretionis KCTC 12205T；编号4代表模式菌株L.daejeonensis DSM 17634T；编号5代表模式菌株L.defluvii DSM 18482T。+，表示结果为阳性，―，表示结果为阴性，ND表示未检测。 
六、菌株细胞脂肪酸分析 
1、溶液的配制 
溶液I：将45g氢氧化钠溶于300mL甲醇的水溶液中（甲醇和水的体积比为1:1）； 
溶液II：将190mL比重为1.19g/mL的浓盐酸和275mL甲醇溶于135mL蒸馏水中； 
溶液III：将200mL正已烷与200mL乙醚混合均匀； 
溶液IV：将10.8g氢氧化钠溶于900mL蒸馏水中； 
溶液V：饱和的氯化钠溶液（质量百分含量为26.5%）。 
2、提取方法 
取一接环上述步骤一筛选到的海连溶杆菌2-5培养物置于8mL螺口玻璃管中，加入1mL溶液I，拧紧螺盖，沸水浴5min，取出振荡5～10s，再度拧紧螺盖，继续沸水浴25min； 
待样品冷却后，加入2mL溶液II，拧紧螺盖振荡，随后精确控制温度为80±1℃，水浴10min，冰浴冷却；此步骤需要严格控制温度在80±1℃和水浴时间10min，以免羟基酸和环式脂肪酸受到破坏； 
在冷却的样品管中加入1.25mL溶液III，快速振荡10min左右，弃去下层水相； 
在剩余的有机相中加入3mL溶液IV及几滴溶液V，快速振荡5min左右，取三分之二的上层有机相置于气相色谱样品瓶中备用。 
3、分析方法 
采用HP6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（FID）及HP气相色谱化学工作站（HP CHEMSTATION ver A5.05）；色谱柱为UItra-2柱（长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33μm）；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，每分钟5℃升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5分钟；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5mL/min，分流进样模式，分流比100：1，进样量2μL；检测器温度300℃，氢气流速30mL/min，空气流速216mL/min，补充气（氮气）流速30mL/min。 
结果表明，上述步骤一筛选到的菌株细胞壁脂肪酸主要包括异式十六碳饱和脂肪酸（15.10%）、异式十五碳饱和脂肪酸（14.35%）、ω9c异式一十七碳单不饱和脂肪酸（9.45%）、3-羟基异式十三碳饱和脂肪酸（8.37%）、异式十一碳饱和脂肪酸（7.66%）、ω7c-十六碳单不饱和脂肪酸/ω6c-十六碳单不饱和脂肪酸（6.45%）、十六碳饱和脂肪酸（5.33%）、ω8c型环式一十九碳饱和脂肪酸（5.20%）、ω7c异式一十八碳单不饱和脂肪酸（3.95%）、异式十七碳饱和脂肪酸（2.54%）、环式十七碳饱和脂肪酸（2.30%）、反异式十五碳饱和脂肪酸（2.11%）、3-羟基十碳饱和脂肪酸（1.66%）、异式十碳饱和脂肪酸（1.33%）、反异式十七碳饱和脂肪酸（1.32%）、3-羟基十八碳饱和脂肪酸（1.30%）、异式十四碳饱和脂肪酸（1.23%）、I型-异式/B型- 反异式十七碳单不饱和脂肪酸（1.22%）和3-羟基八碳饱和脂肪酸（1.00%）。 
将该菌细胞壁中脂肪酸组成与溶杆菌属的模式菌株（L.spongiicola DSM 21749T、L.concretionis KCTC 12205T、L.daejeonensis DSM 17634T、L.defluvii DSM 18482T）进行比较，结果如表2所示。 
表2 筛选得到的菌株与溶杆菌属的模式菌株脂肪酸组成比较 
注：表2中编号1代表本研究筛选到的菌株2-5；编号2代表模式菌株L.spongiicola DSM 21749T；编号3代表模式菌株L.concretionis KCTC 12205T；编号4代表模式菌株L.daejeonensis DSM 17634T;编号5代表模式菌株L.defluvii DSM 18482T。 
七、菌株的16S rRNA基因序列测定和系统发育树分析 
提取上述步骤一筛选到的菌株总DNA，采用细菌16S rRNA通用引物，正向引物为5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，反向引物为5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增。PCR反应条件为：先94℃6min；94℃45s，54℃45s，72℃90s，共30个循环；最后72℃延伸10min。 
PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收后连接到PMD18-T载体上，送大连宝生物公司进行测序；采用Clustal X程序（1.83），系统发育分析通过N-J法分析。 
结果表明，上述步骤一筛选到的菌株16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示，其16S rRNA基因序列的系统发育分析图如图3所示。 
根据获得的16S rRNA基因序列比对和系统发育分析结果判定，上述步骤一筛选到的菌株属于溶杆菌属（Lysobacter），并且与已发表的模式菌株Lysobacter concretionis KCTC12205T、Lysobacter.daejeonensis DSM17634T、Lysobacter defluvii IMMIB APB-9T和Lysobacter spongiicola KMM329T的16S rRNA基因序列的同源性分别为96.0%、96%、96%和95%。 
八、与溶杆菌属模式菌株（Lysobacter concretionis KCTC12205T）的DNA-DNA杂交分析 
1、菌体细胞基因组DNA纯度的测定 
提取上述步骤一筛选到的菌株总DNA，取10μL DNA样品于1.5mL离心管中，加入190μL0.1×SSC溶液进行溶解，使总体积为200μL，即将DNA样品稀释20倍，用枪吸打数次，将DNA样品混匀、打碎。用紫外分光光度计分别测量260nm、280nm、230nm和270nm时的紫外吸收值，适合做DNA/DNA杂交实验的DNA样品必须符合以下条件： 
OD（260nm）/OD（280nm）﹥1.8，说明蛋白质量含量符合要求； 
OD（260nm）/OD（230nm）﹥2.0，说明糖含量符合要求； 
OD（260nm）﹥（270nm），说明酚含量符合要求。 
2、G+C摩尔百分含量的测定 
上述步骤一筛选到的菌株基因组DNA的G+C含量测定使用熔解温度（Tm）法，以大肠埃希氏（E.coli K12，CGMCC 1.365）为参比对照，所用仪器为Perkin/Elmer公司Lambda35 UV/VIS Spectrometer；用PTP-1数字温度控制仪控温。步骤如下： 
将待测DNA样品用0.1×SSC稀释至OD260nm值于0.3-0.4之间； 
在波长260nm首先记录25℃的OD值，然后设定升温程序，从65℃开始到95℃，其间每分钟升高1℃； 
OD值上升表示变性开始，记录比色皿温度和OD值，直至OD值不变表示变性完毕； 
根据热变性曲线，得出熔链温度（Tm），计算G+C mol%含量。在0.1×SSC溶液中计算公式为：G+C mol%=G+C mol%1.365+2.08(Tm未知－Tm1.365)。 
结果表明，菌株2-5的G+C摩尔百分含量为63.88%。 
3、DNA-DNA杂交试验 
采用液相复性速率方法测定菌株的DNA-DNA杂交率。所用仪器为Perkin Elmer Lambda35UV/VIS Spectrophotometer。温度控制用PIP-1Peltier System数字控温系统。具体实验步骤如下： 
（1）DNA样品处理：提取的DNA样品，实验前需先置冰浴中，用40W超声波处理（DNA样品浓度为2.0），将DNA样品剪切为2-5×105道尔顿的片段。 
（2）将等测DNA样品分别用0.1×SSC精确配制成为OD260nm1.8-2.0，且两者OD260nm值一致（精确到0.001）； 
（3）进入UV Winlab程序，出现其方法窗口，在方法窗口中选择时间驱动TD方法，通过Timed.Inst.Sample.设置页来设定合适的测定参数。测定波长为260nm，总测定时间设定为30分钟。按照已经测定的G+C mol%计算最适复性温度（optimal renaturation temperature,TOR），将比色杯的温 度稳定在最适复性温度。在2×SSC反应液中，最适复性温度按公式：TOR=0.51×(G+C)mol%+47计算。 
（4）邓预备杂交的菌种DNA样品各400μL分别装在两个离心管中，再取两株种DNA样品各200μL装在同一个离心管中为混合样品； 
（5）单一DNA样品和混合DNA样品测试前分别通过PTP-1控温系统设置100℃变性15min，然后降温至最适复性温度。记录OD260nm值，待反应进行到30min时，停止读数，全部过程样品的温度都不得低于TOP，最终得到一条随时间延长，光吸收值逐渐减小的直线； 
（6）根据软件UV Winlab，在其中的Algorithm栏中选择Slope，得出复性数率（V），即斜率（通常V表示为每分钟吸光值的减少值）； 
（7）根据公式计算同源杂交率： 
( H ) % = 4 Vm - ( Va + Vb ) / 2 VaVb × 100 %
4、DNA-DNA杂交结果分析 
结果表明，上述步骤一筛选到的菌株DNA与已发表的模式菌株Lysobacter concretionis KCTC12205T比较低，为23%。 
基于以上测定结果，将上述步骤一筛选到的菌株鉴定为海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5已于2013年1月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为CGMCC N0.7164。 
实施例2：海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164降解石油烃的性能 
将5～10g石油溶于约5～10mL的石油醚中，过滤除菌，加入上述实施例1的含100mL人工海水培养基的500mL摇瓶中，使石油在培养基中的终浓度为0.5～1g/L。 
将海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164按照体积比为5%的接种量接入上述培养基中，在30℃、转速为200r/min的好氧避光条件下培养7天。同时，以不加原油的人工海水培养基作为对照，以不接种海连溶杆菌2-5的人工海水培养基作为空白对照，用于扣除石油挥发的影响。 
培养7天后，将降解后的石油样品及对照用二氯甲烷与正已烷1：1（V:V）100mL萃取其中的残余油污。从有机相准确量取4mL溶液，先用无水Na2SO4脱水，再用0.22μm耐有机溶剂滤膜过滤，用氮气吹干，然后以1mL正已烷重新溶解，移入GC样品瓶中。用GC-FID、GC-MS对石油降解后残留的原油组分进行分析测定。 
气相色谱分析条件：气相色谱仪FL9510；色谱柱DB-5（30m×0.25mm×0.25μm）石英毛细管柱；检测器温度300℃；升温程序：100℃恒温2min，以升温速率为4℃/min升温到300℃，然后再恒温20min； 载气（Ar）流量1mL/min；进样口温度280℃；进样量1μL；分流比1:1 
实验设三个重复，石油的降解效果如图4所示，结果表明，海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5CGMCC N0.7164在7天内对石油烃的平均降解率为67.8%。 
序列表 
海连溶杆菌（Lysobacter hymeniacidonis）2-5 
GCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCT 
CTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCGTCGGAATCTGC 
CTATTTGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG 
ACCTACGGGTGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCAGATAGATG 
AGCCGACGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGC 
GACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG 
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 
CAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGC 
CTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTACGGGAAGAAACGCGATCGGTTAA 
TACCCGGTCGAACTGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTTC 
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAAT 
TACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA 
AGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGATACTGGCAGGCTAGA 
GTGCGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTA 
GATATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAGCA 
CTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC 
CTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGGACACTT 
AGGTCTTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGAAGT 
ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA 
AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAACCTTACC 
TGGCCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 
GAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA 
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGC 
CAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGCGACAAGCC 
GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAG 
GGCTACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGC 
GACGGTGAGCCAATCCCAGAAACCCCATCTCAGTCCGGATTGGAGTC 
TGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGC 
ATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC 
ACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGA 
GGACGGTACCACGGAGAT 。

Claims (7)

1.海连溶杆菌2-5（Lysobacter hymeniacidonis2-5），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年1月18日，保藏编号CGMCC N0.7164。 
2.如权利要求1所述的海连溶杆菌2-5，其特征在于：所述海连溶杆菌2-5菌落特征和生理生化特性为：杆状，大小为0.2～0.3μm×1.1～1.2μm，革兰氏染色为阴性，在LB固体培养基30℃培养2～3天后，菌落呈浅棕黄色，圆形，边缘整齐，表面光滑，易挑起；接触酶和氧化酶阳性，V.P.反应阳性，淀粉水解阴性，柠檬酸盐利用阳性，硝酸盐还原阴性，七叶灵水解阳性，明胶液化阳性。 
3.如权利要求1所述的海连溶杆菌2-5，其特征在于：所述海连溶杆菌2-5的16S rRNA序列为： 
GCGGCAGCTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGAGAGAGCTTGCT 
CTCTTGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGGAATGCGTCGGAATCTGC 
CTATTTGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACG 
ACCTACGGGTGAAAGTGGGGGATCTTCGGACCTCACGCAGATAGATG 
AGCCGACGTCGGATTAGCTAGTTGGCGGGGTAAAGGCCCACCAAGGC 
GACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTG 
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGA 
CAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGC 
CTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTACGGGAAGAAACGCGATCGGTTAA 
TACCCGGTCGAACTGACGGTACCGTAAGAATAAGCACCGGCTAACTTC 
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTACTCGGAAT 
TACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAA 
AGCCCTGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGATACTGGCAGGCTAGA 
GTGCGGTAGAGGGTAGCGGAATTCCCGGTGTAGCAGTGAAATGCGTA 
GATATCGGGAGGAACATCCGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGACCAGCA 
CTGACACTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACC 
CTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGCGAACTGGATGTTGGGGACACTT 
AGGTCTTCAGTATCGAAGCTAACGCGTTAAGTTCGCCGCCTGGGAAGT 
ACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACA 
AGCGGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAGAACCTTACC 
TGGCCTTGACATCCACGGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 
GAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGA 
GATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGC 
CAGCACGTAATGGTGGGAACTCTAAGGAGACCGCCGGCGACAAGCC 
GGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAG 
GGCTACACACGTACTACAATGGTGGGGACAGAGGGCTGCAAGCCGGC 
GACGGTGAGCCAATCCCAGAAACCCCATCTCAGTCCGGATTGGAGTC 
TGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCAGATCAGC 
ATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC 
ACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTCGGGA 
GGACGGTACCACGGAGAT 。
4.一种权利要求1～3任一所述的海连溶杆菌2-5在降解海洋环境石油烃污染中的应用。 
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：以2216E为种子培养基，对海连溶杆菌2-5菌种进行培养，将菌种接种到种子培养基2216E中培养获得菌悬液，菌悬液以0.5～2×106个细胞/mL培养基的接种量接种到种子培养基中，30℃、转速为200r/min培养48h，得菌液，以培养获得的菌液为石油降解菌剂，加入到含原油0.5～1g/L的海水样品或以原油为唯一碳源的人工海水培养基（ASM）中，使海水样品或人工海水培养基中的原油得到降解。 
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述人工海水培养基（ASM）各组分终浓度为：MgSO4·7H2O7.0g/L，KCl0.7g/L，KH2PO42.0g/L，Na2HPO43.0g/L，NH4NO31.0g/L，NaCl30g/L，Crude oil1g/L，PH7.2；微量元素溶液10mL； 
微量元素组成为：CaCl220mg/L，FeCl350mg/L，CuSO40.5mg/L，MnCl2.4H2O0.5mg/L，ZnSO4.7H2O10mg/L。 
7.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用按如下步骤进行： 
（1）将5～10g原油溶于约5～10ml的石油醚中，过滤除菌，加入到含100mL人工海水培养基的500mL摇瓶中，使原油在培养基中的终浓度为0.5～1g/L； 
（2）将海连溶杆菌2-5种子接种到2216E培养基，30℃、转速为200r/min培养24h，得菌液，将获得的菌液按接种量为5%体积比，加入到上述人工海水培养基（ASM）中，在30℃、转速为200r/min的好氧避光条件下培养7天；同时，以不加石油的人工海水培养基作为对照，以不接种海连溶杆菌2-5的人工海水培养基作为空白对照，用于扣除石油挥发的影响。 
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