CN111971305A - 用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的夹心酶联免疫吸附测定 - Google Patents

用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的夹心酶联免疫吸附测定 Download PDF

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Abstract

本申请涉及用于鉴定可能受益于治疗剂应用的受试者的组合物和方法。本发明利用治疗性单克隆抗体对单一表位的特异性以确定治疗性单克隆抗体是否与患者中/来自患者的生物材料相互作用。靶向复合物包含：1.抗体A，其中抗体A是潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，其包含(a)对目标表位具有特异性的可变区，和(b)人恒定区；和2.抗体B，其中抗体B识别抗体A的人恒定区。

Description

用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的夹心酶联免疫吸 附测定
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年3月27日提交的美国临时申请号62/648,718和2018年4月13日提交的美国临时申请号62/657,288的优先权，它们各自特此整体并入本文。
技术领域
本发明涉及用于鉴定可能受益于治疗性单克隆抗体治疗的受试者的组合物和方法。
背景技术
在药物开发过程中以及在之后的患者护理中，有用的是测试已将单克隆抗体(mAb)设计成与之相互作用的靶蛋白在临床样品中的存在和/或表达水平。尽管针对特定分析物(通常是蛋白或蛋白的部分)来产生mAb，但每种mAb可能与靶分析物的不同表位反应。也可能是不同mAb可以与同一表位反应的情况，但由于mAb产生的性质，mAb可能具有不同的序列和对目标分析物不同的亲和力。
由于每种mAb代表独特的材料，解决特定治疗性mAb是否与患者体内/来自患者的生物材料相互作用的最有效方式是创建一种包含与优选测定试剂相同的治疗性mAb分析物结合区的测定。如果使用另一种测定试剂类型，例如另一种抗体试剂，则该第二种测定试剂很有可能针对不同的分析物表位，因此不会特异性地鉴定患者材料(体内或体外)和治疗性mAb之间的预期相互作用。
在当前的实践中，开发mAb药物的公司经常基于抗体来共同研究和/或共同开发免疫组织化学(IHC)试验，所述抗体针对与mAb药物所靶向的蛋白相同的蛋白而制备。这经常通过在当前供应商目录中搜索试剂(例如，单克隆或多克隆抗体)来完成。如果找到一种或多种，该公司将对目录产品进行测试以评估产品在IHC中的特性。除了上述技术问题(不同的表位)以外，由于任何数目的因素，包括不稳定的来源材料(诸如不稳定的杂交瘤)、制造质量差、知识产权问题和/或商业化权利，商业供给可能不适合用在临床试验开发中。因为这些原因，当前的筛选和鉴定技术易于产生假阳性和假阴性。如果不能找到合适的试剂，该公司可以选择通过本领域的标准方法创建新的Ab试剂。这将具有许多相同的技术缺点，此外可能需要6到12个月的开发时间，从而减缓药物开发项目。因此，需要鉴定哪些患者最可能受益于治疗剂的方法。
发明内容
本发明的实施方案包括用于鉴定可受益于治疗剂的受试者的组合物和方法。本发明可以以多种方式实施。
在某些方面，本发明包括用于鉴定可能受益于治疗剂的受试者的靶向复合物的组合物。在某些实施方案中，所述靶向复合物包含抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。抗体A和抗体B可以结合在一起以形成靶向复合物。
在另一个方面，本发明包括用于制备靶向复合物的方法。抗体A可以与抗体B反应以产生靶向复合物。一旦抗体A与抗体B形成复合物，就纯化靶向复合物以除去任何未结合的试剂。
在另一个方面，本发明包括用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的方法。治疗剂可以包含单克隆抗体或其部分。用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的步骤包括：(i)获得样品，(ii)将所述样品与靶向复合物一起温育，(iii)检测抗原-抗体复合物；和(iv)预测受试者是否对治疗剂有应答。靶向复合物可以包含抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。
附图说明
图1显示了通过治疗性单克隆抗体(AbA)的靶表位(表位A)检测肿瘤蛋白的表达的优选实施方案。
图2显示了治疗性单克隆抗体(AbA)和肿瘤蛋白的特定表位(表位A)之间的相互作用。
图3显示了通过并非治疗性单克隆抗体的靶标的表位(表位C)检测肿瘤蛋白的表达。
图4显示了用于鉴定可能受益于治疗性单克隆抗体的受试者的抗原结合测定的优选实施方案。
图5显示了用于鉴定可能受益于多种不同治疗性单克隆抗体的受试者的抗原结合测定的优选实施方案。
具体实施方式
定义
除非在本文中另外定义，否则与本发明相关使用的科学和技术术语应当具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非上下文有其它规定，否则单数形式的术语应当包括复数，而复数形式的术语应当包括单数。通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学及杂交相关使用的命名及其技术是本领域众所周知和常用的那些。除非另外指出，通常根据本领域众所周知的和在贯穿本说明书讨论的各种一般和更具体参考文献中描述的常规方法执行已知的方法和技术。如本领域中通常所完成的或如本文所述的，根据制造商的说明书，进行酶反应和纯化技术。结合本文描述的实验室规程和技术使用的命名法是本领域众所周知和常用的那些。
除非另有说明，下面的术语应当理解为具有下述含义：
本文中使用的术语“一个”、“一种”和“所述”可以表示一个/一种或多个/多种，除非另外特别指出。
除非明确指出仅表示备选物，或者备选物是相互排斥的，否则术语“或”的应用用于指“和/或”，尽管本公开内容支持仅表示备选物和“和/或”的定义。本文中使用的“另一”可以是指至少第二或更多。
贯穿本申请，术语“约”用于指示，值包括用于确定该值的装置、方法的固有误差变化，或在样品之间存在的变化。
术语“生物样品”表示从受试者分离的组织或流体的样品，包括、但不限于例如血液、血浆、血清、粪便物、尿、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、来自身体(例如来自皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道)的外部分泌物、泪液、唾液、乳汁、血细胞、器官、活检物以及体外细胞培养组分样品，例如由细胞和组织在培养基中的生长产生的条件培养基，例如重组细胞和细胞组分。
术语“指示剂”或“指示剂部分”或“可检测部分”或“可检测的生物分子”或“报道分子”或“标记物”表示提供可在定性或定量测定中测量的信号的分子。例如，指示剂部分可以包含可用于将底物转化为可测量的产物的酶。指示剂部分可以是催化产生生物发光发射的反应的酶(例如，萤光素酶、HRP或AP)。或者，指示剂部分可以是可以定量的放射性同位素。或者，指示剂部分可以是荧光团。或者，可以使用其它可检测的分子。
术语“抗原”表示细胞表面上的一个分子或一组分子，或包括这样的分子或一组分子的复合物，可用于本发明目的的单克隆抗体的抗原结合位点与所述分子结合。
术语“多肽”、“肽”或“蛋白”表示通过相邻残基的α-氨基和羧基之间的肽键彼此连接的线性氨基酸残基系列。
术语“抗体”表示由一个或多个多肽组成的蛋白，所述多肽基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因的片段编码。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们又分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
术语“治疗剂”或“潜在治疗剂”表示能够在疾病状态下产生疗效的物质。
本发明利用治疗性单克隆抗体对单个表位的特异性来鉴定可能受益于该治疗性单克隆抗体的受试者。抗体可用于蛋白水平的鉴定；但是，每种蛋白将具有多种表位。特定的单克隆抗体可能仅对单个表位种类具有特异性。公司提供了大量针对蛋白的抗体，但是这些抗体的特异性差异很大。靶向蛋白的不同部分(表位)的抗体可能具有相反作用。过表达特定治疗剂的靶蛋白的个体的鉴定可以有助于鉴定用治疗剂治疗的合适候选人。但是，在某些情况下，如果个体不表达特定治疗剂所靶向的蛋白的特定表位，则过表达靶蛋白的个体可能不是用所述特定治疗剂治疗的合适候选人。
本发明的组合物、方法和系统的每个实施方案可以用于确定特定治疗剂是否会与患者体内/来自患者的生物材料相互作用。可以在短时间内以增加的特异性和一致性进行根据本发明的方法。
I.靶向复合物
如本文中所述的，本发明的组合物、方法和系统可以包含用于鉴定可能受益于治疗剂的受试者的靶向复合物。在某些实施方案中，所述靶向复合物包含两种抗体：抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，所述单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。
存在许多不同的抗体同种型，最常见的是免疫球蛋白G(IgG)。IgG抗体由两条多肽链组成：重链和轻链。每条重链具有两个区域：恒定区和可变区。相同同种型的所有抗体由相同恒定区组成。片段-抗原结合(Fab)由重链和轻链各自的一个恒定结构域和一个可变结构域组成，并且可以与分子的片段可结晶(Fc)部分分开。所述分子的Fc部分充当淋巴细胞表面上的受体和第二抗体的结合位点。Fab片段含有可变结构域，其由抗体高变结构域组成。高变结构域决定了抗体的特异性和结合能力。Fc区完全由恒定结构域组成。
可以使用动物生产多克隆抗体和单克隆抗体。当用特定免疫原(抗原)免疫哺乳动物时，会产生多克隆抗体。产生抗体的分子(抗原)是诱导免疫应答(抗体生成)的蛋白分子。多克隆抗体包含许多不同的IgG，每种能够识别相同免疫原性蛋白上的不同表位。这些IgG蛋白可以从免疫动物的血液中分离。多克隆抗体可以在多种动物中产生，包括、但不限于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、驴、山羊或绵羊。在某些实施方案中，优选使用在小鼠或兔中产生的抗体。
与多克隆抗体的产生相似，通过用特定抗原免疫动物来产生mAb。为了分离单克隆抗体，取出脾脏并从脾脏中分离产生抗体的淋巴细胞。产生独特抗体的每个淋巴细胞都可以通过与肿瘤细胞融合而永生化，以产生能够制备每种特异性抗体的克隆系(杂交瘤)。每个杂交瘤能够产生仅对单个免疫原性表位具有特异性的单克隆抗体。针对特定目标抗原(例如，在肿瘤表面上发现的抗原)产生单克隆抗体(MAb)。展示具有独特表位的蛋白的肿瘤细胞可以被对该表位特异性的单克隆抗体靶向。免疫系统产生针对免疫原上的特定表位而不针对整个免疫原(Ag)的抗体。可以产生识别相同蛋白但不同表位的独特抗体。MAb是相同的，因此它们仅结合一种物质(例如特定表位)。表位是抗体所结合的抗原的特定区域。在确定治疗性mAb是否可能有效时，重要的是，确定特定治疗性mAb是否会与患者体内/来自患者的生物材料相互作用。在某些情况下，治疗性单克隆抗体(AbA)能够与特定类型的表位(表位A)相互作用。但是，AbA仅对表位A具有特异性，而对蛋白上的其它表位(例如表位C)没有特异性。为了鉴定可能受益于治疗性AbA的患者，重要的是，鉴定具有可与治疗剂反应的生物材料(表位A)的受试者。
在某些实施方案中，抗体A是mAb或其片段。在某些实施方案中，所述片段是Fab。在某些情况下，单克隆抗体或其片段可以具有治疗作用。治疗性单克隆抗体可以是鼠的、人源化的、嵌合的或完全人的。在一个优选的实施方案中，所述mAb包含人序列的恒定区。抗体的恒定区决定了用于消除抗原的机制。
在某些实施方案中，包含人恒定区的治疗性mAb是嵌合抗体。嵌合mAb由融合在人恒定区上的非人动物可变区组成。该融合允许嵌合mAb保留对特定抗原的特异性和亲和力。嵌合mAb具有完全人恒定区，因此在人类中表现出降低的免疫原性效应。在某些实施方案中，在哺乳动物中产生嵌合mAb的可变区，所述哺乳动物包括、但不限于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、驴、山羊或绵羊。在一个优选的实施方案中，所述可变区是小鼠的可变区。
在其它实施方案中，包含人恒定区的治疗性单克隆抗体是人源化的mAb。在某些情况下，治疗性mAb可以被人源化以减少抗体的非人部分。通过用非人动物抗体的高变环替换人抗体的高变环，使MAb人源化。类似于嵌合mAb，mAb的非人动物部分负责结合靶抗原。与嵌合抗体不同，只有负责结合表位的高变区才是非人类的，从而进一步降低在人类中的免疫原性效应。在某些实施方案中，在哺乳动物中产生人源化的mAb的高变区，所述哺乳动物包括、但不限于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、驴、山羊或绵羊。在一个优选的实施方案中，所述高变区是小鼠高变区。
在其它实施方案中，包含人恒定区的治疗性单克隆抗体是完全人的。转基因小鼠或噬菌体展示文库可用于产生完全人单克隆抗体。可以将人Ig基因的区段引入缺乏小鼠抗体产生的小鼠的基因组中。当将转基因小鼠中引入特定免疫原时，所述小鼠会产生大量的完全人抗体。完全人抗体是有利的，因为它们不包含非人部分，且因此当在人受试者中用作治疗剂时不产生免疫原性效应。
在本发明的某些实施方案中，单克隆抗体已被FDA批准用作治疗剂。在本发明的其它方面，单克隆抗体是正在接受测试以用作治疗剂或具有用作治疗剂的潜力的抗体。FDA已经批准许多单克隆抗体用于治疗用途，包括、但不限于阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、曲妥珠单抗-美坦新(adotrastuzumab emtansine)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿利珠单抗(alirocumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝利木单抗(belimumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)、bezlotoxumab、兰妥莫单抗(blinatumomab)、本妥昔单抗(brentuximabvedotin)、broadalumab、卡那奴单抗(canakinumab)、卡罗单抗喷地肽(capromabpendetide)、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、西妥昔单抗(cetuximab)、达克珠单抗(daclizumab)、达雷木单抗(daratumumab)、densosumab、地努图希单抗(dinutuximab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、埃洛珠单抗(elotuzumab)、依洛优单抗(evolocumab)、戈利木单抗(golimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)、伊匹木单抗(ipilimumab)、依奇珠单抗(ixekizumab)、美泊珠单抗(mepolizumab)、那他珠单抗(natalizumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、纳武单抗(nivolumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、培妥珠单抗(pertuzumab)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)、司妥昔单抗(siltuximab)、托珠单抗(tocilizumab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维多珠单抗(vedolizumab)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)和贝那利珠单抗(benralizumab)。迄今为止，FDA批准的治疗性mAb含有小鼠、大鼠或人的可变区。
在某些实施方案中，所述靶向复合物进一步包含第二抗体：抗体B。抗体B识别抗体A的人恒定区。抗体B是针对抗体A的人区域产生的单克隆或多克隆抗体。在一个优选的实施方案中，抗体B是单克隆抗体。可以在哺乳动物中产生抗体B，所述哺乳动物包括、但不限于小鼠、兔、大鼠、豚鼠、驴、山羊或绵羊。在一个优选的实施方案中，在小鼠或兔中产生抗体B。
在某些实施方案中，抗体B是对抗体A特异性的第二抗体。第二抗体可以是多克隆的或单克隆的，并且可以对完整Ig分子或其片段(诸如Fc或Fab区)具有特异性。在某些情况下，针对靶向试剂的人恒定区产生第二抗体。针对用于产生第一抗体的宿主物种产生第二抗体。例如，在小鼠中产生的第一抗体需要在除小鼠以外的宿主物种中产生的第二抗-小鼠第二抗体(例如，兔抗-小鼠第二抗体)。第二抗体的检测可以以多种方式完成。最常见的是，第二抗体可以缀合至酶或荧光蛋白或染料。因此，在某些实施方案中，所述靶向复合物包含检测部分。
在备选实施方案中，所述靶向复合物不包含检测部分。在这些情况下，靶向复合物作为第一抗体起作用，其可以在稍后阶段用第三抗体(抗体C)检测。
图1显示了靶向复合物180，其包含与抗体B(AbB)150结合的抗体A(AbA)140。抗体B150识别抗体A 140的人恒定区。通过抗体A，靶向复合物能够结合肿瘤110上的肿瘤表面蛋白120的一种特定类型的表位(表位A)130。但是，靶向复合物不能结合位于表面蛋白上的任何其它类型的表位(例如，表位C)160。对与AbA特异性针对的蛋白相同的蛋白具有特异性、但特异性针对不同表位的其它单克隆抗体能够结合其它类型的表位。例如，图1显示了结合相同表面蛋白120、但不同类型表位(表位C)160的AbC 170。
图2显示了治疗性单克隆抗体(AbA)240能够与特定类型的表位(表位A)230相互作用。但是，AbA240仅对表位A 230具有特异性，而对蛋白上的其它表位(例如，表位C)260没有特异性。为了鉴定可能从治疗性AbA240受益的患者，重要的是鉴定具有可与治疗剂反应的生物材料(表位A)230的受试者。
在某些实施方案中，所述第二抗体可以与检测部分缀合。标记物的选择取决于应用和检测抗体的期望方法。在某些实施方案中，检测方法可以是蛋白质印迹、ELISA、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光或流式细胞术。在某些实施方案中，所述检测部分可以产生光，和/或可以通过颜色变化来检测。可以使用酶诸如碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)或荧光分子(荧光团)或生物发光分子
Figure BDA0002704633980000091
产生检测信号。在某些实施方案中，可以通过颜色或荧光的变化来指示阳性检测。当含有电子的荧光部分吸收光子时，荧光蛋白通过以光子的形式发出能量而自然地发荧光(固有的荧光或自发荧光)。
可商购获得各种合适的酶用于用作检测部分，诸如碱性磷酸酶(AP)、辣根过氧化物酶(HRP)或萤光素酶(Luc)。指示剂部分可以与底物反应以发射可检测的信号。一种或多种产生信号的组分可以与指示部分反应以产生可检测的信号。如果指示剂部分是酶，那么通过使酶与一种或多种底物或另外的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得检测。在一个备选的信号产生系统中，所述标记物可以是荧光化合物，其中不需要标记物的酶操作来产生可检测的信号。荧光分子(包括、例如，荧光素和罗丹明和它们的衍生物和类似物)适合用作这种系统中的标记物。在另一个备选实施方案中，指示剂部分可以是辅因子，然后通过使辅因子与酶和一种或多种底物或另外的酶和底物反应以产生可检测的反应产物来获得可检测信号的扩增。
例如，曲妥珠单抗是来自小鼠的人源化mAb。曲妥珠单抗是FDA批准的用于治疗HER2-阳性的乳腺癌的治疗性单克隆抗体。曲妥珠单抗结合HER2蛋白(该蛋白在某些乳腺癌细胞中过表达)从而阻止受体接收生长信号。曲妥珠单抗对单个HER2表位(Her2细胞外结构域IV近膜表位)具有反应性。HER2受体蛋白具有曲妥珠单抗不会与其相互作用的许多不同表位。曲妥珠单抗的恒定区是人的，且负责结合HER2的高变区是小鼠的。在本发明的一个实施方案中，针对曲妥珠单抗的恒定区产生的小鼠抗-人mAb(检测抗体)可以与曲妥珠单抗(治疗剂)反应以产生靶向复合物，所述靶向复合物用于鉴定可能受益于曲妥珠单抗治疗的受试者。在某些实施方案中，检测抗体可以如上所述缀合至检测部分。
II.制备靶向复合物的方法
本发明的另一个方面包括制备能够检测特定蛋白表位的靶向复合物的方法。在某些实施方案中，通过使抗体A与抗体B反应来产生靶向复合物。一旦抗体A与抗体B形成复合物，就纯化靶向复合物以除去任何未结合的试剂。
使治疗靶标与检测抗体反应
在某些实施方案中，用于制备靶向复合物的方法包括使抗体A与抗体B反应。抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。在某些实施方案中，抗体B是单克隆或多克隆抗体。
在某些实施方案中，抗体B是第二抗体。第二抗体可以以多种形式获得，包括、但不限于液体、冻干的以及带有添加剂(例如，甘油)的形式。通常将液体第二抗体浓缩，并且需要根据生产商的说明书稀释。可以用稀释剂重构干燥的冻干的第二抗体。第二抗体(例如，甘油和BSA)可以含有稳定和延长其贮存期限的添加剂。在某些实施方案中，将封闭剂用作稀释剂(例如，在PBST中的1％BSA)。
在某些实施方案中，第二抗体可以与标记物缀合。在备选实施方案中，第二抗体可以呈未缀合形式。
可以使用本领域通常已知或充分使用的任何方法或技术来形成抗体A和抗体B的复合物。通常，将抗体A与抗体B一起温育至少15、20、25、30、35、40、45分钟或更长时间。在某些实施方案中，在约室温(15-25℃)将抗体A与抗体B一起温育。在某些实施方案中，在约4℃将抗体A与抗体B温育过夜。
靶向复合物的纯化
在某些实施方案中，使用本领域通常已知的标准方法纯化靶向复合物以除去所有未结合的抗体A和未结合的抗体B。例如，可以使用抗体纯化树脂来纯化靶向复合物，所述树脂包括、但不限于蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或Melon Gel。在某些实施方案中，免疫沉淀可用于小规模亲和纯化。备选地，可以使用大规模过程色谱法纯化靶向复合物。
III.抗原结合测定
抗原结合测定可以用于确定受试者是否可能受益于治疗剂治疗。用于鉴定可能受益于治疗剂的受试者的理想测定能够鉴定具有能够与特定治疗剂相互作用的生物材料的患者。当前的测定不使用治疗性mAb来鉴定受试者，而是使用能够与目标蛋白相互作用的商购可得抗体。但是，该替代mAb可能对不同的分析物表位具有特异性，且因此不会特异性地鉴定患者材料(体内或体外)与治疗性mAb之间的预期相互作用。假阴性和假阳性均为用于鉴定用药物mAb治疗的受试者的当前方法的特征。假阴性会导致可能受益于特定治疗剂的应用的受试者被拒绝用该治疗。而假阳性会导致对不可能受到任何益处的受试者的治疗。因此，重要的是，开发一种能够准确地鉴定可能对治疗剂有应答的受试者的测定。
图3显示了用于鉴定可能受益于治疗剂的受试者的典型测定。对与治疗剂特异性针对的表面蛋白相同的表面蛋白320具有特异性的除治疗剂以外的抗体(AbC)370被用于确定表面蛋白320在受试者中的表达。但是，由于AbC 370结合不同的表位(表位C)360，因此这些测定不指示受试者中/来自受试者的生物样品是否会与治疗剂反应。
例如，许多诊断被用于鉴定可能受益于曲妥珠单抗治疗的受试者。曲妥珠单抗治疗的某些诊断使用对HER2蛋白具有特异性的多克隆抗体。将组织样品与多克隆抗体一起温育，并显现结合以确定HER2过表达的水平。但是，与曲妥珠单抗不同，这些多克隆抗体对曲妥珠单抗所靶向的独特表位不是特异性的。在鉴定可能受益于治疗剂的患者时，多克隆抗体的应用可能过于包容。多克隆抗体能够结合蛋白上的多种表位，并且因此，即使受试者的生物材料不可能与曲妥珠单抗相互作用，也更可能将受试者鉴定为过表达HER2。
备选地，可以使用对HER2蛋白具有特异性的单克隆抗体来鉴定过表达HER2的患者。但是，这些mAb对与曲妥珠单抗所靶向的表位不同的HER2表位具有特异性。因此，被鉴定为过表达HER2的受试者可能缺乏曲妥珠单抗与之相互作用的特定表位。
本文公开的方法涉及可能受益于特定治疗剂治疗的受试者的选择或鉴定。本发明的组合物、方法和系统的每个实施方案允许鉴定和/或选择可能受益于特定治疗剂的个体。在某些实施方案中，用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的方法包括：(i)获得样品；(ii)将所述样品与靶向复合物一起温育以形成抗原-抗体复合物；(iii)检测抗原-抗体复合物；(iv)预测受试者对治疗剂的应答性。在某些实施方案中，所述靶向复合物包含两种抗体：抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。在某些实施方案中，多种不同靶向复合物可以用于通过一种测定预测受试者对多种治疗剂的应答性。在某些实施方案中，多种靶向复合物包括AbA1、AbA2、AbA3，诸如此类。每个抗体A可以包含不同的潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，并且可以进一步包含独特的人恒定区。多个靶向复合物可以进一步包含AbB1、AbB2、AbB3，诸如此类。每个不同的抗体B可以识别其相应抗体A的人恒定区。例如，AbB1可以结合AbA1的人恒定区。
样品
MAb可以用于治疗多种疾病，最常见的是癌症或自身免疫疾病。被认为适合治疗的受试者是预期将从治疗受益或对治疗有应答的那些受试者。在某些实施方案中，样品得自患有或被怀疑患有癌症或自身免疫疾病、或处于患癌症或自身免疫疾病的风险中的受试者。癌症可能是乳腺癌、B-细胞慢性淋巴细胞性白血病、泌尿道上皮癌、非小细胞肺癌、梅克尔细胞癌、套细胞淋巴瘤、结直肠癌、前体B-细胞急性成淋巴细胞性白血病、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、前列腺癌、多发性骨髓瘤、黑素瘤、慢性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、神经母细胞瘤、软组织肉瘤、胃癌、宫颈癌、肾细胞癌、或任何其它有可用治疗剂的癌症。自身免疫疾病可能是类风湿性关节炎、青少年特发性关节炎、银屑病关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、斑块状银屑病、系统性红斑狼疮或多发性硬化或任何其它有可用治疗剂的自身免疫疾病。在其它实施方案中，样品得自患有有可用的或正在测试的单克隆治疗性抗体的任何疾病的受试者。
在某些实施方案中，所述样品可以包含或衍生自血液、血清、组织、活检物或分离自个体的细胞。在一个优选的实施方案中，组织样品可以取自癌性肿瘤组织。样品可以通过活检、刮擦或手术切除获得。样品可以是整个组织切片。在某些实施方案中，样品可以是原发性的、转移性的、III期和IV期疾病样本。在某些实施方案中，通过空芯针活检(corebiopsy)或细针抽吸可以收集肿瘤组织。或者，可以使用本文所述的其它样品。
样品制备
固定组织样品的方法是本领域普遍已知的。固定所需的时间取决于样品的大小和使用的固定剂(例如，中性缓冲的福尔马林、戊二醛、Bouin氏溶液或低聚甲醛)。在一个优选的实施方案中，用福尔马林固定组织样品。在某些实施方案中，然后将固定的样品包埋在石蜡中以制备福尔马林固定的和石蜡包埋的(FFPE)样品。在其它实施方案中，将组织样品包埋在其它切片介质中。在某些实施方案中，组织样品的厚度为至少1、2、3或4mm。在一个优选的实施方案中，组织样品为3mm厚。
在某些实施方案中，将FFPE样品切成薄片，封固在显微镜载玻片上并干燥。切片的FFPE样品为至少2、3、4或5μm厚。在一个优选的实施方案中，切片的样品为约3μm厚。可以将切片的FFPE样品封固在载玻片上并干燥。在一个优选的实施方案中，将切片的样品封固到Superfrost
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载玻片上，并在至少60、65、70、75、80或85℃干燥小于20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4或3分钟。或者，可以使用本领域已知的其它方法。
检测抗原-抗体复合物
鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的方法包括检测抗原-抗体复合物。在某些实施方案中，免疫组织化学(IHC)可用于检测样品中靶表位的存在。靶表位是治疗剂的靶标。第一抗体可用于检测组织切片内的蛋白。在某些情况下，使用缀合至检测部分的第一抗体直接检测蛋白。在其它情况下，通过针对第一抗体的缀合的第二抗体间接地检测蛋白。
鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的方法包括将样品与靶向复合物一起温育以形成抗原-抗体复合物。在某些实施方案中，所述靶向复合物包含两种抗体：抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。
在某些实施方案中，在与靶向复合物温育之前进行抗原修复。固定虽然对于保持组织形态很重要，但可能会掩蔽蛋白表位并防止抗体相互作用。表位的掩蔽可以由表位内或表位附近的肽之间的交联引起。抗原修复是一种用于暴露抗原以允许表位-抗体结合的技术。可以使用本领域普遍已知的任何抗原修复方法。在某些实施方案中，抗原修复是热介导的。在其它实施方案中，抗原修复是酶促的。抗原修复过程可能需要对样品的加热、加压蒸煮和/或蛋白酶处理以暴露抗原。
在抗原修复后，可以将组织学样品与靶向复合物一起温育。在某些实施方案中，首先将靶向复合物稀释。靶向复合物的稀释将取决于治疗剂和检测抗体。如果在样品中存在治疗剂的靶标，则靶标复合物将形成抗原-抗体复合物。
例如，治疗剂可以是曲妥珠单抗。在该情况下，如上所述，靶向复合物将包含结合至识别曲妥珠单抗的人恒定区的抗体(抗体B)的曲妥珠单抗。在与组织学样品一起温育以检测HER2蛋白之前，曲妥珠单抗靶向复合物可以根据需要进行稀释以检测特异性结合。
可以直接地或间接地确定靶向复合物与靶抗原的结合。在某些实施方案中，靶向复合物可以包含缀合至检测部分的检测抗体，如上所述。在某些实施方案中，检测部分包含荧光标签或酶。包含与检测部分缀合的抗体B的靶向复合物会结合抗原，且无需进一步抗体相互作用即可显现检测部分。
在其它实施方案中，抗体B没有缀合至检测部分。间接IHC测定可以用于检测蛋白。间接IHC测定涉及结合抗原的未缀合的第一抗体，然后使用标记的第二抗体结合第一抗体。在第二抗体缀合至酶标记物的情况下，可以添加发色或发荧光底物以提供抗原的显现。在某些实施方案中，使用针对靶向复合物的检测抗体的第二抗体间接地检测蛋白。第二抗体可以缀合至检测部分。在某些实施方案中，每种AbB可以缀合至不同的检测部分。例如，AbB1可以缀合至第一检测部分，并且AbB2可以缀合至第二检测部分。
图4显示了使用由抗体A(AbA)440和抗体B(AbB)450组成的靶向复合物对靶抗原(表位A)430的检测。AbB 450未缀合至检测部分。但是，第二抗体(2°Ab)490可以缀合至检测部分495，并用于检测第一抗体440(靶向复合物)与抗原(表位A)430的结合。
图5显示了使用由两种不同抗体A(AbA1 540和AbA2 545)和两种相应抗体B(AbB1550和AbB2 555)组成的多种不同靶向复合物检测两种不同的靶抗原(表位A1 530和表位A2535)。可以将两种不同的第二抗体(2°Ab1 590和2°Ab2 565)缀合至两个相应的检测部分(第一检测部分595和第二检测部分575)，并用于检测每种第一抗体540和545(靶向复合物)对每种相应抗原(表位A1 530或A2 535)的结合。
许多检测部分是本领域普遍已知的，并且可用于直接或间接IHC测定中。检测部分包括、但不限于放射性同位素、荧光的或化学发光的标记物和酶-底物标记物。酶-底物标记物的例子包括萤光素酶(luc)、辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP)。可以使用本领域已知的将检测部分缀合至抗体的任何方法。
对于间接IHC测定，将包含可检测部分的第二抗体在25℃或37℃应用于组织学样品30-120min，以形成免疫复合物。在某些实施方案中，在显现之前，使用洗涤步骤除去未结合的第二抗体。在某些实施方案中，使用封闭步骤限制非特异性结合。可以使用本领域已知的任何洗涤或封闭方法。
IHC测定条件的优化是本领域众所周知的。在某些实施方案中，抗原结合测定可以包括多种用于抑制非特异性结合的技术。在某些实施方案中，抗原结合测定包括用蛋白封闭剂处理样品以减少与不包含治疗性靶蛋白的背景蛋白的结合。封闭剂包括、但不限于BSA、酪蛋白HiBlock(Perkin Elmer,Waltham,MA)或蛋白封闭剂(Dako,Carpinteria,CA)。在某些实施方案中，将样品与过氧化物一起温育以阻断组织过氧化物酶。
可以使用直接或间接IHC。直接IHC测定涉及使用包含指示剂部分的试剂，其中所述试剂直接结合靶标。例如，可以用酶或荧光分子标记第一抗体。
在一个优选的实施方案中，使用商购可得的自动染色机进行IHC测定。可以使用VentanaTMBenchMark ULTRATM平台、VentanaTM DiscoveryTM、DakoTMOmnisTM、DakoTM自动染色机l_ink48TM、LeicaTM BOND RXTM、LeicaTMBOND-INTM或LeicaTMBOND MAXTM制备样品并用靶向复合物染色。例如，可以使用VentanaTMBenchMark ULTRATM平台用靶向复合物、包含可检测部分的第二抗体和复染剂对样品染色。
预测受试者应答性
在某些实施方案中，由于样品中靶标的表达的存在，确定受试者适合于治疗。相反，缺乏表达的受试者可以被认为不适合用治疗剂治疗。
在某些实施方案中，如果样品中的所有细胞的至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多表达治疗剂的靶标，那么确定患者适合于治疗。
在某些实施方案中，可以用光学显微镜解释结果。在某些实施方案中，将样品以0-10的等级评分，其中0为负且10为强正。在其它实施方案中，将样品以0-5的等级评分，其中0为负且5为强正。可以根据治疗剂来调整评分系统。
本发明的系统和试剂盒
在某些实施方案中，本发明包括系统(例如，自动化的系统)或试剂盒，其包含用于执行本文公开的方法的组件。在某些实施方案中，靶向复合物被包含在根据本发明的系统或试剂盒中。本文所述的方法也可以利用这样的靶向复合物系统或试剂盒。给定执行所述方法所需的最小量的试剂和材料，本文描述的一些实施方案特别适合用于自动化和/或试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒的每种组件可以包含可从第一部位递送至第二部位的独立单元。
在某些实施方案中，本发明包括用于鉴定可能受益于治疗剂的个体的系统或试剂盒。在某些实施方案中，系统或试剂盒可以包含用于将样品与对目标表位具有特异性的靶向复合物一起温育的组件，其中所述靶向复合物包含两种抗体：抗体A和抗体B。抗体A进一步包含潜在的治疗性单克隆抗体或其片段。在某些情况下，单克隆抗体可以包含对目标表位具有特异性的可变区和人恒定区。抗体B进一步包含识别抗体A的人恒定区的抗体。在本发明的系统和试剂盒的某些实施方案中，抗体B是在小鼠或兔中产生的多克隆或单克隆抗体。
在某些实施方案中，系统和/或试剂盒可以进一步包含用于制备样品的组件。在染色之前，可以将样品用福尔马林固定和石蜡包埋。系统和/或试剂盒可以进一步包括用于将FFPE样品切片并将样品在载玻片上干燥的组件。
在某些实施方案中，所述系统可以包括用于对样品染色和检测特定表位的存在的自动化方法。例如，在某些实施方案中，商业自动染色机可以用于用靶向复合物、标记的第二抗体和复染剂对样品染色。
另外，系统和/或试剂盒可以进一步包括用于确定检测部分的量的组件，其中检测部分的量确定受试者是否适合接受特定治疗剂的治疗。例如，在某些实施方案中，所述系统或试剂盒可以包括和/或需要用于测量萤光素酶酶活性的光度计或其它装置。
本发明的这些系统和试剂盒包括各种组件。本文中使用的术语“组件”被广义地定义，并且包括适合于执行所述方法的任何合适的设备或设备的集合。组件不需要以任何特定方式彼此整体连接或相对放置。本发明包括组件相对于彼此的任何合适布置。例如，组件不必位于同一房间。但是在某些实施方案中，所述组件在整体部件中彼此连接。在某些实施方案中，相同的组件可以执行多种功能。
计算机系统和计算机可读介质
在某些实施方案中，本发明可以包括系统。该系统可以包括至少一些本发明的组合物。并且，该系统可以包括用于执行该方法的至少一些组件。在某些实施方案中，该系统被配制成试剂盒。因此，在某些实施方案中，本发明可以包括用于鉴定可能受益于治疗剂治疗的受试者的系统，其包括：(i)获得样品；(ii)将所述样品与权利要求1-13中的任一项所述的靶向复合物一起温育，以形成抗原-抗体复合物；(iii)检测抗原-抗体复合物；和(iv)预测受试者对治疗剂的应答性。在其它实施方案中，本发明包括用于与所述方法或系统一起使用的软件。
如本技术中所描述的系统或其任何组件可以以计算机系统的形式体现。计算机系统的典型例子包括通用计算机、编程的微处理器、微控制器、周围集成电路元件以及能够实现构成本技术的方法的步骤的其它装置或装置布置。
计算机系统可以包括计算机、输入装置、显示单元和/或因特网。所述计算机可以进一步包括微处理器。微处理器可以连接到通信总线。该计算机还可以包括存储器。该存储器可以包括随机存取存储器(RAM)和只读存储器(ROM)。该计算机系统可以进一步包括存储装置。存储装置可以是硬盘驱动器或可移动存储驱动器，诸如软盘驱动器、光盘驱动器等。存储装置还可以是用于将计算机程序或其它指令加载到计算机系统中的其它类似装置。该计算机系统还可以包括通信单元。通信单元允许计算机通过输入/输出接口(I/Ointerface)连接到其它数据库和因特网。通信单元允许向其它数据库的传输以及从其它数据库接收数据。通信单元可以包括调制解调器、以太网卡或使计算机系统能够连接到数据库和网络(诸如LAN、MAN、WAN和因特网)的任何类似装置。计算机系统因此可以促进用户通过输入装置的输入，所述输入装置可以通过输入/输出接口访问该系统。
计算装置通常将包括为该计算装置的一般管理和操作提供可执行程序指令的操作系统，并且通常将包括存储指令的计算机可读存储介质(例如，硬盘、随机存取存储器、只读存储器等)，所述指令在由服务器的处理器执行时允许计算装置执行其预期功能。操作系统的适当实现和计算装置的一般功能是已知的或商购可得的，并且本领域普通技术人员可以容易地实现，尤其是考虑到本文公开内容。
计算机系统执行存储在一个或多个存储元件中的一组指令，以便处理输入数据。存储元件还可以根据需要保存数据或其它信息。该存储元件可以呈存在于处理机中的信息源或物理存储元件的形式。
如上面讨论的，工作平台(environment)可以包括多种数据存储以及其它存储器和存储介质。这些可以存在于各种位置，例如位于一个或多个计算机本地(和/或驻留在其中)或远离网络中任何或所有计算机的存储介质上。在一组特定的实施方案中，信息可以驻留在本领域技术人员熟悉的存储区域网络(“SAN”)中。类似地，可以适当地在本地和/或远程存储用于执行归于计算机、服务器或其它网络装置的功能的任何必要文件。在系统包括计算装置的情况下，每个这样的装置可以包括可经由总线电耦合的硬件元件，所述元件包括例如至少一个中央处理单元(CPU)、至少一个输入装置(例如，鼠标、键盘、控制器、触摸屏或小键盘)和至少一个输出装置(例如显示器件，打印机或扬声器)。这样的系统还可以包括一个或多个存储装置，诸如磁盘驱动器、光学存储装置和固态存储装置诸如随机存取存储器(“RAM”)或只读存储器(“ROM”)、以及可移动介质装置、存储卡、闪存卡等。
这样的装置还可以包括如上所述的计算机可读存储介质读取器、通信装置(例如，调制解调器、网卡(无线或有线)、红外通信装置等)以及工作存储器。计算机可读存储介质读取器可以与计算机可读存储介质连接或配置为接收计算机可读存储介质，所述计算机可读存储介质代表远程的、本地的、固定的和/或可移动的存储装置以及用于暂时地和/或更永久地包含、存储、传输和检索计算机可读信息的存储介质。所述系统和各种装置通常还包括位于至少一个工作存储装置内的多个软件应用程序、模块、服务或其它元件，包括操作系统和应用程序，诸如客户端应用程序或网络浏览器。应当理解，备选实施方案可以具有相对于上述实施方案的众多变化。例如，也可能使用定制的硬件和/或可能在硬件、软件(包括便携式软件，诸如小应用程序)或两者中实现特定元件。此外，可以采用与其它计算装置诸如网络输入/输出装置的连接。
用于包含代码或代码部分的非瞬态存储介质和计算机可读介质可以包括本领域中已知或使用的任何适当介质，包括存储介质和通信介质，诸如但不限于以任何方法或技术实现的易失性的和非易失性的、可移动的和不可移动的介质，其用于存储和/或传输信息，诸如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据，包括RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或其它存储技术、CD-ROM、数字多用磁盘(DVD)或其它光学存储装置、磁性盒、磁带、磁盘存储器或其它磁性存储装置，或任何其它可用于存储所需信息并可由系统装置访问的介质。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将理解实现各种实施方案的其它方式和/或方法。
计算机可读介质可以包括、但不限于能够向处理器提供计算机可读指令的电子、光学、磁性或其它存储装置。其它例子包括、但不限于软盘、CD-ROM、DVD、磁盘、存储芯片、ROM、RAM、SRAM、DRAM、内容可寻址存储器(“CAM”)、DDR、闪速存储器诸如NAND闪存或NOR闪存、ASIC、配置的处理器、光学存储器、磁带或其它磁性存储器、或计算机处理器可以从其读取指令的任何其它介质。在一个实施方案中，计算装置可以包括单一类型的计算机可读介质诸如随机存取存储器(RAM)。在其它实施方案中，计算装置可以包括两种或更多种类型的计算机可读介质，诸如随机存取存储器(RAM)、磁盘驱动器和高速缓存。计算装置可以与一个或多个外部计算机可读介质(诸如外部硬盘驱动器或外部DVD或蓝光驱动器)通信。
如以上所讨论的，该实施方案包括处理器，所述处理器被配置为执行计算机可执行程序指令和/或访问存储在存储器中的信息。所述指令可以包括由编译器和/或解释器从以任何合适的计算机编程语言书写的代码生成的处理器特异性指令，所述计算机编程语言包括例如C、C++、C#、Visual Basic、Java、Python、Perl、JavaScript和ActionScript(AdobeSystems,Mountain View,Calif.)。在一个实施方案中，计算装置包括单个处理器。在其它实施方案中，所述装置包括两个或更多个处理器。这样的处理器可以包括微处理器、数字信号处理器(DSP)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)和状态机。这样的处理器可以进一步包括可编程的电子器件诸如PLC、可编程的中断控制器(PIC)、可编程的逻辑装置(PLD)、可编程的只读存储器(PROM)、电子可编程的只读存储器(EPROM或EEPROM)或其它类似装置。
该计算装置包含网络接口。在某些实施方案中，网络接口被配置用于经由有线或无线通信链路进行通信。例如，网络接口可以允许经由以太网、IEEE 802.11(Wi-Fi)、802.16(Wi-Max)、蓝牙、红外等通过网络进行通信。作为另一个例子，网络接口可以允许通过网络诸如CDMA、GSM、UMTS或其它蜂窝通信网络进行通信。在某些实施方案中，网络接口可以允许与另一装置的点对点连接，例如经由通用串行总线(USB)、1394FireWire、串行或并行连接或类似的接口。合适的计算装置的一些实施方案可以包括两个或更多个网络接口，其用于通过一个或多个网络进行通信。在某些实施方案中，除了网络接口之外或代替网络接口，计算装置可以包括数据存储。
合适的计算装置的一些实施方案可以包括许多外部或内部装置(诸如鼠标、CD-ROM、DVD、键盘、显示器、音频扬声器、一个或多个话筒或任意其它输入或输出装置)或与之通信。例如，计算装置可以与各种用户界面装置和显示器通信。显示器可以使用任何合适的技术，包括、但不限于LCD、LED、CRT等。
用于由计算机系统执行的指令集可以包括指示处理机执行特定任务(诸如构成本技术的方法的步骤)的各种命令。指令集可以呈软件程序的形式。此外，如在本技术中那样，软件可以呈单独程序的集合、具有更大程序的程序模块或程序模块的一部分的形式。该软件还可以包括面向对象编程的形式的模块化编程。处理机对输入数据的处理可以响应于用户命令、先前处理的结果或另一处理机做出的请求。
尽管已经参考某些实施方案公开了本发明，但是在不脱离如所附权利要求所限定的本发明的范围和精神的情况下，可能对所描述的实施方案进行多种修改、改变和变化。因此，本发明无意限于所描述的实施方案，而是具有由下述权利要求及其等同方案的措辞所限定的整个范围。
实施例
实施例1.用于鉴定可能受益于曲妥珠单抗治疗的受试者的免疫组织化学测定
从来自乳房的癌性肿瘤组织获得3mm或更小的组织切片。在室温(15-25℃)将组织在体积为组织体积的15-20倍的10％中性缓冲的福尔马林(NBF)中固定不少于4小时且不超过8小时。接着，将固定的组织包埋在石蜡中。石蜡固定和包埋的组织可稳定至少2年，并且应在15-25℃储存。使用测微计从每个FFPE样品切下5μm厚的连续切片，并将切片封固在plus载玻片(例如，Superfrost Plus载玻片)上。通过加热到60℃保持1小时，将样品脱蜡。使用pH 6的柠檬酸盐缓冲液并在蒸笼中蒸煮样品60分钟来执行热诱导的抗原修复。从蒸笼中取出载玻片并冷却5分钟。用PBS缓冲液洗涤样品3次，每次3分钟。在室温用酪蛋白溶液封闭内源性蛋白10分钟。用PBS缓冲液洗涤样品3次，每次3分钟。在室温将样品用含有5％FCS的PB缓冲液封闭30分钟。在含有5％FCS的PBS中1:20至1:40稀释曲妥珠单抗靶向复合物。靶向复合物是结合到识别曲妥珠单抗的人恒定区的小鼠抗-人IgG上的曲妥珠单抗。将样品与靶向复合物在4℃温育过夜。用PBS缓冲液洗涤样品3次，每次3分钟。
用抗-小鼠HRP-标记的第二抗体覆盖样品，并在室温温育30分钟。用PBS缓冲液洗涤样品3次，每次3分钟。通过每1ml DAB-底物缓冲液添加2滴DAB-色原体来制备DAB，并混合在一起。用制备好的DAB色原体溶液覆盖样品，并温育10分钟。用水洗涤载玻片，并用hemalaun复染2分钟。将载玻片用水洗涤，脱水，然后将其封固在永久性封固介质(例如，Pertex)中。在光学显微镜下检查载玻片以评价染色和对样品评分。
实施例2.使用Ventana Benchmark XT XT ultraView DAB鉴定可能受益于曲妥珠单抗治疗的受试者的免疫组织化学测定
从来自乳房的癌性肿瘤组织获得3mm或更小的组织切片。在室温(15-25℃)将组织在体积为组织体积的15-20倍的10％中性缓冲的福尔马林(NBF)中固定不少于4小时且不超过8小时。接着，将固定的组织包埋在石蜡中。石蜡固定和包埋的组织可稳定至少2年，并且应在15-25℃储存。使用测微计从每个FFPE样品切下4μm厚的连续切片，并将切片封固在plus载玻片(例如，Superfrost Plus载玻片)上。将样品在载玻片上在80℃干燥15分钟。
在来自Ventana的抗体稀释液中以1:20至1:5稀释曲妥珠单抗靶向复合物。用稀释的曲妥珠单抗靶向复合物填充Ventana抗体分配器。Ventana染色程序包括用CellConditioner 2(pH 6)预处理60分钟，然后与1:20-1:50曲妥珠单抗靶向复合物一起在37℃温育32分钟。抗体温育后，执行Ventana标准信号放大，ultraWash，用一滴苏木精复染4分钟和用一滴蓝化试剂复染4分钟。
对于生色检测，使用UltraView Universal DAB检测试剂盒(Ventana)。将载玻片从染色机取下，用一滴洗涤剂在水中清洗并封固。在光学显微镜下检查载玻片以评价染色和对样品评分。
实施例3.使用Ventana Benchmark XT XT ultraView DAB鉴定可能受益于曲妥珠单抗和多西他赛治疗的受试者的免疫组织化学测定
从来自乳房的癌性肿瘤组织获得3mm或更小的组织切片。在室温(15-25℃)将组织在体积为组织体积的15-20倍的10％中性缓冲的福尔马林(NBF)中固定不少于4小时且不超过8小时。接着，将固定的组织包埋在石蜡中。石蜡固定和包埋的组织可稳定至少2年，并且应在15-25℃储存。使用测微计从每个FFPE样品切下4μm厚的连续切片，并将切片封固在plus载玻片(例如，Superfrost Plus载玻片)上。将样品在载玻片上在80℃干燥15分钟。
在来自Ventana的抗体稀释液中以1:20至1:5稀释曲妥珠单抗靶向复合物。在来自Ventana的抗体稀释液中以1:20至1:5稀释多西他赛靶向复合物。用稀释的曲妥珠单抗靶向复合物和稀释的多西他赛靶向复合物填充Ventana抗体分配器。Ventana染色程序包括用Cell Conditioner 2(pH 6)预处理60分钟，然后与1:20-1:50曲妥珠单抗靶向复合物和1:20-1:50多西他赛靶向复合物一起在37℃温育32分钟。抗体温育后，执行Ventana标准信号放大，ultraWash，用一滴苏木精复染4分钟和用一滴蓝化试剂复染4分钟。
对于生色检测，使用UltraView Universal DAB检测试剂盒(Ventana)和使用UltraView Universal AP检测试剂盒(Ventana)。将载玻片从染色机取下，用一滴洗涤剂在水中清洗并封固。在光学显微镜下检查载玻片以评价染色和对样品评分。

Claims (43)

1.一种靶向复合物，其包含：
(i)抗体A，其中抗体A是潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，所述抗体A包含：
(a)对目标表位具有特异性的可变区，和
(b)人恒定区；和
(ii)抗体B，其中抗体B识别抗体A的人恒定区。
2.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述单克隆抗体是IgG。
3.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述单克隆抗体片段是Fab片段。
4.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述可变区是小鼠的。
5.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述单克隆抗体是完全人的。
6.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述单克隆抗体是嵌合的。
7.权利要求1所述的靶向复合物，其中所述单克隆抗体是人源化的。
8.权利要求1所述的靶向复合物，其中抗体B是单克隆抗体或多克隆抗体。
9.权利要求1所述的靶向复合物，其中针对抗体A的人恒定区在动物中产生抗体B。
10.权利要求9所述的靶向复合物，其中所述动物是小鼠或兔。
11.权利要求1所述的靶向复合物，其中将抗体B缀合至检测部分。
12.权利要求11所述的靶向复合物，其中所述检测部分包含荧光团、荧光蛋白、颗粒或酶中的至少一种。
13.权利要求12所述的靶向复合物，其中所述酶包含萤光素酶、磷酸酶、过氧化物酶或糖苷酶中的至少一种。
14.一种制备靶向复合物的方法，所述方法包括：
(i)使抗体A与抗体B反应，
其中抗体A是潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，其包含：
(a)对目标表位具有特异性的可变区，和
(b)人恒定区，
其中抗体B识别抗体A的人恒定区；和
(ii)纯化所述靶向复合物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体是IgG。
16.权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体片段是Fab片段。
17.权利要求14所述的方法，其中所述可变区是小鼠的。
18.权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体是完全人的。
19.权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合的。
20.权利要求14所述的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
21.权利要求14所述的方法，其中抗体B是单克隆抗体或多克隆抗体。
22.权利要求14所述的方法，其中针对抗体A的人恒定区在动物中产生抗体B。
23.权利要求22所述的方法，其中所述动物是小鼠或兔。
24.权利要求14所述的方法，其中抗体B缀合至检测部分。
25.权利要求24所述的方法，其中所述检测部分包含荧光团、荧光蛋白、颗粒或酶中的至少一种。
26.权利要求25所述的方法，其中所述酶包含萤光素酶、磷酸酶、过氧化物酶或糖苷酶中的至少一种。
27.权利要求14所述的方法，其中使用过滤、离心和洗涤中的至少一种除去所有未结合的抗体A和未结合的抗体B来纯化所述靶向复合物。
28.一种用于鉴定能够受益于治疗剂治疗的受试者的方法，所述方法包括：
(i)获得样品；
(ii)将所述样品与权利要求1所述的靶向复合物一起温育，以形成抗原-抗体复合物；
(iii)检测所述抗原-抗体复合物；和
(iv)预测受试者是否对所述治疗剂有应答。
29.权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂是单克隆抗体。
30.权利要求28所述的方法，其中所述靶向复合物包含：
(i)抗体A，其中抗体A是潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，其包含：
(a)对目标表位具有特异性的可变区，和
(b)人恒定区；和
(ii)抗体B，其中抗体B识别抗体A的人恒定区。
31.权利要求28所述的方法，其中所述受试者是诊断出癌症的患者。
32.权利要求28所述的方法，其中所述受试者是诊断出自身免疫疾病的患者。
33.权利要求28所述的方法，其中所述样品是组织样品。
34.权利要求33所述的方法，其中所述组织样品来自肿瘤。
35.权利要求28所述的方法，其中通过免疫组织化学执行所述检测步骤。
36.权利要求35所述的方法，其中检测步骤包括将所述样品与包含检测部分的第二抗体一起温育。
37.权利要求36所述的方法，其中所述检测部分包含荧光团、荧光蛋白、颗粒或酶中的至少一种。
38.权利要求37所述的方法，其中所述酶包含萤光素酶、磷酸酶、过氧化物酶或糖苷酶中的至少一种。
39.权利要求28所述的方法，其中所述预测步骤包括对所述样品评分。
40.权利要求28所述的方法，其中将所述样品与多种不同的靶向复合物一起温育。
41.权利要求40所述的方法，其中所述多种靶向复合物包含：
i)AbA1、AbA2、AbA3等，其中每种抗体A是不同的潜在的治疗性单克隆抗体或其片段，其包含：
(a)对目标表位具有特异性的可变区，和
(b)人恒定区；和
(ii)AbB1、AbB2、AbB2等，其中每种不同的抗体B识别其对应抗体A的人恒定区。
42.用于鉴定能够受益于治疗剂的受试者的试剂盒，其包含权利要求1-13中的任一项所述的靶向复合物。
43.用于鉴定能够受益于治疗剂的受试者的系统，其包含权利要求1-13中的任一项所述的靶向复合物。
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