CN111961084B - 一种肺癌细胞抑制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肺癌细胞抑制剂及其制备方法，该抑制剂为配合物:六氟磷酸化·2,12,13‑三甲基吡啶并[3,2‑a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5‑c]吩嗪·二‑3‑甲基‑2‑苯基吡啶合铱(III)。其以8‑羟基喹啉为原料，通过氧化、关环、缩合、螯合等步骤，合成喹啉类配体和铱(III)配合物。本发明得到的产品肺癌细胞抑制剂具有优异的抗肿瘤活性，能够应用于抗肺癌、膀胱癌、胃癌、宫颈癌、肝癌细胞药物中，对肺癌细胞的抑制作用尤为良好。
Description
技术领域
本发明涉及抗癌药物技术领域，具体涉及肺癌细胞抑制剂及制备方法。
背景技术
在医学上，癌症(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，是恶性肿瘤中最常见的一类。据统计每年新发癌症将达1500多万，死亡1000万，死亡率较高，癌症正成为新世纪人类第一杀手，为了挽救生命，保护人类健康，抗癌新药的研发已经成为世界新药研发的重要课题之一。
肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤，绝大多数肺癌起源于支气管粘膜上皮，故亦称支气管肺癌。传统肺癌治疗手段，多以手术切除、放疗、化疗为主，但是毒复作用非常大，特别是放疗、化疗在杀死癌细胞的同时对正常组织伤害也非常大。而手术切除时常伴随着复发转移。
目前已有不少抗癌药物研发生产，并投入正常的医药治疗，但是也普遍存在些不足：A，传统化疗药物：可以杀死癌细胞，但损伤人体的正常细胞和内脏，毒副作用严重；对已转移的肺癌患者往往无效。
B，单抗类药物：对转移性肺癌有效，但容易产生耐用性，有效期不长，对延长转移性肺癌患者生命有限。
C，小分子类药物：具有良好的发展势头，但依然存在对靶点过于单一，可应用的药物种类过少等问题，很多晚期肺癌患者找不到合适药物进行治疗。
不管是哪种抗癌药物除了身体损伤外，销售价格也让许多癌症患者难以承受，因此对患者来说是双重压力。因此寻找到能够抑制肺癌细胞的生长扩散，甚至使其死亡的药物或抑制剂是一种研究趋势，同时对人体的毒副作用小，价格上能够较为亲民的是重中之重。
发明内容
本发明的目的就是提供一种肺癌细胞抑制剂及制备方法。该抑制剂具有稳定性好，合成方法简单，抑制能力强的特点，同时具有很强的抗肿瘤活性，能为抗肺癌药物的研发提供理论指导。
本发明的技术方案：
一种肺癌细胞抑制剂，其结构式如下：
本发明的肺癌细胞抑制剂化学名称为：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，简写为MPytMP-Ir。
本发明的肺癌细胞抑制剂中铱是三价金属阳离子。本发明中的肺癌细胞抑制剂的分子量为1037.27。
本发明的肺癌细胞抑制剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)6,7-二氯喹啉-5,8-二酮的合成
将8-羟基喹啉(记作化合物1)、浓盐酸加入到容器中，温度加热到40-45℃，待在8-羟基喹啉完全溶解后用缓慢加入NaClO3，8-羟基喹啉与NaClO3摩尔比为1:5-6；添加完成后保持在40-45℃继续搅拌反应1-3h；反应结束后用冰水稀释，此时会产生大量白色沉淀，将白色沉淀过滤并去掉，滤液萃取，合并有机相，水洗，旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体重结晶，即可得到6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
(2)化合物3的合成
将6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和无水碳酸钾按照摩尔比为1:1-2加入到容器中，再加入乙醇作为溶剂，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶进行反应，加入的2-氨基-5-甲基吡啶的量与6,7-二氯喹啉-5,8-二酮的摩尔比为2-3:1，反应混合物在80-85℃下回流15-20h，冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到9-甲基吡啶并[2',1':2,3]咪唑并[4,5-h]喹啉-5,8-二酮，记作化合物3；
(3)化合物4的合成
称取化合物3加入容器中，加入无水乙醇和乙酸搅拌溶解，再按化合物2-3与4,5-二甲基邻苯二胺摩尔比为1:1-2称取4,5-二甲基邻苯二胺加入到容器中，80-90℃下回流反应，冷却析出金黄色沉淀，过滤，固体重结晶即可得到2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪，记作化合物4；
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的合成
按摩尔比为1-2:1分别称取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)，水合三氯化铱投入容器中，再依次加入乙二醇乙醚、水；通入氮气，加热至120-150℃回流24-48h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，醇洗，真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2；
(5)铱(III)配合物的合成
称取二氯桥铱中间体与化合物4按照摩尔比为1:1-2，投入容器中，再加入乙二醇，氩气保护下加热回流10-15h，得深红色澄清溶液；冷却至室温，加水稀释后，再加入饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀；抽滤，用水、乙醚洗涤、干燥；将干燥后的粗产品用乙腈溶解，用中性氧化铝过柱分离；用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝3：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然后减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂，六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir；记作化合物5。
作为技术方案的优选，所述步骤(1)8-羟基喹啉与浓盐酸质体比为1:40-50。
作为技术方案的优选，所述步骤(1)中白色沉淀去掉后的滤液用CH2Cl2萃取，合并有机相，蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂，得到黄色固体，过滤沉淀，固体用甲醇重结晶，即可得到6,7-二氯喹啉-5,8-二酮。
作为技术方案的优选，所述步骤(2)中乙醇的加入量为每摩尔6,7-二氯喹啉-5,8-二酮加1500-2500mL。
作为技术方案的优选，所述步骤(3)中回流反应时间为10-60min；固体采用邻二氯苯进行重结晶。所述步骤(3)中每摩尔化合物3加入5-15L无水乙醇和3-5L乙酸。步骤(3)中加入乙酸起催化作用，乙醇起到溶剂作用。
作为技术方案的优选，所述步骤(4)中每摩尔水合三氯化铱加入15-18L乙二醇乙醚和5-6L水；所述步骤(5)中每摩尔二氯桥铱中间体加入100-150L乙二醇。
本发明的肺癌细胞抑制剂，它在主要再制备抗肺癌细胞药物中的应用。还可扩大应用到膀胱癌、胃癌、宫颈癌、肝癌细胞药物生产指导中。
本发明的化学反应式：
本发明各组分在肺癌细胞抑制中的作用：
铱(III)的作用：与DNA的某些亲核基团(如磷酸氧位点或碱基氮、氧位点)直接螯合，引起癌细胞的DNA损伤，使DNA在复制和转录当中受到障碍，从而阻止了癌细胞的生长和分裂，并导致其死亡。
六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)的作用：有利于插入DNA的双螺旋的碱基对之中。
本发明的有益效果：
本发明的肺癌细胞抑制剂，分子结构稳定，合成方法简单。该肺癌细胞抑制剂中，由于三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶的引入，大大增强了配合物的细胞跨膜能力。同时抗肿瘤实验表明，该类配合物具有很强的抗肿瘤活性，其对NCI-H460(人大细胞肺癌细胞)、T-24(人膀胱癌细胞)、MGC–803(胃癌细胞)、HeLa229(宫颈癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)和BEL-7404(肝癌细胞)增殖的抑制能力比顺铂好。尤其对肺癌细胞的抑制表现出特别好的效果。本发明的产品在抗肿瘤药物方面将具有极大的应用潜力，为制备抗肺癌、膀胱癌、胃癌、宫颈癌、肝癌细胞药物提供理论指导。
附图说明
图1为本发明的肺癌细胞抑制剂的结构式。
图2为本发明肺癌细胞抑制剂的红外光谱图，MPytMP-Ir的红外光谱数据为(KBr,cm–1)：3661,3051,2929,2366,1625,1578,1540,1475,1339,1334,1296,1270,1109,1024,837,724,565。
图3为本发明肺癌细胞抑制剂的核磁共振氢谱图，MPytMP-Ir的氢谱数据为1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),9.14(s,1H),8.17–7.90(m,6H),7.83(s,2H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(d,J＝9.4Hz,1H),7.16(dt,J＝37.3,7.7Hz,4H),7.05–6.95(m,2H),6.89–6.79(m,1H),6.41(dd,J＝12.8,7.5Hz,2H),6.05(d,J＝9.1Hz,1H),2.85(s,3H),2.83(s,3H),2.51(s,3H),2.50(s,3H),2.46(s,3H)。
图4为本发明肺癌细胞抑制剂的核磁共振碳谱图，MPytMP-Ir的碳谱数据为13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ165.57,165.05,149.34,148.87,146.96,146.90,146.45,145.35,143.49,143.37,143.10,142.86,139.36,138.61,138.14,135.99,133.06,132.71,132.54,131.69,129.63,129.27,129.07,128.76,127.08,126.82,125.93,123.46,122.76,122.62,119.88,113.68,23.20,23.09,20.52,20.32,18.32。
图5为本发明肺癌细胞抑制剂的质谱图，MPytMP-Ir的质谱为ESI-MS m/z:Calculated MS:892.2740,found:892.2741[M-PF6]+。
图6为本发明实施例1的肺癌细胞抑制剂对六种人肿瘤细胞BEL–7404(人肝癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、NCI–H460(人肺癌细胞)、T–24(膀胱癌细胞)、MGC–803(人胃癌细胞)和HeLa229(人宫颈癌细胞)的半抑制浓度(IC50)的柱状图。
图7为AnnexinV-FITC/PI双染色法检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460癌细胞作用24h后的凋亡情况。
图8为TRAP检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460细胞端粒酶活性抑制的影响。
图9为Western Blot检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460细胞原癌基因c-myc和hTERT表达量影响。
图10为流式细胞分析检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460细胞周期的作用。
图11为Western Blot检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460细胞凋亡和周期相关蛋白表达量分布图。
图12为JC-1检测MPytMP-Ir(5nM)对NCI-H460细胞线粒体膜电位变化。
具体实施方式
下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。
以下实施例中，
化合物2：6,7-二氯喹啉-5,8-二酮；
化合物3：9-甲基吡啶并[2',1':2,3]咪唑并[4,5-h]喹啉-5,8-二酮；
化合物4：2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪；
化合物5：(肺癌细胞抑制剂)：本发明产品，六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，简写为MPytMP-Ir。
实施例1
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入600mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到40℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入53gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在40℃继续搅拌2h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和1.363g无水碳酸钾(0.01mol)加入到50mL的圆底烧瓶中加入20mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.16g(0.02mol),反应混合物在84℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇和3mL乙酸，搅拌30min，称取1.9mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，80℃下回流10min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(席夫碱类物质)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.4056g(2.4mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚18mL，去离子水6mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至120℃回流24h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.2mmol化合物4，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流10h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝2：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约92％，其结构式见图1。
实施例2
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入725mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到45℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入64gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在45℃继续搅拌1h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和2.73g(0.02mol)无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中加入25mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶3.24g(0.03mol),反应混合物在85℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加，14mL无水乙醇和5mL乙酸，搅拌60min，称取2.0mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，80℃下回流10min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.21g(1.2mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚15mL，去离子水5mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至150℃回流36h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.2mmol化合物4，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流15h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝2：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约90％。
实施例3
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入580mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到42℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入58gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在42℃继续搅拌3h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和2.05g(0.015mol)无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中加入15mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.7g(0.02mol)，反应混合物在80℃下回流20h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇和3mL乙酸，搅拌30min，称取1.0mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，90℃下回流30min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.31g(1.8mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚16mL，去离子水5.5mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至150℃回流24h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.1mmol化合物3，10mL乙二醇，氩气保护下加热回流12h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝2：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约91％。
实施例4
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入600mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到40℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入53gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在40℃继续搅拌2h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和1.363g无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中加入20mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.16g(0.02mol),反应混合物在84℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇和4mL乙酸，搅拌30min，称取1.9mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，85℃下回流30min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.4056g(2.4mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚18mL，去离子水6mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至120℃回流48h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.2mmol化合物4，12mL乙二醇，氩气保护下加热回流10h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝3：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约91.8％。
实施例5
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入600mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到40℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入53gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在40℃继续搅拌2.5h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和2.7g无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中加入30mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.16g(0.02mol)，反应混合物在84℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇和5mL乙酸，搅拌30min，称取1.5mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，85℃下回流20min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.4056g(2.4mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚18mL，去离子水6mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至150℃回流36h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.2mmol化合物4，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流10h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30L饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝3：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约90.5％。
实施例6
一、本发明的制备方法：
(1)化合物2的制备：小心在1L的圆底烧瓶加入600mL的浓盐酸(实验前置于冰箱冰冻)和14.5g 8-羟基喹啉，温度加热到40℃，待8-羟基喹啉完全溶解后，分批加入53gNaClO3(60分钟内加完)，加完后在40℃继续搅拌2h。反应结束后小心用冰水稀释到2L，用CH2Cl2(6×250mL)萃取，合并有机相，用3×200mL的蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体用40mL的甲醇重结晶三次，得到较纯6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
(2)化合物3的制备：将2.28g(0.01mol)的6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和1.363g无水碳酸钾加入到50mL的圆底烧瓶中加入20mL的乙醇，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶2.16g(0.02mol),反应混合物在84℃下回流15h。冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到化合物3。
(3)化合物4的制备：称取1mmol的化合物3加入到50mL圆底烧瓶中，加入5mL无水乙醇和3mL乙酸，搅拌30min，称取1.9mmol的4,5-二甲基邻苯二胺加入到烧瓶中(用少量乙醇4mL溶解后加入)，80℃下回流30min(如果还不溶解，则继续回流至溶解为止)，冷却析出金黄色沉淀(即为席夫碱)，过滤，固体重结晶即可得到化合物4。
(4)二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的制备：取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)0.4056g(2.4mmol)，水合三氯化铱0.423g(1.2mmol)，乙二醇乙醚18mL，去离子水6mL。所有药品依次加入到50mL烧瓶后，通氮气，加热至120℃回流36h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入200mL去离子水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，乙醇洗，45℃真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2。
(5)肺癌细胞抑制剂的制备：在100mL三口烧瓶中加入0.1mmol二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2，0.2mmol化合物4，15mL乙二醇，氩气保护下加热回流10h，得深红色澄清溶液。冷却至室温，加水40mL稀释后，加入30mL饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀。抽滤，用水、乙醚洗涤数次后干燥。将干燥后的粗产品溶解，用中性氧化铝(200目)过柱分离。用V(二氯甲烷)：V(乙腈)＝2：1混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂：六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir，产率约90.2％。
二、产品检验
1、产品确认检测
将本发明实施例1最终得到的产物经过电喷雾质谱、核磁共振谱、红外光谱和元素分析进行结构测定(如图2-图5所示)，确定目标配合物为MPytMP-Ir:C47H37N7Ir，具体的波谱特性如下：
MPytMP-Ir核磁共振谱：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),9.14(s,1H),8.17–7.90(m,6H),7.83(s,2H),7.72(d,J＝7.6Hz,1H),7.59(d,J＝9.4Hz,1H),7.16(dt,J＝37.3,7.7Hz,4H),7.05–6.95(m,2H),6.89–6.79(m,1H),6.41(dd,J＝12.8,7.5Hz,2H),6.05(d,J＝9.1Hz,1H),2.85(s,3H),2.83(s,3H),2.51(s,3H),2.50(s,3H),2.46(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ165.57,165.05,149.34,148.87,146.96,146.90,146.45,145.35,143.49,143.37,143.10,142.86,139.36,138.61,138.14,135.99,133.06,132.71,132.54,131.69,129.63,129.27,129.07,128.76,127.08,126.82,125.93,123.46,122.76,122.62,119.88,113.68,23.20,23.09,20.52,20.32,18.32.
MPytMP-Ir电喷雾质谱：ESI-MS m/z:Calculated ms:892.2740,found:892.2741[M-PF6]+.
元素分析C47H37N7Ir实测值(计算值)/％：C,63.28(63.22)；H,4.18(4.23)；N,10.99(10.91)；Ir,21.55(21.64)；
因此，可确定上述土黄色沉淀为六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)，即MPytMP-Ir。
2、产品抑制活性检测：
为了充分说明本发明产物六氟磷酸化·2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪·二-3-甲基-2-苯基吡啶合铱(III)配合物在制药中的用途，申请人以顺铂为阳性对照，对实施例1所得的抑制剂对多种人类肿瘤细胞株进行了体外抑制活性实验。
(1)用二甲基亚砜(DMSO)分别将MPytMP-Ir和顺铂配成2.0×10-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH＝7.35)为0.1mol·L-1的三羟甲基氨基甲烷—盐酸(Tris-HCl)，MTT试剂(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)的浓度为5mg/mL。
(2)BEL-7404(人肝癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)、NCI-H460(人肺癌细胞)、T-24(膀胱癌细胞)、MGC-803(人胃癌细胞)和HeLa229(人宫颈癌细胞)细胞株均置于37℃、5％CO2充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10％灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。
(3)将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1％，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。
(4)取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5％CO2充分湿化条件下培养24h。
(5)待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。
(6)继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μL DMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。
(7)空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值(
值)，计算细胞增殖抑制率。可根据公式计算化合物的抑制率：抑制率＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。
(8)所有实验均重复3次后取平均值。得到本发明的MPytMP-Ir和其对六种人肿瘤细胞的抑制率，采用Bliss法计算得到相应化合物的半数抑制浓度IC50如图6和表1所示。
表1MTT法分析抑制剂及顺铂对不同细胞株的IC50值(μM)
从图6及表1可见，本发明实施例1所制得的产物MPytMP-Ir，对六种人肿瘤细胞株均表现出显著的体外抗肿瘤活性，其IC50在5.05nM-9.95μM之间。与临床用铂类药物顺铂相比，MPytMP-Ir对NCI-H460肺癌细胞株，表现出比顺铂更高的体外增殖抑制活性。
3、产品对肺癌细胞凋亡的影响性能检测：
(1)移取1mL细胞悬浮液(约4×105个细胞)接种在6孔培养板中，并将其放置于CO2培养箱培养24h。
(2)当细胞生长到85％左右时，更换培养液，加入不同浓度的样品到各培养孔，并设置空白对照实验组，继续反应24h，用PBS缓冲溶液清洗两遍，消化收集细胞于EP管内，离心并去除细胞上清液，PBS清洗。
(3)向每个EP管加入100μL的结合缓冲液后得到细胞悬浮液，加入5μL Annexin V(膜联蛋白)和5μL PI(碘化丙啶)结合液到每个EP管中，空白组只加入Annexin V，室温下避光染色15min后，尽快上流式细胞仪检测。
由图7知空白对照细胞早期凋亡和晚期凋亡的百分比分别为8.5％和8.8％。与空白对照组比较，MPytMP-Ir处理过的NCI-H460癌细胞凋亡早期细胞(Q4)比例都有较大幅度的增加(62.8％)；NCI-H460癌细胞凋亡晚期(Q2)所占比例也出现了增加(29.8％)。MPytMP-Ir诱导NCI-H460癌细胞的早期凋亡都比晚期凋亡比例大。由此可推断出MPytMP-Ir诱导NCI-H460细胞可能经历早期凋亡。
4、产品对肺癌细胞端粒酶活性抑制的影响性能检测：
(1)从NCI-H460细胞提取端粒酶后，取20mM Tris–HCl(pH 7.4)缓冲溶液,50μMdNTPs(三磷酸脱氧核苷酸溶液),1.5mM MgCl2溶液，63mM KCl，1mM EGTA(钙离子螯合剂)，0.005％Tween 20，20μg/mL BSA，3.5pmol HTG21，18pmol TS，22.5pmol CXext，7.5pmolNT，0.01amol TSNT，2.5U Taq-DNA-polymerase，100ng NCI-H460细胞端粒酶提取物混合物，滴加5μL铱配合物溶液和5μL灭菌超纯水，再进行培养，变性，退火，延伸等步骤，一共进行共30个循环。
(2)上述PCR扩增结束后，取10μL PCR产物，加入8μL TBE缓冲液，0.2％溴酚兰和0.2％二甲苯蓝，加载15μL 16％非变性聚丙烯酰胺凝胶到TBE缓冲液中，在电压220V垂直电泳1h。
(3)将以上凝胶置于硝酸银染液染色。
由图8可知，MPytMP-Ir对NCI-H460细胞有明显抑制作用，其抑制活性高达49.40％。这表明MPytMP-Ir可能是通过端粒酶的抑制作用进而诱导NCI-H460细胞凋亡。
5、产品对肺癌细胞相关原癌基因的表达水平性能检测：
(1)提取蛋白：细胞分别用受测样品处理培养24h后，收集细胞后使用缓冲溶液(150mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH＝7.4，10％甘油，1％Triton X-100,10mM NaF,5mM焦磷酸钠，5mM原钒酸钠0.1％SDS)和蛋白酶抑制剂溶解裂解。
(2)转膜：总蛋白提取(50μg)加载到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后再转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜使用5％在TBST中牛血清白蛋白阻滞，再与相应抗体继续4℃培养过夜。在培养品提取得到相应单抗体，清洗，用过氧化物酶偶联的二抗孵育PVDF膜120min。
(3)免疫反应：免疫反应信号的检测采用增强型化学发光试剂盒按照用户手册中的程序进行操作，同时通过检测β-actin(肌动蛋白)的含量以确保化学发光成像系统X光片上蛋白泳道中含有等量的蛋白。
如图9可见，NCI-H460细胞在MPytMP-Ir处理24h后，NCI-H460细胞中的c-myc mRNA和hTERT mRNA(两种原癌调节基因)表达水平显著下降，也就是说MPytMP-Ir(5nM)明显抑制了NCI-H460细胞中c-myc和hTERT蛋白的表达。结果再次表明，MPytMP-Ir(5nM)抑制c-myc和hTERT表达的效果优于顺铂(11μM)。由此可推断出MPytMP-Ir诱导NCI-H460细胞凋亡可能是通过抑制端粒酶活性途径。
6、产品对肺癌细胞周期的影响性能检测：
(1)移取1mL细胞悬浮液(约4×105个细胞)接种在80mL CO2培养箱培养24h。当细胞生长到85％时更换培养液，加入受测样品到培养箱，并设置空白对照实验组，继续反应48h，收集细胞。
(2)在Vorte震荡的同时缓慢滴加入10mL 70％的乙醇，固定细胞后保存在-20℃的冰箱中培养24h。
(3)用PBS缓冲溶液清洗两遍，消化收集细胞于EP管内，离心并去除细胞上清液，PBS清洗。
(4)向每个EP管加入100μL的结合缓冲液后得到细胞悬浮液，加入5μL Annexin V(膜联蛋白)和5μL PI(碘化丙啶)结合液到每个EP管中，空白组只加入Annexin V，室温下避光染色15min后，尽快上流式细胞仪检测。
由图10我们可以看到与空白相比，MPytMP-Ir处理后的细胞处于G1期(合成相关的蛋白期)的细胞百分比增加了15.39％，同时伴随着G2/M(有丝分裂期)和S期(DNA的合成期)的细胞百分比的降低。这说明MPytMP-Ir对肿瘤细胞的抑制作用可能是通过将细胞阻滞于G1期。
7、产品对肺癌细胞周期相关蛋表达水平性能检测：
检测方法同上面(5、产品对肺癌细胞的性能检测)，得到图11的结果图。由图11可见，浓度为5nM MPytMP-Ir均使细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)和细胞周期蛋白(cyclinD1)的表达量显著降低，这与流式细胞仪检测MPytMP-Ir对肿瘤细胞周期阻滞在G1期的结果一致。
8、产品对肺癌细胞线粒体膜电位变化的性能检测
(1)移取1mL细胞悬浮液(约4×105个细胞)接种在6孔培养板中，并将其放置于CO2培养箱培养24h。
(2)当细胞生长到85％左右时，更换培养液，加入不同浓度的样品到各培养孔，并设置空白对照实验组，继续培养24h，去掉上清夜，再与5μg/μL的线粒体膜电位(JC-1)的试剂37℃下培养20min，在荧光显微镜下观察检测线粒体膜电位变化。
从图12中可以看出，与空白对照，空白组的早期绿红荧光比率为8.51％。被浓度均为5nM MPytMP-Ir与NCI-H460细胞作用24h后，早期细胞凋亡绿红荧光比率均增大。MPytMP-Ir处理后的细胞绿红荧光比率显著增大到92.2％。综上述结果可以说明配合物MPytMP-Ir很可能是通过降低线粒体膜电位来诱导NCI-H460细胞发生凋亡的，这也更加有力地证明了MPytMP-Ir能够诱导NCI-H460细胞产生早期凋亡。此外，MPytMP-Ir诱导细胞色素C(cytochrome c)和凋亡诱导因子(apaf-1)基因表达水平上调均显著(图11)。
以上数据表明，本发明所述的实施例1所制得的产物在抗肿瘤药物方面具有十分广阔的应用前景，有望用于制备膀胱癌和人大细胞肺癌细胞的抗肿瘤药物。
Claims (9)
1.一种肺癌细胞抑制剂，其特征在于：其结构式如下：
2.根据权利要求1所述的肺癌细胞抑制剂，其特征在于：它在制备抗肺癌细胞药物中的应用。
3.一种如权利要求1或2所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：它的制备方法包括如下步骤：
（1）6,7-二氯喹啉-5,8-二酮的合成
将8-羟基喹啉、浓盐酸加入到容器中，温度加热到40-45 ℃，待在8-羟基喹啉完全溶解后用缓慢加入NaClO3，8-羟基喹啉与NaClO3摩尔比为1:5-6；添加完成后保持在40-45 ℃继续搅拌反应1-3 h；反应结束后用冰水稀释，此时会产生大量白色沉淀，将白色沉淀过滤并去掉，滤液萃取，合并有机相，水洗，旋蒸出溶剂得到黄色固体，过滤沉淀，固体重结晶，即可得到6,7-二氯喹啉-5,8-二酮，记作化合物2；
（2）化合物3的合成
将6,7-二氯喹啉-5,8-二酮和碳酸钾按照摩尔比为1:1-2加入到容器中，再加入乙醇作为溶剂，搅拌使6,7-二氯喹啉-5,8-二酮溶解完全，分批加入2-氨基-5-甲基吡啶进行反应，加入的2-氨基-5-甲基吡啶的量与6,7-二氯喹啉-5,8-二酮的摩尔比为2-3:1，反应混合物在80-85 ℃下回流15-20 h，冷却至室温，沉淀过滤，用邻二氯苯重结晶，即可得到9-甲基吡啶并[2',1':2,3]咪唑并[4,5-h]喹啉-5,8-二酮，记作化合物3；
（3）化合物4的合成
称取化合物3加入容器中，加入乙醇和乙酸搅拌溶解，再按化合物3与4,5-二甲基邻苯二胺摩尔比为1:1-2称取4,5-二甲基邻苯二胺加入到容器中，80-90 ℃下溶解回流反应，冷却析出金黄色沉淀，过滤，固体重结晶即可得到2,12,13-三甲基吡啶并[3,2-a]吡啶并[1',2':1,2]咪唑并[4,5-c]吩嗪，记作化合物4；
（4）二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2的合成
按摩尔比为1-2:1分别称取3-甲基-2-苯基吡啶(3-mppy)，水合三氯化铱投入容器中，再依次加入乙二醇乙醚、水；通入氮气，加热至120-150 ℃回流24-48 h，反应结束后，自然冷却至室温，向反应液中倒入水，搅拌析出大量黄色沉淀，过滤，水洗，醇洗，真空干燥得到黄色固体，即为二氯桥铱中间体[Ir(3-mppy)2Cl]2；
（5）铱(III)配合物的合成
称取二氯桥铱中间体与化合物4按照摩尔比为1:1-2，投入容器中，再加入乙二醇，氩气保护下加热回流10-15 h，得深红色澄清溶液；冷却至室温，加水稀释后，再加入饱和六氟磷酸铵溶液即产生大量红色沉淀；抽滤，用水、乙醚洗涤、干燥；将干燥后的粗产品用乙腈溶解，用中性氧化铝过柱分离；用二氯甲烷和乙腈混合溶剂淋洗下收集黄色组分，然后减压蒸馏旋干去除溶剂，得土黄色固体产物，即为肺癌细胞抑制剂，记作化合物5。
4.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）8-羟基喹啉与浓盐酸质体比为1:40-50。
5.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中白色沉淀去掉后的滤液用CH2Cl2萃取，合并有机相，蒸馏水洗涤，真空旋蒸出溶剂，得到黄色固体，过滤沉淀，固体用甲醇重结晶，即可得到6,7-二氯喹啉-5,8-二酮。
6.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中回流反应时间为10-60 min；固体采用邻二氯苯进行重结晶。
7.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中每摩尔化合物3加入5-15 L无水乙醇和3-5 L乙酸。
8.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中每摩尔水合三氯化铱加入15-18 L乙二醇乙醚和5-6 L水。
9.根据权利要求3所述的肺癌细胞抑制剂的制备方法，其特征在于：所述二氯甲烷与乙腈混合溶剂的体积比为2-3：1；所述步骤（5）中每摩尔二氯桥铱中间体加入100-150 L乙二醇。
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| 含N-H基团磷光铱配合物的设计、合成及其光物理性质研究;蒋瑞;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技I辑》;20170215(第2期);第B014-883页 * |
| 含苯基吡啶和吩嗪类配体的铱-稀土异金属配合物的合成及作为近红外发光DNA探针;黄晓燕等;《科学通报》;20140620;第59卷(第17期);第1674-1680页 * |
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Application publication date: 20201120 Assignee: Guangxi Dingyao chaohang Biomedical Technology Co.,Ltd. Assignor: Yulin Normal University Contract record no.: X2022450000593 Denomination of invention: A lung cancer cell inhibitor and its preparation method Granted publication date: 20220531 License type: Common License Record date: 20221230 |