CN107793455A

CN107793455A - 一种环铱(iii)金属配合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN107793455A
Application number: CN201710902346.4A
Authority: CN
Inventors: 孙静
Original assignee: Guangdong Medical University
Current assignee: Guangdong Medical University
Priority date: 2017-09-27
Filing date: 2017-09-27
Publication date: 2018-03-13
Anticipated expiration: 2037-09-27
Also published as: CN107793455B

Abstract

本发明提供了一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用，本发明提供的具有式(I)结构的环铱(III)金属配合物能够特异靶向线粒体，在光照和黑暗条件下的作用机理相近，都能通过能量依赖方式进入细胞，并定位于线粒体，引起线粒体膜电位的降低，诱导癌细胞的凋亡；同时也表现出不同：如黑暗条件下主要阻滞在G0/G1期，光照条件下细胞周期阻滞在G2/M期。同时配合物还对P21周期蛋白表达表现出不同的影响，光照条件下，随着配合物浓度的增加而增加，黑暗条件下则正好相反，即本发明所述的配合物在非光照条件下基本表现不出毒性，而在光照条件下毒性得到极大提高，是潜在的光动力抗肿瘤药物，具备良好的抗肿瘤活性。

Description

一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，尤其涉及一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用。

背景技术

光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)，是近几十年新兴的一种非常具有吸引力的非侵入式的癌症治疗方法，相对于放疗和化疗来说，具有较高的治疗效果和较少副作用。PDT的作用机理是使用特定波长的激光照射被肿瘤组织吸收的光敏剂(PS)，使之受到激发，而处于激发态的光敏剂把能量传递给周围的氧分子，从而生成活性很强的单线态氧(¹O₂)及一些活泼的自由基，这些产物与肿瘤细胞中的生物大分子发生作用，破坏细胞和细胞器的结构与功能，最终导致肿瘤细胞的坏死或凋亡，达到治疗肿瘤的目的。

线粒体，是细胞能量合成的主要场所，有细胞“发电厂”之称。它是细胞内信号转导的关键中枢，是癌症发生和发展的重要决定因素。有研究表明，线粒体不仅是细胞活动的能量站，也是内源性细胞凋亡途径的关键调节剂。例如，线粒体或核DNA的突变会影响线粒体呼吸链的功能，导致ATP生成不足、ROS产能过剩及对线粒体和其它大分子的氧化损伤(包括DNA，易于形成染色体不稳定性和癌变)。有研究表明，多个肿瘤标志物均和线粒体功能障碍有关，包括细胞的无限增殖，对生长信号不敏感，细胞凋亡损伤、代谢增强、自噬水平降低等。另外，线粒体也是诱导细胞凋亡至关重要的促凋亡蛋白的储藏室，如B细胞淋巴瘤蛋白2(Bcl-2)家族。作为调控细胞死亡的关键细胞器，设计线粒体靶向的抗肿瘤药物为癌症的治疗提供了一种有效途径。此外，越来越多的研究者致力于开发在治疗过程中能够监控线粒体状态变化的靶向型抗肿瘤试剂。

金属配合物作为理想的光敏剂，往往具有不同的细胞器靶向，而具有靶向线粒体靶向能力的配合物，与定位于溶酶体的配合物相比，是光动力治疗效果更好的治疗试剂，结合线粒体靶向和光动力治疗为癌症治疗提供了新的可行策略。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用。本发明提供的环铱(III)金属配合物能够特异靶向线粒体，且在非光照条件下基本表现不出毒性，而在光照条件下毒性得到极大提高，是潜在的光动力抗肿瘤药物。

本发明提供了一种环铱(III)金属配合物，具有式(I)所示结构，

其中，所述选自式(R-a)、式(R-b)、式(R-c)或式(R-d)，

所述X为卤素或卤化物。

优选的，所述X为F、Cl或PF₆。

优选的，所述配合物为式(I-a)、式(I-b)、式(I-c)或式(I-d)，

本发明还提供了一种环铱(III)金属配合物的制备方法，包括：

将含铱化合物与式(II)结构的配合物反应，并用卤化物的饱和盐溶液析晶，得到具有式(I)结构的环铱(III)金属配合物；

所述含铱化合物为桥连二(7，8-苯并喹啉)·一氯合铱(III)、桥连二(2-(对甲苯基)吡啶)·一氯合铱(III)、桥连二(2-苯基吡啶)·一氯合铱(III)或桥连二(2-(2-噻吩基)吡啶)·一氯合铱(III)；

优选的，所述反应的溶剂为二氯甲烷、甲醇和乙醇中的一种或几种。

优选的，所述卤化物为NH₄PF₆、NH₄F或NH₄Cl。

优选的，所述式(II)结构的化合物由1-(4-胺基苯基)咪唑[4，5-f][1，10]邻菲罗啉加入到甲醇和盐酸中得到的混合溶液与50％的氰胺混合反应得到。

本发明还提供了一种本发明所述的环铱(III)金属配合物在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。

优选的，所述肿瘤为实体瘤。

优选的，所述肿瘤为HepG2肿瘤细胞。

与现有技术相比，本发明提供了一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用。通过研究表明，本发明提供的具有式(I)结构的环铱(III)金属配合物能够特异靶向线粒体，在光照和黑暗条件下的作用机理相近，如都能通过能量依赖方式进入细胞，并定位于线粒体，引起线粒体膜电位的降低，诱导癌细胞的凋亡。同时也表现出不同：如黑暗条件下则主要阻滞在G0/G1期，光照条件下可以把细胞周期阻滞在G2/M期。同时配合物还对P21周期蛋白表达表现出不同的影响，如光照条件下，随着配合物浓度的增加而增加，黑暗条件下则正好相反，即本发明所述的配合物在非光照条件下基本表现不出毒性，而在光照条件下毒性得到极大提高，是潜在的光动力抗肿瘤药物，具备良好的抗肿瘤活性。此外，本发明提供的配合物的制备方法简单，收率高，易于实现工业化生产。

附图说明

图1是实施例2中配合物1对P21周期蛋白在光照和黑暗条件下的剂量依赖效应图；

图2是实施例2中配合物1对细胞色素C蛋白在光照和黑暗条件下的剂量依赖效应图。

具体实施方式

本发明提供了一种环铱(III)金属配合物，具有式(I)所示结构

其中，所述选自式(R-a)、式(R-b)、式(R-c)或式(R-d)，

所述X为卤素或卤化物。

其中，所述式(R-a)、式(R-b)、式(R-c)、式(R-d)基团中的表示与主链的连接部位。

按照本发明，所述X为F、Cl或PF₆；更具体的，所述配合物为式(I-a)、式(I-b)、式(I-c)或式(I-d)，

按照本发明，本发明将含铱化合物与式(II)结构的配合物反应，并用卤化物的饱和盐溶液析晶，得到具有式(I)结构的环铱(III)金属配合物；所述卤化物优选为NH₄PF₆、NH₄F或NH₄Cl；所述反应的溶剂优选为二氯甲烷、甲醇和乙醇中的一种或几种；更优选为二氯甲烷和甲醇的混合溶液；且所述二氯甲烷和甲醇的体积比优选为2∶1；所述反应的温度优选为40～90℃，更优选为50～80℃，最优选为60～70℃；所述反应的时间优选为3～6小时，更优选为4～5小时；具体反应流程如下：

所述式(II)结构的化合物由1-(4-胺基苯基)咪唑[4，5-f][1，10]邻菲罗啉加入到甲醇和盐酸中得到的混合溶液与50％的氰胺混合反应得到。具体的，本发明首先将1-(4-胺基苯基)咪唑[4，5-f][1，10]邻菲罗啉加入到甲醇和盐酸的混合溶液中，搅拌反应20～30min，然后在加入50％的氰胺混合反应，得到式(II) 结构的化合物；其中，所述甲醇和盐酸的混合溶液中，所述甲醇与盐酸的体积比为(6～10)∶1，更优选为(8～9)∶1；所述加入50％的氰胺混合反应优选为回流反应；反应的时间优选为20～25h；反应过程中，优选保持反应液的 pH值小于3。具体反应流程如下：

本发明还提供了一种本发明所述的环铱(III)金属配合物在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。其中，所述肿瘤优选为实体瘤，更优选为HepG2肿瘤细胞。

本发明提供了一种环铱(III)金属配合物及其制备方法和应用。通过研究表明，本发明提供的具有式(I)结构的环铱(III)金属配合物能够特异靶向线粒体，在光照和黑暗条件下的作用机理相近，如都能通过能量依赖方式进入细胞，并定位于线粒体，引起线粒体膜电位的降低，诱导癌细胞的凋亡。同时也表现出不同：如黑暗条件下则主要阻滞在G0/G1期，光照条件下可以把细胞周期阻滞在G2/M期。同时配合物还对P21周期蛋白表达表现出不同的影响，如光照条件下，随着配合物浓度的增加而增加，黑暗条件下则正好相反，即本发明所述的配合物在非光照条件下基本表现不出毒性，而在光照条件下毒性得到极大提高，是潜在的光动力抗肿瘤药物，具备良好的抗肿瘤活性。此外，本发明提供的配合物的制备方法简单，收率高，易于实现工业化生产。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

(1)制备配体：

将1-(4-胺基苯基)咪唑[4，5-f][1，10]邻菲罗啉(0.4g，1.3mmol)加入反应瓶中，然后加入甲醇(12mL)和盐酸(1.5mL)混合溶液，搅拌30min，加入4mL 50％的单氰胺，回流搅拌20h，保持反应液pH＜3(若pH值高于3，则通过滴加浓盐酸加以控制)，有黄色沉淀生成，过滤即得到具有式(II)结构的配体。

(2)制备配合物1(式(I-a)配合物)：

将具有式(II)结构的配体(0.25mmol，2equiv)和前体[Ir(bzq)2Cl]2(0.125mmol，1equiv)置于三口烧瓶中，加入45mL二氯甲烷/甲醇(2∶1，v/v)的混合溶剂，氩气保护下避光回流4h，反应结束后静置冷却至室温，加入6倍量的 NH₄PF₆搅拌2h，之后减压浓缩至2mL，然后将其滴加到20mL乙醚中，大量黄色沉淀生成，过滤，硅胶柱层析分离提纯，干燥即得式(I-a)配合物，产率为63.2％。

元素分析C₄₆H₃₃F₁₂N₉P₂Ir·0.5CH₃CH₂OCH₂CH³(分子量为1231.02)，理论值：C46.83％，H 3.11％，N 10.24％；实验值：C 47.10％，H 3.22％，N 10.19％。 ESI-MS：[(M-HPF6-PF6-)]⁺理论值：m/z＝902.02，实验值：m/z＝902.00； [(M-2PF6-)]²⁺理论值：m/z＝451.51，实验值：m/z＝451.30。

(3)制备配合物2(式(I-b)配合物)：

将具有式(II)结构的配体(0.25mmol，2equiv)和前体[Ir(tpy)₂Cl]₂(0.125 mmol，1equiv)置于三口烧瓶中，加入45mL二氯甲烷/甲醇(2∶1，v/v)的混合溶剂，氩气保护下避光回流4h，反应结束后静置冷却至室温，加入6倍量的 NH₄PF₆搅拌2h，之后减压浓缩至2mL，然后将其滴加到20mL乙醚中，大量黄色沉淀生成，过滤，硅胶柱层析分离提纯，干燥即得式(I-b)配合物，产率为71.1％。

元素分析C₄₄H₃₇F₁₂N₉P₂Ir·0.5CH₃CH₂OCH₂CH₃(分子量为1211.03)，理论值：C44.62％，H 3.50％，N 10.41％；实验值：C 44.83％，H 3.32％，N 10.53％。 ESI-MS：[(M-HPF₆-PF₆ ^-)]⁺理论值：m/z＝882.03，实验值：m/z＝882.20； [(M-2PF₆-)]²⁺理论值：m/z＝441.52，实验值：m/z＝441.70。

(4)制备配合物3(式(I-c)配合物)：

将具有式(II)结构的配体(0.25mmol，2equiv)和前体[Ir(ppy)₂Cl]₂(0.125 mmol，1equiv)置于三口烧瓶中，加入45mL二氯甲烷/甲醇(2∶1，v/v)的混合溶剂，氩气保护下避光回流4h，反应结束后静置冷却至室温，加入6倍量的 NH₄PF₆搅拌2h，之后减压浓缩至2mL，然后将其滴加到20mL乙醚中，大量黄色沉淀生成，过滤，硅胶柱层析分离提纯，干燥即得式(I-b)配合物，产率为73.5％。

元素分析C₄₂H₃₃F₁₂N₉P₂Ir·0.5CH₃CH₂OCH₂CH₃(分子量为1182.98)，理论值：C44.67％，H 3.24％，N 10.66％；实验值：C 44.13％，H 3.50％，N 10.82％。 ESI-MS：[(M-HPF₆-PF₆ ^-)]⁺理论值：m/z＝853.98，实验值：m/z＝854.15； [(M-2PF₆-)]²⁺理论值：m/z＝427.49，实验值：m/z＝427.65。

(5)制备配合物4(式(I-b)配合物)：

将具有式(II)结构的配体(0.25mmol，2equiv)和前体[Ir(thpy)₂Cl]₂(0.125mmol，1equiv)置于三口烧瓶中，加入45mL二氯甲烷/甲醇(2∶1，v/v)的混合溶剂，氩气保护下避光回流4h，反应结束后静置冷却至室温，加入6倍量的 NH₄PF₆搅拌2h，之后减压浓缩至2mL，然后将其滴加到20mL乙醚中，大量黄色沉淀生成，过滤，硅胶柱层析分离提纯，干燥即得式(I-b)配合物，产率为69.8％。

元素分析C₃₈H₂₈F₁₂N₉P₂S₂Ir·0.2CH₃CH₂OCH₂CH₃(分子量为1171.79)，理论值：C39.77％，H 2.58％，N 10.76％，S 5.47％；实验值：C 39.55％，H 2.65％， N 10.96％，S5.69％。ESI-MS：[(M-HPF₆-PF₆ ^-)]⁺理论值：m/z＝866.03，实验值：m/z＝866.10；[(M-2PF₆-)]²⁺理论值：m/z＝433.52，实验值：m/z＝433.75。

实施例2 Ir(III)配合物对光动力抗肿瘤活性试验

本发明的铱配合物具有光动力治疗癌症的能力是通过在完全相同的条件下，对比配合物对肿瘤细胞的暗毒性和光毒性(425nm，10min)得出的结论。该方法主要通过以下操作步骤：

暗毒性：当细胞生长至对数期时，将细胞用0.25％胰蛋白酶消化成单细胞悬液，对活细胞进行计数，于每孔4500个HepG2细胞160μL接种于96孔板中，在CO₂培养箱培养24h后，再分别加入40μL用培养基稀释的不同浓度的药物，然后在培养箱中孵育44h后，每孔加入20μL的MTT(用PBS溶解)， 4h后再吸掉培养基，每孔加入150μL的DMSO，于摇床上震荡10min左右，用酶标仪测定595nm处的OD值。按公式计算细胞存活率，同时作图求得半数致死浓度(IC₅₀)；

光毒性：细胞加入不同浓度的药物处理后在黑暗条件下孵育12h，用波长为425nm的LED光源(40mW·cm^-2)照射10min(36J·cm^-2)。在黑暗条件下继续孵育32h后加入MTT，后续处理同暗毒性。

存活率％＝加药孔平均OD值/对照孔平均OD值×100％

测试结果如下表所示：

^aIC₅₀为将肿瘤HepG2抑制50％时所对应的配合物的浓度。实验数据为三次平行实验后取得的平均值。

^bPI为光毒性指数，数值上等于黑暗条件下的IC₅₀比光照条件下的IC₅₀值。

由实验结果可以看出，对比暗毒性和光毒性的IC₅₀，可以明显看出配合物在光照条件下的细胞毒性得到很大提高。配合物1-4均具有不同程度的光动力抗肿瘤活性，值得注意的是配合物1在黑暗条件下的毒性甚至可以忽略，但光照条件下则得到极大提高。

Western Blot分析：将HepG2细胞培养于60mm的组织培养皿中，当细胞密度达到70％时，加入指定浓度的配合物1，在光照和黑暗条件下孵育24h 后收集蛋白样品，将准备好的蛋白样品100℃高温变性，然后SDS-PAGE凝胶电泳，分离所需蛋白，转膜，封闭，一抗孵育(一抗分别为β-actin，P21和 cytochrome c)，二抗孵育，蛋白检测。实验结果表明配合物1在不同条件下，对P21和cytochrome c两个蛋白表现出不同的影响；结果见图1～图2，图1是实施例2中配合物1对P21周期蛋白在光照和黑暗条件下的剂量依赖效应图；图2是实施例2中配合物1对细胞色素C蛋白在光照和黑暗条件下的剂量依赖效应图。从图1可以看，随着配合物1浓度的升高，21KDa条带在黑暗条件下逐渐增多，在光照条件下则正好相反。同样，从图2可以看出，配合物1在黑暗条件下对cytochrome c的释放影响较小，光照条件下则能明显增加其释放。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种环铱(III)金属配合物，具有式(I)所示结构，

其中，所述选自式(R-a)、式(R-b)、式(R-c)或式(R-d)，

所述X为卤素或卤化物。

2.根据权利要求1所述的配合物，其特征在于，所述X为F、Cl或PF₆。

3.根据权利要求1所述的配合物，其特征在于，所述配合物为式(I-a)、式(I-b)、式(I-c)或式(I-d)，

4.一种环铱(III)金属配合物的制备方法，包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述反应的溶剂为二氯甲烷、甲醇和乙醇中的一种或几种。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述卤化物为NH₄PF₆、NH₄F或NH₄Cl。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述式(II)结构的化合物由1-(4-胺基苯基)咪唑[4，5-f][1，10]邻菲罗啉加入到甲醇和盐酸中得到的混合溶液与50％的氰胺混合反应得到。

8.一种权利要求1～3任意一项所述的环铱(III)金属配合物在制备光动力抗肿瘤药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体瘤。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为HepG2肿瘤细胞。