CN111956643A - 维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，维替泊芬通过降低脂肪组织含量进而缓解肥胖症；通过本发明研究发现，维替泊芬具有减肥功效，直接作用于肥胖的脂肪细胞，能迅速通过诱导肥胖脂肪细胞凋亡快速减少脂肪细胞数量，而对脂肪组织中其他细胞无副作用，从而安全有效地抑制并降低脂肪组织含量，为临床治疗病理性肥胖症提供实验基础。

Description

维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用。

背景技术

维替泊芬(Verteporfin，VP)，2000年4月13日作为一种光敏剂由美国FDA批准上市，主要用于光动力学疗法治疗湿型老年性黄斑退化，适用于继发于年龄相关性黄斑变性，病理性近视或可疑眼组织胞浆菌病的，以典型性为主型中心凹下脉络膜新生血管形成的患者。

肥胖症是指体内脂肪细胞体积和数量异常增加，造成体脂占体重的百分比异常增高，导致脂肪过多沉积。肥胖及其衍生的糖脂代谢紊乱、Ⅱ型糖尿病等已成为我国面临的巨大健康问题，增加心血管疾病以及癌症发病风险，损害消化系统、内分泌系统的功能等。世界卫生组织表示，肥胖已经成为了一种流行病，全球每年至少有280万人因超重或肥胖而死亡。但目前从分子机理层面对肥胖发病过程中脂肪细胞的调控尚不完全清楚。

目前有多种控制肥胖的方法，第一种是通过化学成分来达到减肥的目的，例如口服减肥药，贴减肥贴等，这些方法优点是快速直接的控制体重，缺点是易反弹，对身体有副作用。第二种方法是通过体育锻炼减肥，例如跑步，游泳，爬山，仰卧起坐，俯卧撑等。这些方法都是比较科学合理健康的，但是作用间接，持续时间较长。第三种方法是通过控制饮食减肥，少吃脂肪以及糖量高的食物，同样健康有效但见效慢。第四种是通过物理方法例如抽脂、针灸以及减重手术，风险较大，易对身体造成危害。上述方法存在的主要问题包括作用的分子机制，细胞类型及细胞靶点不明确，大多数未能直接对肥胖脂肪组织中最关键的脂肪细胞本身的体积或数量发挥作用。

发明内容

本发明的目的是提供维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，以达到治愈肥胖症的效果。

本发明采用以下技术方案：维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用。

进一步地，维替泊芬通过降低脂肪组织含量进而缓解肥胖症。

进一步地，维替泊芬通过降低脂肪细胞的数量并增加脂肪组织炎症进而缓解肥胖症。

进一步地，维替泊芬通过促进脂肪细胞发生炎症及凋亡以达到降低脂肪数量的作用。

进一步地，维替泊芬通过抑制脂肪细胞中YAP/TAZ基因的入核与激活，促进脂肪凋亡或发生炎症。

本发明的有益效果是：通过本发明研究发现，维替泊芬具有减肥功效，直接作用于肥胖的脂肪细胞，能迅速通过诱导肥胖脂肪细胞凋亡，快速减少脂肪细胞数量，且对脂肪组织中其他细胞无副作用，从而安全有效地抑制并降低脂肪组织含量，为临床治疗病理性肥胖症提供实验基础。

附图说明

图1为本发明中对照组和实验组小鼠在高脂喂养及药物注射过程中每周的体重变化结果，VP代表实验组；

图2为本发明中对照组和实验组小鼠脂肪组织重量(图2A)及大小(图2B)；

图3为本发明中对照组和实验组小鼠脂肪组织Cell Mask细胞膜及DAPI细胞核染色结果；

图4为本发明中对照组和实验组小鼠脂肪组织TUNEL细胞凋亡染色(图4A)及凋亡率统计结果(图4B)；

图5为本发明中对照组和实验组小鼠脂肪组织HE染色结果(图5A)，脂肪细胞数目统计(图5B)及CLS数目统计(图5C)；

图6为本发明中对照组和实验组小鼠脂肪组织YAP/TAZ染色结果(图6A)，核内和胞质内YAP/TAZ统计结果(图6B)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

本发明公开了维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，维替泊芬是通过降低脂肪组织含量进而缓解肥胖症，进一步，维替泊芬通过降低脂肪细胞的数量并增加脂肪组织炎症进而缓解肥胖症。进一步，维替泊芬通过促进脂肪细胞发生炎症及凋亡以达到降低脂肪数量的作用。进一步，维替泊芬通过抑制脂肪细胞中转录因子YAP/TAZ的入核与激活，来促进脂肪凋亡或发生炎症。对于上述应用进行以下验证实验。

术语解释

实验动物：

实验小鼠由某大学实验动物中心提供，所有小鼠均为C57BL/6J背景，8周龄，平均体重18-20g。小鼠在光/暗周期为12小时的条件下饲养于某大学动物实验中心，SPF级，可自由进食和饮水，垫料每周换1次并增补饲料和饮用水，无病原体。

主要材料和试剂：

小鼠高脂饲料购买于江苏美迪森生物医药公司，维替泊芬购买于MCE公司，TUNEL染色试剂盒购买于碧云天生物技术公司，苏木精染液、伊红染液购买于北京鼎国生物有限公司；多聚甲醛、二甲苯、无水乙醇购买于天津化学试剂厂。

主要试剂配置方法：

梯度乙醇溶液：在无水乙醇中加入不同比例的ddH₂O混匀，配置成70％、80％、90％和95％的梯度乙醇溶液。

1×PBS(1L)：称取氯化钠8g，氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.24g，磷酸氢二钠1.438g，用ddH20定容至1L，高压灭菌后使用。

渗透溶液：将100μl Triton X-100和0.1g柠檬酸钠溶于100ml 1×PBS中，现配现用。

封闭溶液：将100μl Triton X-100和1g BSA溶于20ml 1×PBS中，现配现用。

实验方法与步骤

一、高脂肥胖小鼠模型的建立

将实验小鼠随机分成2组，包括维替泊芬实验组和DMSO对照组，每组5只小鼠，8周龄，平均体重18-20g。小鼠自由饮水，开始饲喂高脂饲料，环境温度控制在21～25℃，正常光照，每周测1次小鼠体重变化。

两组小鼠持续饲喂4周高脂饲料后，开始腹腔脂肪注射给药，实验组按照小鼠体重注射(1.15μg/g)维替泊芬，对照组注射等量的DMSO，每周注射两次(周一和周四)，共计4周，给药期间持续给小鼠饲喂高脂饲料以及测量每周体重变化。

结果：两组小鼠每周的体重变化结果见图1，X轴为喂养高脂饲料的周数，Y轴为小鼠体重变化百分比，可以看出实验组小鼠注射维替泊芬前后，体重变化百分比为初始体重的110.48％±13.43％；而对照组小鼠注射DMSO前后，体重变化百分比增加为134.36％±2.36％，两组数据的t检验结果p值小于0.01，说明实验组小鼠体重相比对照组显著下降。这说明维替泊芬能够抑制肥胖小鼠的体重增加，具有显著的减肥作用。

二、脂肪组织取材

1、取脂肪组织

模型建立成功后，利用CO₂吸入法处死小鼠，将其四肢固定在泡沫板上，沿小鼠腹部正中央剪开皮肤，暴露出腹腔，分离小鼠内脏和皮下脂肪组织，称重并拍照后放入装有10ml4％多聚甲醛的EP管中，固定过夜。

结果：两组小鼠的脂肪组织重量及大小变化见图2。如图2A柱状图及表1所示，对照组小鼠皮下脂肪组织的重量与体重的比值为5.23±0.49％，实验组为2.77±0.19％，两组数据的t检验结果p值小于0.05；同样的，对照组小鼠脂肪组织的重量与体重的比值为6.87±0.99％，实验组为3.14±0.36％，两组数据的t检验结果p值小于0.0001。以上结果说明实验组相比对照组脂肪组织重量极显著下降；图2B的脂肪组织图像直观地显示，实验组小鼠注射维替泊芬后，脂肪组织体积至少减少为对照组的二分之一。总之，图2进一步说明，维替泊芬能够降低肥胖小鼠脂肪组织的含量。

表1.两组小鼠脂肪组织的重量/体重(％)

三、TUNEL细胞凋亡、细胞膜及细胞核染色

TUNEL细胞凋亡检测原理：细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TerminalDeoxynucleotidyl Transferase，TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP(fluorescein-dUTP)，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法检测细胞凋亡的原理。

Cell Mask细胞膜染色：Cell Mask存在于脂肪细胞表面，其数量反映了脂肪细胞的数目，用于质膜染色，允许快速和均匀地标记质膜，而不存在凝集素显示的细胞类型差异，可用于标准荧光显微镜下的细胞质膜染色。免疫荧光染色中，Cell Mask的荧光显示脂肪细胞的形态，用于反映细胞数目。

DAPI细胞核染色：4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

实验步骤如下：

1、石蜡包埋

将脂肪组织固定好以后，进行脱水、透明、浸蜡等步骤，再用莱卡石蜡包埋机将组织包埋于蜡块中。具体步骤如下：

(1)脱水：将固定好的组织按顺序经70％、80％、90％和95％梯度的乙醇溶液进行脱水，每个梯度各浸泡2h，最后将组织放入100％乙醇溶液中过夜。

(2)透明：将组织放入二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各浸泡2h。

(3)浸蜡：将组织样放入石蜡Ⅰ和石蜡Ⅱ液体中各浸泡2h。

2、切片

脂肪组织蜡块包埋好以后，用Thermo旋转切片机进行切片，切片厚度为5μm。组织切片经过展片、捞片和烤片三个过程进行。具体步骤如下：

(1)展片和捞片：将切好的切片放于45℃恒温水浴锅中进行展片，展好后用载玻片小心地捞出，做好标记；

(2)烤片：将切片放于37℃烤片机中过夜。

3、染色

(1)脱蜡：将切片架依次放入二甲苯Ⅰ和Ⅱ中，各浸泡5min，再依次放入100％乙醇溶液Ⅰ和Ⅱ，以及90％、80％和70％梯度的乙醇溶液中，各浸泡1min，进行脱蜡。

(2)水化：将切片架依次放入ddH₂O Ⅰ和Ⅱ中，各浸泡1min。

(3)渗透：将切片架放入渗透溶液中，孵育8分钟。

(4)TUNEL染色：将切片放入黑色暗盒中，滴染TUNEL反应混合物，放入37℃培养箱，避光孵育60分钟。

(5)洗涤：用1 X PBS溶液冲洗玻片3次，每次5min。

(6)DAPI&Cell Mask染色：用1 X PBS稀释DAPI(1：10)和Cell Mask(1:200)，滴染玻片，避光室温孵育1h。

(7)洗涤：用1 X PBS溶液冲洗玻片3次，每次5min。

(8)封片：在载玻片上滴加荧光抗淬灭封片剂，用盖玻片盖好进行封片。

4、镜下观察及拍照：利用莱卡荧光共聚焦显微镜进行拍照，结果见图3，其中DAPI对细胞核进行显色，Cell Mask对细胞膜进行显色。可见实验组的脂肪细胞数量相比对照组显著减少，但细胞核数量增加，说明注射维替泊芬后，实验组小鼠脂肪细胞的数目显著减少，凋亡的细胞及炎症细胞的数目显著增加。

5、为了探究脂肪细胞减少的原因，本发明运用TUNEL细胞凋亡染色法检测脂肪细胞凋亡情况，其中，图4A中TUNEL对凋亡细胞显色，Cell Mask对细胞膜进行显色，结果显示，实验组中TUNEL荧光区域相比对照组显著增加，说明脂肪细胞的凋亡程度增加。接下来我们对两组结果的凋亡率进行统计，可见图4B中，实验组凋亡率(9.23％±0.84％)显著高于对照组(3.24％±0.35％)，说明维替泊芬能促进脂肪细胞凋亡。进一步证明维替泊芬具有促进脂肪细胞凋亡的作用。

四、H&E染色

苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称H&E染色法，石蜡切片技术里常用的染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。H&E染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法。

将烘干后的切片放入切片架中，经过脱蜡、苏木素染色、伊红染色、脱水和封片步骤，具体操作如下：

(1)脱蜡：将切片架依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中，各浸泡7min，再依次放入100％乙醇溶液Ⅰ和Ⅱ，以及90％、80％和70％梯度的乙醇溶液中，各浸泡1min，进行脱蜡。

(2)苏木素染色：放入苏木素溶液中，染色7min，再用流水冲洗10min.

(3)伊红染色：放入伊红溶液中，染色1min，再用流水冲洗1min。

(4)脱水：依次放入70％、80％和90％梯度的乙醇溶液中各1min，100％乙醇溶液Ⅰ和Ⅱ中各1min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ中各3min.

(5)封片：用中性树胶封片。

拍照及数据统计

脂肪组织冠状结构(Crown-like structures,CLS):CLS是肥胖脂肪组织中炎症发生的标志，属于巨噬细胞，主要来源于死亡或垂死的脂肪细胞周围血液中的单核细胞。CLS中的巨噬细胞能够通过释放促炎因子和游离脂肪酸，而引起高胰岛素血症和胰岛素抵抗。在脂肪细胞凋亡过程中，脂肪组织间隙会出现大量CLS，各区域CLS细胞的个数反映了脂肪细胞凋亡的程度。

利用上述常规方法进行石蜡包埋、切片和H&E染色后，显微镜下拍照，染色结果见图5A，直接观察到实验组脂肪细胞减少；进一步统计每mm²面积脂肪细胞数目，发现实验组脂肪细胞数量平均值为150.14个，对照组平均值为398.76个，t检验结果p值小于0.0001，表明实验组脂肪细胞数量相比对照组显著减少(统计结果见图5B)；接下来进一步统计视野中每mm²面积脂肪组织冠状结构的数量并作图(统计结果见图5C)，可见实验组冠状结构数量平均值(31.96个)显著高于对照组(0.55个)，且对照组的冠状结构数量几乎为零，这说明实验组小鼠发生凋亡与炎症的脂肪细胞数量显著高于对照，证明维替泊芬在促进脂肪细胞凋亡与炎症发生的过程中具有显著作用。

五、YAP/TAZ免疫荧光染色

为了探究维替泊芬促进脂肪细胞凋亡和炎症发生的机制，本发明进一步研究维替泊芬是否通过抑制脂肪细胞中YAP/TAZ的入核与激活而发挥作用。具体实验步骤如下：

1、按照实验二步骤所示取脂肪组织固定后，置于24孔板中；

2、洗涤：用1XPBS溶液洗涤3次，每次5min；

3、封闭：将切片架放入封闭溶液中，室温孵育1小时；

4、一抗：将组织剪碎，置于96孔板中，每孔滴入50ul YAP/TAZ一抗(1:100，用封闭液稀释)，4℃过夜孵育；

5、复温：将组织室温放置3h，重新置于24孔板中；

6、洗涤：用1XPBS溶液洗涤3次，每次5min；

7、二抗：组织置于96孔板中，用封闭液稀释DAPI(1：10)、Cell Mask(1:200)和YAP/TAZ对应的二抗—Alexa

488连接的山羊抗兔(1:100)，每孔滴加50ul，避光室温孵育3h；

8、洗涤：用1X PBS溶液洗涤3次，每次5min；

9、封片：在载玻片上滴加荧光抗淬灭封片剂，用盖玻片盖好组织进行封片。

结果：如图6A所示，其中左边第一列荧光对YAP/TAZ基因进行显色，第二列荧光DAPI对细胞核进行显色，第三列荧光Cell Mask对细胞膜进行显色，，第四列“Merge”为三种荧光的合成图；可见对照组大部分脂肪细胞中YAP/TAZ与核发生共定位，表明高脂饮食促进了脂肪细胞中YAP/TAZ的激活；而实验组脂肪细胞中YAP/TAZ主要位于胞质，说明维替泊芬抑制了高脂饮食引起的YAP/TAZ的入核及激活。进一步统计YAP/TAZ在核内及胞质内的共定位百分比(图6B及表2)，可见对照组YAP/TAZ在核内的百分比为54.65±5.38％，在胞质的百分比为24.1±3.78％；实验组YAP/TAZ在核内的百分比为24.8±4.55％，在胞质的百分比为54.35±6.87％；对两组数据进行t检验，p值小于0.01，说明实验组和对照组具有显著差异。图6说明对照组中高脂饮食促进了脂肪细胞中YAP/TAZ的激活，因此核内百分比较高；而实验组中由于注射YAP/TAZ的抑制剂维替泊芬，抑制高脂饮食引起的YAP/TAZ的入核及激活，所以胞质百分比较高。因此，维替泊芬通过抑制脂肪细胞中YAP/TAZ的入核及激活，促进脂肪细胞凋亡。

表2.两组小鼠脂肪组织染色的YAP/TAZ共定位百分比(％)

本发明公开了维替泊芬对肥胖小鼠的脂肪生物学功能，发现维替泊芬能够逆转肥胖小鼠的脂肪沉积，具有减肥的作用；进一步发现维替泊芬能够促进肥胖脂肪细胞凋亡；进一步发现维替泊芬能够促进肥胖脂肪组织炎症发生；进一步发现维替泊芬能够降低脂肪细胞数目及减少脂肪组织含量。本发明首次将维替泊芬-YAP/TAZ-脂肪细胞三者连接，发现了维替泊芬抑制YAP/TAZ基因的入核与激活，促进脂肪细胞凋亡的作用。

作为一种光敏剂，维替泊芬被FDA批准用于光动力学疗法治疗湿型老年性黄斑退化，其应用局限于通过激光损伤血管改善视力，而通过本发明发现，维替泊芬对脂肪细胞以及脂肪组织的生物学功能有一定的影响，能促进肥胖脂肪细胞凋亡及炎症发生，抑制脂肪沉积，减轻小鼠脂肪重量及体重；可能作为从脂肪细胞凋亡的角度干预肥胖、糖尿病等疾病的新药物，为临床治疗肥胖症提供新的策略。

Claims (5)

1.维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用。

2.根据权利要求1所述的维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，其特征在于，维替泊芬通过降低脂肪组织含量进而缓解肥胖症。

3.根据权利要求2所述的维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，其特征在于，维替泊芬通过降低脂肪细胞的数量并增加脂肪组织炎症进而缓解肥胖症。

4.根据权利要求3所述的维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，其特征在于，维替泊芬通过促进脂肪细胞发生炎症及凋亡以达到降低脂肪数量的作用。

5.根据权利要求4所述的维替泊芬用于制备肥胖症药物的应用，其特征在于，维替泊芬通过抑制脂肪细胞中转录因子YAP/TAZ的入核与激活，促进脂肪凋亡或发生炎症。

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