CN110302278A - 一种地黄外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种地黄外泌体的制备方法，包括以下步骤：制备鲜地黄汁：取鲜地黄，洗净，分切成块，利用榨汁机榨汁，获得鲜地黄汁，冷冻保存，备用；制备地黄外泌体：将鲜地黄汁解冻，以300Xg离心10min，获得上清液A；然后将上清液A以2000Xg离心10min，获得上清液B；再将上清液B以10000Xg离心30min，获得上清液C，最后将上清液C在100000Xg离心力下，离心80min，获得沉淀D，以PBS混悬沉淀D即得到外泌体总提物，进一步分离可得到精制的地黄外泌体。本发明制得的地黄外泌体能够用于治疗2型糖尿病。

Description

一种地黄外泌体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及糖尿病治疗技术领域，尤其涉及一种地黄外泌体及其制备方法和应用。

背景技术

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，较难根治，目前临床治疗糖尿病的方式有两种：1、口服药物治疗；2、注射胰岛素治疗；这两种治疗方式都会对患者的身体造成不良影响，糖尿病经诊断后分为1型糖尿病和2型糖尿病，2型糖尿病常见于中老年人，肥胖者发病率高，常可伴有高血压、血脂异常、动脉硬化等疾病，治疗难度大。

外泌体是细胞经过“内吞－融合－外排”等一系列调控过程形成并可分泌的分子直径为40-100nm的亚细胞双层膜囊泡。外泌体在透射电子显微镜下呈扁平状或球状，在蔗糖溶液中的密度为1.13～1.19g/mL，其密度与细胞来源相关，并随蛋白含量而改变。外泌体内不含有DNA片段，但含有与其来源细胞相类似的细胞因子、生长因子等蛋白质，以及脂质、编码或非编码RNA等生物活性物质，在调控细胞生理功能方面具有重要作用。

地黄(拉丁学名：Rehmannia glutinosa(Gaetn.)Libosch.ex Fisch.et Mey.)，玄参科地黄属多年生草本植物，性凉，味甘苦，具有滋阴补肾、养血补血、凉血的功效。凡阴虚血虚肾虚者食之，颇有益处。此外，地黄有强心利尿、解热消炎、促进血液凝固和降低血糖的作用。传统用药经验中常用鲜地黄榨汁服用，具有清热滋阴等功效，对消渴(糖尿病)等具有较好疗效，而外泌体是地黄汁中重要的生命活性物质，具有跨界调节作用，由此推断，提取地黄的外泌体能够为糖尿病的治疗提供新的研究方向。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种地黄外泌体及其制备方法，本发明制得的地黄外泌体能够用于治疗2型糖尿病。

本发明提供一种地黄外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备鲜地黄汁：取鲜地黄，洗净，分切成块，利用榨汁机榨汁，获得鲜地黄汁，冷冻保存，备用；

步骤S2，制备地黄外泌体：将鲜地黄汁解冻，以300Xg离心10min，获得上清液A；然后将上清液A以2000Xg离心10min，获得上清液B；再将上清液B以10000Xg离心30min，获得上清液C；最后将上清液C在100000Xg离心力下，离心80min，获得沉淀D，以PBS混悬沉淀D即得到外泌体总提物，进一步采用PEG离心沉淀法分离，得到精制的地黄外泌体。

进一步地，步骤S1中，鲜地黄汁的冷冻保存温度为-20℃。

进一步地，PEG离心沉淀法的具体过程为：将分子量为2000～6000的PEG(聚乙二醇)配制成50％的溶液，然后将外泌体总提物加入PEG溶液中，搅拌静置24h，然后离心，获得的沉淀物即为地黄外泌体。

本发明还提供一种地黄外泌体，所述地黄外泌体由上述制备方法制得。

本发明还提供一种地黄外泌体的应用，所述地黄外泌体能够用于治疗2型糖尿病。

进一步地，所述地黄外泌体用于治疗2型糖尿病时能够被制备成以下剂型：颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液体制剂、注射剂、经皮给药制剂等。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：本发明提供的制备方法过程简单；本发明制得的地黄外泌体其中包含各种microRNA，这些microRNA能够用于治疗2型糖尿病；经大鼠实验表明：利用本发明制得的地黄外泌体能够有效改善T2DM大鼠体重下降现象，降低T2DM大鼠的空腹血糖，提高T2DM大鼠糖耐量，提高T2DM大鼠的胰岛素敏感指数；本发明制得的地黄外泌体能够用于T2DM的治疗，且不会引起不良反应。

附图说明

图1是本发明实施例1制得的地黄外泌体的电镜图。

图2是对大鼠的造模实验周期图。

图3是大鼠肝组织HE染色(X400)图。

图4是大鼠胰腺组织HE染色(X400)图。

图5是大鼠肝组织油红O染色(X100)图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地描述。

实施例1：

本发明的实施例1提供了一种用于治疗2型糖尿病(T2DM)的地黄外泌体的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，制备鲜地黄汁：取鲜地黄适量，去除坏死部分，洗净，用抹布擦干，分切成块，用榨汁机榨汁(1kg鲜地黄出汁约400mL)，再将鲜地黄汁分装于冰箱内速冻，-20℃保存，备用；

步骤S2，制备地黄外泌体：将鲜地黄汁从冰箱中取出，解冻，以300Xg离心10min，获得上清液A和沉淀A；然后将上清液A以2000Xg离心10min，获得上清液B和沉淀B；再将上清液B以10000Xg离心30min，获得上清液C和沉淀C，最后将上清液C在100000Xg离心力下，离心80min，获得上清液D和沉淀D，以PBS(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)混悬沉淀D即得到外泌体总提物，进一步采用PEG离心沉淀法分离可得到精制的地黄外泌体。

PEG离心沉淀法的具体过程为：将分子量为2000～6000的PEG(聚乙二醇)配制成50％的溶液，然后将外泌体总提物加入PEG溶液中，搅拌静置24h，然后离心，获得的沉淀物即为地黄外泌体。

步骤S2中，上清液A-D、沉淀A-D为不同步骤收集的上清液和沉淀，字母本身没有含义。

得到的地黄外泌体可以制备成以下剂型：颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液体制剂、注射剂、经皮给药制剂等。

制备得到的地黄外泌体的电镜图见图1。

对实施例1制得的地黄外泌体进行性能鉴定试验的过程如下：

(1)糖尿病大鼠模型的建立：

实验进行前68只雄性SD大鼠均适应性饲养3d，然后从中随机抽取12只作为正常对照组，其余作为造模动物。正常对照组大鼠以普通饲料喂养，糖尿病造模组大鼠给予高糖高脂饲料(高糖高脂饲料的组分为：猪油10％、胆固醇2％、蛋黄粉5％、丙基硫氧嘧啶0.2％、蔗糖10％、基础饲料72.8％)喂养4周后，按照链脲佐菌素(STZ)40mg·kg^-1的剂量腹腔注射1次，正常对照组腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。72h后尾静脉取血，检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)，期间大鼠自由饮水，空腹血糖需连续测定3d，血糖稳定后，将血糖值在11.1mmol·L^-1～30.0mmol·L^-1之间的大鼠作为造模成功大鼠，共成模60只，未成模的大鼠有8只，该造模方法的成功率为88.2％。实验周期图如图2所示。

(2)动物分组及给药：

将造模成功的大鼠随机分为：模型组、二甲双胍组(0.15g/(kg体重·d))、鲜地黄汁组(42.8g生药量/(kg体重·d))、地黄外泌体组(61.2g生药量/(kg体重·d))，每组12只，灌胃给药，1日2次，正常对照组和模型组分别灌胃纯净水，连续给药8周。模型组和各给药组给予高糖高脂饲料，正常对照组给予普通饲料喂养，各组动物均自由进食、饮水。

(3)标本制备：

(3.1)血液样本的制备：

给药8周后，各组大鼠禁食不禁水12h，称重，记录体重。腹腔注射20％乌拉坦(1.2mg·kg^-1)麻醉后腹主动脉取血，3000r·min^-1离心15min，分离血清，分装(避免反复冻融)，-80℃冰箱保存，用于后续的指标检测。

(3.2)组织样本的制备：

将取血后的大鼠置于冰上，解剖后取其胰腺、肝脏、脾脏和肾脏组织。剪取肝脏相同部位的0.5cmX0.5cm肝组织，生理盐水冲洗干净，浸泡于做好标记的4％多聚甲醛溶液中固定待检；胰腺组织的固定方法同肝脏组织；剩下的肝组织和胰腺组织用生理盐水冲洗后，滤纸吸干表面水分，分装入冻存管，保存于-80℃冰箱中。

(4)检测指标：

(4.1)称取实验过程中各组大鼠的体重并记录。

各组大鼠体重变化情况如表1所示：

表1：大鼠体重变化情况

注：表1中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

如表1所示，实验初(-5周)时，各组大鼠体重无显著性差异。随饲养时间的增加，正常对照组大鼠体重持续上升，经过4周高糖高脂饲料的诱导后(-1周)，各组大鼠体重均有一定的增加。注射链脲佐菌素，2型糖尿病模型大鼠建立成功(0周)后，2型糖尿病模型大鼠体重均急剧下降(P<0.01)，与2型糖尿病患者临床“三多一少”中的“一少”症状相符合。成模后及药物干预期间，各组大鼠体重均为先下降后上升的趋势，与模型组比较，鲜地黄汁和地黄外泌体对T2DM大鼠体重下降有显著改善(P<0.01)。

(4.2)各组大鼠空腹血糖(FBG)变化情况。

模型建立后，每周的同一时间段测定空腹血糖(FBG)，检测FBG时，禁食不禁水12h，尾静脉取血以血糖仪及配套试纸检测空腹血糖并记录。计算血糖下降率＝(模型组第8周血糖-各给药组第8周血糖)/模型组第8周血糖X100％

各组大鼠空腹血糖检测结果及血糖下降率如表2所示：

表2：各组大鼠空腹血糖检测结果

注：表2中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表2可知，2型糖尿病大鼠模型复制成功时(0周)，与正常对照组比较，模型组大鼠血糖显著升高(P<0.05)，但其余各组组间无显著性差异，表明造模成功。

在复制2型糖尿病(T2DM)大鼠模型后，一直到第8周实验结束，模型组大鼠血糖一直处于较高血糖的状态。给药8周后，二甲双胍组大鼠与模型组比较，血糖显著降低(P<0.01)，鲜地黄汁组、地黄外泌体组与模型组比较有显著差异(P<0.01)。

(4.3)口服葡萄糖耐量试验(OGTT)

给药至第7周时，各组大鼠禁食不禁水12h后，尾静脉取血，测定空腹血糖作为0min时血糖值，然后按2.0g·kg^-1灌胃浓度为50％的葡萄糖溶液，分别测定灌胃葡萄糖后30min、60min、90min和120min的血糖。绘制OGTT曲线。采用近似梯形方法计算糖耐量试验血糖值的曲线下面积(Area Under Curve，AUC),曲线下面积的计算公式为：

AUC(mmol·h·L^-1)＝0.5X(FBG 0min+FBG 30min)/2+0.5X(FBG 30min+FBG60min)/2+0.5X(FBG 60min+FBG 90min)/2+0.5X(FBG 90min+FBG 120min)/2。

大鼠葡萄糖耐量试验结果如表3所示：

表3：大鼠葡萄糖耐量试验结果

注：表3中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

在葡萄糖耐量实验(OGTT)过程中，各组大鼠口服相同剂量的葡萄糖后，检测到其血糖值均先升高，达到峰值后开始逐步下降，体现了葡萄糖在体内吸收代谢的过程。如表3所示，正常对照组血糖值在30min即达到峰值，随后开始下降。与正常对照组比较，模型组大鼠的血糖值在0min、30min、60min、90min和120min均显著增加(P<0.01)，且葡萄糖耐量曲线下面积(AUC)显著增加，差异具有统计学意义(P<0.01)。

与模型组比较，鲜地黄汁组、地黄外泌体组的AUC均显著降低(P<0.01)，二甲双胍组与模型组比较无显著性差异。

(4.4)血脂生化指标的测定

采用全自动生化分析仪检测血清中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)含量。

TG、TC、LDL-C和HDL-C检测结果如表4所示：

表4：大鼠TG、TC、LDL-C和HDL-C检测结果

注：表4中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

由表4可知，与正常对照组比较，模型组大鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇均显著升高(P<0.01)。

与模型组比较，二甲双胍组、鲜地黄汁组和地黄外泌体组大鼠血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇均显著降低(P<0.01)，二甲双胍组和地黄外泌体组大鼠的高密度脂蛋白胆固醇显著降低(P<0.01)，鲜地黄汁组、地黄外泌体组大鼠高密度脂蛋白胆固醇显著升高(P<0.01)。

(4.5)空腹血清胰岛素(FINS)

大鼠胰岛素(INS)酶联免疫检测试剂盒检测空腹血清胰岛素，并计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)和胰岛素敏感指数(ISI)：HOMA-IR＝FBGXFINS/22.5；ISI＝Ln[1/(FBGXFINS)]。

FINS检测结果及HOMA-IR和ISI计算结果如表5所示：

表5：FINS检测结果及HOMA-IR和ISI计算结果

注：表5中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

从表5中可以看出，与正常对照组比较，模型组大鼠的空腹血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数显著升高，胰岛素敏感指数显著降低(P<0.01)。

与模型组比较，二甲双胍组、鲜地黄汁组和地黄外泌体组大鼠的空腹血清胰岛素水平、胰岛素抵抗指数均显著降低(P<0.05或P<0.01)，胰岛素敏感指数有所升高，但无显著性差异。

(4.6)称取各组大鼠的肝脏、肾脏、脾脏的重量(g)，计算脏器系数。脏器系数＝(脏器重量/大鼠体重)X100％。

大鼠肝脏、肾脏、脾脏脏器指数的计算结果如表6所示：

表6：大鼠肝脏、肾脏、脾脏脏器指数

注：表6中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

如表6所示，与正常对照组比较，模型组大鼠的肝脏、脾脏和肾脏指数均上升(P<0.05或P<0.01)，说明2型糖尿病对组织器官会造成一定程度的损伤。

与模型组大鼠比较，给药后，二甲双胍组、鲜地黄汁组和地黄外泌体组大鼠肝脏指数降低，具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，说明对大鼠的肝脏具有一定的修复和保护作用。但各给药组大鼠的脾脏指数和肾脏指数无明显降低，即对脾脏和肾脏的肿胀无明显改善。

(4.7)按照试剂盒说明书测定血清中SOD和MDA含量。

大鼠血清中SOD和MDA含量如表7所示：

表7：大鼠血清中SOD和MDA含量

注：表7中，与正常对照组比较，^△P<0.05，^△△P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；

从表7中可以看出，与正常对照组比较，模型组大鼠血清中SOD活性明显降低，MDA含量显著增加(P<0.01)。

与模型组比较，给药8周后，二甲双胍组、鲜地黄汁组和地黄外泌体组大鼠血清SOD活性显著升高，MDA含量显著降低(P<0.05或P<0.01)。

(4.8)组织病理学

(4.8.1)肝组织和胰腺组织HE染色

将用4％多聚甲醛固定后的肝脏组织和胰腺组织样本取出，用流水冲洗30min，然后梯度乙醇脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。将包埋好的组织蜡块置于切片机上，切成厚度约为5～8μm的薄片。薄片经二甲苯脱蜡，苏木精染液染色，酸水及氨水中分色，流水冲洗，乙醇脱水，伊红染色液染色。染色后的切片经无水乙醇进行脱水，再经二甲苯使切片透明，最后中性树胶封片，光镜下观察并拍照。

光镜下观察肝脏组织切片HE染色结果如图3所示，可见正常对照组(见图3a)大鼠的肝组织肝小叶结构正常，肝细胞形态大小均匀一致，肝细胞分界清晰，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状整齐排列，未见脂肪变性及炎性细胞浸润。模型组(见图3b)大鼠肝细胞肿胀，体积增大，出现严重的气球样变，大部分细胞内出现空泡样变，大量细胞出现水肿坏死，组织结构紊乱。

二甲双胍组(见图3c)大鼠肝细胞排列轻度紊乱，组织中有轻度气球样变，少数细胞出现空泡样变，部分细胞出现水肿坏死，组织结构轻度紊乱。

鲜地黄汁组(见图3d)大鼠肝细胞排列轻度紊乱，组织中有轻度气球样变，少数细胞出现空泡样变，部分细胞出现水肿坏死，组织结构轻度紊乱。

地黄外泌体组(见图3e)大鼠肝细胞排列规则，组织中无气球样变，细胞出现空泡样变显著减少，组织结构完整。

在光镜下观察，胰腺组织HE染色情况如图4所示：

正常对照组(见图4a)大鼠组织内胰岛正常分布，胰岛数目丰富，呈圆形或椭圆形，核圆形，胰岛与胰腺腺泡的界限清晰，腺泡细胞排列规则，胰岛细胞细胞质丰富，细胞核位置居中。模型组(见图4b)大鼠组织中胰岛数目明显减少，胰岛细胞排列紊乱，胰岛与胰腺腺泡的边界模糊，且胰岛体积变小，腺泡出现细胞水肿，管腔闭塞。

二甲双胍组(见图4c)大鼠组织内胰岛细胞数量稍有增多，胰岛细胞排列较为规则，胰岛形态不规则，胰岛与胰腺腺泡的界限较清晰。

鲜地黄汁组(见图4d)大鼠组织内胰岛细胞数量稍有增多，胰岛形态比较规则，结构正常，细胞排列均匀，但少量细胞中有空泡变性，胰岛与胰腺腺泡的界限较为清晰。

地黄外泌体组(见图4e)大鼠组织内胰岛细胞数量稍有增多，胰岛形态较为规则，结构正常，细胞排列均匀，胰岛与胰腺腺泡的界限较为清晰。

(4.8.2)肝组织油红〇染色

将用4％多聚甲醛固定后的肝脏组织样本取出，不同浓度的蔗糖脱水，包埋后可进行连续切片，切片厚度10μm，室温放置贴片，-20℃冰箱保存。染色时，取出肝脏冰冻切片，室温回温，蒸馏水浸润洗掉包埋剂，60％异丙醇浸洗2min，便于着色，油红〇工作液染色30min后，60％异丙醇漂洗数秒，结束后立即水洗，苏木精染色液复染，盐酸酒精分化，蒸馏水浸洗，最后甘油明胶封片，光镜下观察并拍照。

光镜下观察肝脏组织切片油红〇染色结果如图5所示，正常对照组(见图5a)大鼠肝脏中几乎无脂肪沉积。模型组(见图5b)大鼠肝细胞出现大量染为红色的沉积脂肪。与模型组比较，二甲双胍组(见图5c)、鲜地黄汁组(见图5d)、地黄外泌体组(见图5e)大鼠肝脏仍可见脂质沉积，但其沉积程度有所减轻。

(4.9)采用SPSS 21.0软件进行统计分析，实验数据均以“均数±标准差”来表示，统计学分析采用t检验，比较正常对照组与模型组之间、给药组与模型组之间的差异，以P<0.05为差异具有统计学意义，使用GraphPad Prism5.0软件绘制结果图。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种地黄外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1，制备鲜地黄汁：取鲜地黄，洗净，分切成块，利用榨汁机榨汁，获得鲜地黄汁，冷冻保存，备用；

S2，制备地黄外泌体：将鲜地黄汁解冻，以300Xg离心10min，获得上清液A；然后将上清液A以2000Xg离心10min，获得上清液B；再将上清液B以10000Xg离心30min，获得上清液C；最后将上清液C在100000Xg离心力下，离心80min，获得沉淀D，以PBS混悬沉淀D即得到外泌体总提物，进一步采用PEG离心沉淀法分离，得到精制的地黄外泌体。

2.根据权利要求1所述的地黄外泌体的制备方法，其特征在于，步骤S1中，鲜地黄汁的冷冻保存温度为-20℃。

3.根据权利要求2所述的地黄外泌体的制备方法，其特征在于，PEG离心沉淀法的具体过程为：将分子量为2000～6000的PEG配制成50％的溶液，然后将外泌体总提物加入PEG溶液中，搅拌静置，然后离心，获得的沉淀物即为地黄外泌体。

4.一种地黄外泌体，其特征在于，所述地黄外泌体由权利要求3所述的制备方法制得。

5.权利要求4所述的地黄外泌体的应用，其特征在于，所述地黄外泌体能够用于治疗2型糖尿病。

6.根据权利要求5所述的地黄外泌体的应用，其特征在于，所述地黄外泌体能够被制备成颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、口服液体制剂、注射剂、经皮给药制剂的任一种。