CN111936153A - 评估病毒载体效力的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于免疫疗法的T细胞及其方法。另一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。

Description

评估病毒载体效力的方法
相关申请的交叉引用
这是专利合作条约下的国际申请，要求享有2018年1月17日提交的美国临时申请序列号62/618,295和2018年1月17日提交的德国申请102018100967.4的权益，其内容是本文通过引用整体并入。
背景
1.技术领域
本公开涉及用一体积浓度的病毒载体转导的用于癌症免疫疗法的T细胞及其方法。一方面，本公开涉及用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。另一方面，本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。
2.技术背景
藉由治疗目的用之病毒载体或病毒递送基因的挑战是临床剂型的制备和精确定量。病毒疫苗、使用病毒载体的重组蛋白和病毒抗原的生产都需要量化病毒来不断调整和监测过程，以优化产量并回应不断变化的需求和应用。
病毒滴度测定或病毒定量涉及计数特定体积的病毒数量以确定病毒浓度。传统方法包括病毒噬斑测定(确定病毒样本中噬斑形成单位(pfu)的数量)和组织培养感染剂量(TCID50)或荧光活性感染剂量(FAID50)(测量感染性病毒滴度)。该TCID50测定法可定量杀死50％受感染宿主细胞或在50％接种组织培养细胞中产生细胞病变效应所需的病毒量。传统方法通常检测慢且为劳动密集型，并且受到包括测定间高度变异性的限制。
酶联免疫吸附测定(ELISA)是蛋白质测定更现代的演变方法，其利用与酶连接的特异性抗体来检测样本中是否存在未知量的抗原(即病毒)。透过酶将试剂转化为可检测信号的能力来检测和/或定量抗体-抗原结合事件，所述可检测信号可用于计算样本中抗原的浓度。基于使用ELISA的免疫荧光检测法开发了病毒滴度测定的平板测定法，但是，这些方法是用于定量来自病毒样本的蛋白质而不是定量感染性病毒。
流式细胞术或FACS(荧光激活细胞分选术)测定法已用于测量相对较高感染复数(MOI)下感染的细胞培养物中受感染细胞的数量。例如，美国专利号6,248,514描述了使用流式细胞术分析使用特定范围的病毒颗粒浓度和吸附时间感染的细胞产率。美国专利号7,476,507描述了用于测定受圆环病毒感染的宿主动物宿主细胞培养物的病毒滴度的基于FACS的方法。但是，对于许多应用，流式细胞仪器的成本、尺寸和复杂性阻碍了更广泛的使用。
评估逆转录病毒载体滴度的方法通常可分为功能性和非功能性滴定方法。非功能性滴定方法可包括p24抗原ELISA、逆转录酶(RT)活性的评估，以及透过半定量northern印迹、斑点印迹分析或RT-qPCR测定载体制剂中的基因组RNA浓度。有时这些技术高估了功能性载体滴度并存在某些缺点。例如，定量的p24蛋白质库可包括可变数量的游离p24和非功能性载体颗粒的p24。类似地，RNA滴度可评估缺陷颗粒，而RT测定可以证明RT活性。可以透过限制稀释载体后转导细胞并随后评估报告蛋白活性(例如β-半乳糖苷酶阳性细胞)或透过评估抗生素选择后菌落形成单位的数量来确定更准确的功能性滴度。用于量化功能性载体滴度的更广泛和直接的技术可以使用eGFP荧光和荧光激活细胞分选术(FACS)。但是，转基因表达的FACS分析可能仅限于荧光报告蛋白，并且可能无法区分单次或多次整合的细胞。
US20170166866描述了转导原代T淋巴细胞的方法，包括使原代T淋巴细胞与病毒载体(例如慢病毒载体)和是先天免疫系统抑制剂的化合物接触，所述病毒载体含有感染复数(MOI)为1.5-2.5的核酸，从而将核酸转导入T淋巴细胞中。
US20170023570描述了定量样本中感染性病毒颗粒的高通量方法。这种病毒定量方法包括以下步骤：1)提供含有病毒的样本；2)制备样本的连续稀释液；3)用病毒感染宿主细胞并培养培养物；4)使受感染细胞中的病毒所表达的抗原与用荧光标记物标记的抗体发生反应；5)确定感染细胞的数量；和6)确定样本中的病毒滴度。仍然需要开发更好的方法来评估用于免疫疗法之T细胞制造过程中病毒转导的最佳病毒浓度。
本领域需要在制造T细胞产物过程中定量病毒颗粒的准确方法。
简要概述
一方面，本公开提出了转导用于免疫疗法的T细胞的方法，包括：
(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；
(b)用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体激活T细胞；
(c)用病毒载体转导活化的T细胞；和
(d)扩增转导的T细胞。一方面，T细胞扩增约1天至约20天、约3天至约10天、约4天至约8天或约4天至约6天。
一方面，本公开涉及转导用于免疫疗法的T细胞的方法，例如，透过以下方式：
(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞；
(c)用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞；
(d)扩增转导的T细胞；
(e)测量在多个体积浓度的病毒载体下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数；
(f)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自多个健康供体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(g)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自患者的T细胞以用于免疫治疗。
另一方面，本公开涉及有此需要的患者或个体治疗方法，包括向患者施用以体积浓度用病毒载体转导的T细胞，其中T细胞获自患者，体积浓度由以下确定
(a)从多个健康供体获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。
另一方面，本公开涉及以体积浓度病毒载体转导的用于免疫疗法之T细胞，其中T细胞获自患者，体积浓度由以下确定
(a)从多个健康供体获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。
另一方面，病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
再一方面，病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
一方面、T细胞扩增约1天至约20天、约2天至约15天、约2天至约12天、约3天至约10天、约4天至约8天、约4天至约6天、约4天至约5天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、不超过约4天、不超过约5天或不超过约6天。
一方面，多个体积浓度为每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml。
另一方面，转导混合物可含细胞浓度为约0.1x 106个细胞/ml至约1.0x 106个细胞/ml、约0.5x 106个细胞/ml至约1.0x 106个细胞/ml、约1.0x 106个细胞/ml至约1.0x 107个细胞/ml、约5.0x 106个细胞/ml至约1.0x 107个细胞/ml、约1.0x 107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x 107个细胞/ml至约1.0x 108个细胞/ml。
另一方面，本文描述的方法包括确定体积浓度，其在来自多个健康供体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞。
再一方面，该方法包括确定体积浓度，其在来自多个健康供体的每个扩增T细胞中产生不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因。
一方面，确定的体积浓度为每0.5ml转导混合物含约1μl至约50μl、每0.5ml转导混合物含约5μl至约15μl、和每0.5ml转导混合物含约8μl至约12μl。
一方面，有此需要的患者或个体是癌症患者。另一方面，待治疗的癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。
一方面，T细胞获自多个健康供体、患者或个体。
另一方面，从多个健康供体、患者或个体和患者中获得的T细胞是CD8+T细胞和/或CD4+T细胞。
本公开提出了具有本文所述特征的T细胞群。另一方面，本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。
附图简要说明
图1显示了当基于体积浓度比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从6号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(慢病毒(LV)-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5 TCR)(虚线)的T细胞数量(MHC Dextramer(Dex)+的％)相似。
图2显示了当基于感染复数(MOI)比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从6号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5TCR)(虚线)的T细胞数量(Dex+的％)不同。
图3显示了当基于体积浓度比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从7号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5 TCR)(虚线)的T细胞数量(Dex+的％)相似。
图4显示了当基于感染复数(MOI)比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从7号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5TCR)(虚线)的T细胞数量(Dex+的％)不同。
图5显示了当基于体积浓度比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从9号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5 TCR)(虚线)的T细胞数量(Dex+的％)相似。
图6显示了当基于感染复数(MOI)比对时工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次中从9号健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)拷贝数(实线)和表达转基因(R7P1D5TCR)(虚线)的T细胞数量(Dex+的％)不同。
图7显示了在用三种选定体积浓度病毒载体转导的10个健康供体获得的T细胞中表达转基因(R7P1D5 TCR)的T细胞数量(CD3+CD8+细胞的％Dex+)，以选择最佳病毒体积。
图8显示了在用三种选定体积浓度病毒载体转导的10个健康供体获得的T细胞中整合病毒载体(LV-R73)的拷贝数，以选择最佳病毒体积。
图9显示了根据本公开一个实施方案所述的方法。
详细说明
本公开提出了用一体积浓度的病毒载体转导的T细胞及其方法。一方面，本公开提出了用于转导T细胞的最佳慢病毒载体浓度的评估。
本公开进一步提出了透过本文所述方法产生的T细胞群。
一方面，本公开包括转导T细胞的方法，其包括：
(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；
(b)用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体激活T细胞；
(c)用病毒载体转导活化的T细胞；和
(d)扩增转导的T细胞。
另一方面，本公开包括转导T细胞的方法，其包括：
(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；
(b)用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体激活T细胞；
(c)用病毒载体转导活化的T细胞；和
(d)任选扩增转导的T细胞；
(e)任选测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个T细胞中整合转基因的拷贝数；和
(f)任选确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自多个健康供体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因的，以及
(g)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自患者的T细胞以用于免疫治疗。
再一方面，本公开包括转导T细胞的方法，其包括：
(a)从至少一个供体、患者或个体获得T细胞；
(b)用抗CD3抗体和/或抗CD28抗体激活T细胞；
(c)用病毒载体转导活化的T细胞；和
(d)扩增转导的T细胞；
(e)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个T细胞中整合转基因的拷贝数；
(f)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自多个健康供体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(g)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自患者的T细胞以用于免疫治疗。
一方面，T细胞获自多个健康供体、患者或个体。另一方面，T细胞获自一个或更多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、十个或更多个或20个或更多个健康供体、患者或个体。一方面，T细胞对患者或个体是自体的。另一方面，T细胞对患者或个体是同种异体的。
另一方面，病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
一方面，多个体积浓度为约0.01μl/约106个细胞至约1ml/约106个细胞；约0.01μl/约2x 106个细胞至约1ml/约2x 106个细胞；约0.01μl/约5x 106个细胞至约1ml/约5x 106个细胞；约0.01μl/约107个细胞至约1ml/约107个细胞；约1μl/约107个细胞至约500μl/约107个细胞；约5μl/约107个细胞至约150μl/约107个细胞；或者约8μl/约107个细胞至约12μl/约107个细胞。
在本文中使用时，术语“约”定义为所述值的±5％。
本文使用的术语“体积浓度”是指每体积(例如ml和μl)转导混合物(培养基或稀释剂)使用的病毒体积(例如ml和μl)。转导混合物的体积可透过转导期间的细胞浓度来确定。例如，如果转导期间的细胞浓度固定为2.0x 106个细胞/ml，则2.0x106个转导细胞可为1.0ml转导混合物的固定体积，或者1.0x 106个转导细胞可为0.5ml转导混合物的固定体积。
另一方面，本文描述的方法包括确定体积浓度，其在来自多个健康供体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞，例如，测量转基因表达阳性的细胞百分比。
再一方面，该方法包括确定体积浓度，其在来自多个健康供体的扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数。
一方面，患者或个体是癌症患者。另一方面，本文所述的癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。
本公开还提出了载体。一方面，“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导目的基因表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体以及整合载体。
已经基于各种逆转录病毒科成员设计了逆转录病毒载体，包括泡沫病毒、人免疫缺陷病毒(HIV-1)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、牛免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠白血病病毒(MLV)、牛白血病病毒、劳斯肉瘤病毒(RSV)、脾坏死病毒(SNV)和小鼠乳腺肿瘤病毒。常用平台可包括泡沫病毒衍生的和HIV-1衍生的慢病毒载体以及MLV衍生的γ逆转录病毒载体。逆转录病毒的嗜性可透过掺入外来包膜蛋白来改变，从而扩展靶细胞的潜在靶标群。例如，掺入水泡性口炎病毒G糖蛋白(VSV-G)包膜蛋白可拓宽嗜性并允许基因在体外转移到多种细胞(例如：CD34+干细胞)以及在体内转移到脑、肌肉和肝脏等。掺入杆状病毒GP64和丙型肝炎E1和E2假型包膜蛋白可增强肝转导，掺入RD114假型化包膜蛋白可能有利于在淋巴造血细胞中转导。慢病毒载体可以转导或感染非分裂细胞，通常产生高病毒滴度。慢病毒或γ逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。这些载体可由顺式作用长末端重复序列组成，该重复序列具有高达6-10kb外来序列的包装能力。最小顺式作用LTR足以用于复制和包装载体，然后将其用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。
在某些实施方案中，载体是慢病毒载体。本文所使用的慢病毒载体是包含至少一种可衍生自慢病毒的组分部分的载体。慢病毒的详细列表可参阅Coffin et al.(1997)“Retroviruses”Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:J M Coffin,S M Hughes,H E Varmus pp 758-763)一文。慢病毒载体产生的方法请参见，例如，美国专利第5,994,136、6,165,782和6,428,953号，各自内容透过引用整体并入。优选地，慢病毒载体是整合酶缺陷型慢病毒载体(IDLV)。参见，例如，美国专利公开2009/0117617，其内容透过引用整体并入。IDLV可如所述方法产生，例如使用包含天然慢病毒整合酶基因中一个或多个突变的慢病毒载体，例如，如Leavitt et al.(1996)J.Virol.70(2):721-728、Philippe et al.(2006)Proc.Natl Acad.Sci USA 103(47):17684-17689以及WO 06/010834所公开的，各自内容透过引用整体并入。在某些实施方案中，IDLV是HIV慢病毒载体，其包含整合酶蛋白(D64V)第64位突变，如Leavitt et al.(1996)J.Virol.70(2):721-728一文所公开的，其内容透过引用整体并入。
在基因治疗应用中，可能需要以特定组织类型高度特异性递送基因治疗载体。因此，透过在病毒外表面上表达配体作为与病毒外壳蛋白的融合蛋白，可以修饰病毒载体以具有对给定细胞类型的特异性。选择配体以对已知存在于目的细胞类型上的受体具有亲和力。例如，Han et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)(其内容透过引用整体并入)一文报告了莫洛尼鼠白血病病毒可被修饰以表达与gp70融合的人调节蛋白，并且重组病毒可感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。该原理可以扩展到其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，病毒表达包含细胞表面受体配体的融合蛋白。例如，可改造丝状噬菌体以展示抗体片段(例如，FAB或Fv)，其对几乎任何选定的细胞受体均具有特异性结合亲和力。尽管以上描述主要适用于病毒载体，但相同的原理可应用于非病毒载体。可以将此类载体改造为含有特异性摄取序列，从而有利于特定靶细胞的摄取。
基因治疗载体可以透过给予个体患者进行体内递送，通常透过全身给药(例如，静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下或颅内输注)或局部给药递送，如下所述。或者，可以将载体离体递送至细胞，例如从个体患者(例如，淋巴细胞、骨髓抽吸物、组织活检物)或通用供体造血干细胞移出的细胞，然后将这些细胞重新植入患者体内，通常在选择掺入载体的细胞后。
合适的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。此类细胞或由此类细胞产生的细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如：CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如：HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及诸如草地贪夜蛾(Sf)等昆虫细胞或诸如酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属等真菌细胞。在某些实施方案中，细胞系是CHO-K1、MDCK或HEK293细胞系。另外，原代细胞可进行分离并在用核酸酶(例如ZFN或TALEN)或核酸酶系统(例如CRISPR/Cas)处理后离体使用以重新引入待治疗的受试者。合适的原代细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和其他血细胞亚群，例如但不限于T淋巴细胞，如CD4+T细胞或CD8+T细胞。合适的细胞还包括干细胞，例如：胚胎干细胞、诱导的多能干细胞、造血干细胞(CD34+)、神经元干细胞和间充质干细胞。适于将转基因导入免疫细胞(例如T细胞)的载体包括非整合型慢病毒载体。
在T细胞的常规制造中，要使用的病毒载体数量通常基于细胞系(如293T)上测定的病毒批次滴度。使用该滴度，测试一系列感染复数(MOI)的病毒，当指涉用病毒颗粒接种一组细胞时，此为存在于定义空间中之病毒颗粒数量与靶细胞数量的比率。可选择线性范围内的最高感染复数(MOI)值作为最佳感染复数(MOI)。但是，在用于测定滴度和滴度依赖性可变感染复数(MOI)时，该方法可允许由于使用肿瘤细胞系(例如293T)而具有很大的变异空间。本公开的实施方案可包括用于确定制造中所使用最佳病毒体积和评估不同病毒载体批次效力的方法。例如，可不使用细胞系(例如293T细胞)，透过遵循相同的T细胞制造工艺以小规模(例如24孔G-Rex(2cm2)每孔中1-2百万个细胞)使用来自健康供体的原代人T细胞；中等规模6孔G-Rex(10cm2)每孔中可能有500万个细胞，或者大规模G-Rex 100(100cm2)中可能有5000万个细胞。优良制造规范(GMP)规模可从5-8G-Rex100中的2.50-4亿个细胞开始。不同规模获得的读数可能与临床制造直接相关。
因此，本公开的方法可能比使用细胞系衍生的滴度和感染复数(MOI)的常规方法更稳健，当制造相同T细胞产物需要多个慢病毒载体批次时可能减少变异。
“外源”分子是通常不存在于细胞中的分子，但可以透过一种或多种遗传、生物化学或其他方法引入细胞中。“正常存在于细胞”根据细胞的特定发育阶段和环境条件确定。因此，例如，仅在肌肉胚胎发育期间存在的分子是相对于成体肌细胞的外源分子。类似地，由热休克诱导的分子是相对于非热休克细胞的外源分子。外源分子可包括，例如，功能失常内源性分子的功能形式或功能正常内源性分子的功能失常形式。
外源分子可以是小分子(例如透过组合化学工艺产生)，也可以是大分子，例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何经修饰的上述分子衍生物或包含一种或多种上述分子的任何复合体。核酸包括DNA和RNA，可以为单链或双链，可以为直链、支链或环状，并且可以为任何长度。核酸包括能够形成双链体的核酸以及形成三链体的核酸。参见，例如，美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙醯化酶、脱乙醯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、回旋酶和解旋酶。
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可包含感染病毒基因组、引入细胞的质粒或附加体，或通常不存在于细胞中的染色体。将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移以及病毒载体介导的转移。
相反，“内源”分子是在特定环境条件下特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源核酸可包含染色体、线粒体基因组、叶绿体或其他细胞器，或天然存在的游离核酸。其他内源分子可包括蛋白质，例如，转录因子和酶。
出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(参见下文)以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论此类调节序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、转译调控序列(如：核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。
“基因表达”是指将包含于基因中的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核糖酵素、结构RNA或任何其他类型的RNA)或透过mRNA转译产生的蛋白质。基因产物还包括透过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的工艺修饰的RNA，以及透过例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻醯化和糖基化修饰的蛋白质。
基因表达的“调节”是指基因活性的变化。表达的调节可包括但不限于基因激活和基因抑制。调节也能是完全调节，即，其中基因表达完全失活或被激活至野生型水平或更高水平；也可能是部分调节，其中基因表达部分减少或部分激活至一部分的野生型水平。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指线性或环状构象的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且是单链或双链形式。出于本公开的目的，这些术语不应被理解为限制聚合物长度。这些术语可包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯骨架)中被修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物将与T碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，其可以为DNA或RNA，可以为直链、环状或支链，可以是单链或双链。术语“供体序列”是指插入基因组的核苷酸序列。供体序列可以为任何长度，例如长度为2至10,000个核苷酸(或其间或其以上的任何整数值)，优选长度为约100至1,000个核苷酸(或其间任何整数)，长度更优选为约200至500个核苷酸。
实施例
实施例1
批次
临床前(R&D)、工程化(Eng Run)和GMP(GMP Run)批次可能是从LENTIGEN获得的三批慢病毒载体。工程化批次可能类似于GMP批次(每批32L，但QC和放行规范可能比GMP批次更严格)。临床前批次(未显示)可能是比Eng Run和GMP Run更小的载体批次制备(4L)。例如，用于临床前批次、工程化批次和GMP批次的滴度可能分别为1.1x109 TU/ml、1.9x109 TU/ml和8.3x109 TU/ml。
基于体积浓度不同批次之间转导效率类似
用表达R7P1D5 TCR(LV-R73)的慢病毒载体转导来自健康供体的T细胞可能透过用固定的抗CD3/抗CD28抗体(Invitrogen)活化T细胞来进行，其中细胞在TexMACS培养基(Miltenyi)、含IL-7和IL-15的5％人AB血清中培养以用于扩增，条件是细胞因子不是单独的IL-2，不是单独的IL-7，不是IL-2、IL-7和IL-15的组合物，也不是IL-2和IL-7的组合物。该程序保留了早期T细胞分化表型(T幼稚/scm：CD45RA+CCR7+或CD45RA+CCR7+CD62L+或CD45RO-CCR7+或CD45RO-CCR7+CD62L+)，并且转导细胞显示出与未转导T细胞相当的增殖。也可能使用其他细胞因子，例如IL-10、IL-12、IL-21、干扰素和TGF-β。转导的细胞还可能显示CD28+CD27+表型。
拷贝数
拷贝数是指来自T细胞产物的提取基因组DNA中的原病毒载体基因组定量，以及透过已知拷贝数的参照基因数量进行标准化。确定拷贝数的最常用方法是基于标准TaqMan平台(Applied Systems)的定量实时PCR(qPCR)。因此，拷贝数可指使用定量PCR从T细胞产物分离的基因组DNA中检测到的整合载体序列平均数。基因组DNA可从T细胞中分离，并可使用对慢病毒载体和管家基因的特异性引物/探针测定法进行扩增。例如，拷贝数检测qPCR测定法可用于定量相对于内源参照基因(白蛋白)的慢病毒整合基因组。T细胞产物的有效性和安全性由平均拷贝数确定。较高的整合通常导致较高的转基因表达，但也增加了插入诱变的风险。FDA法规描述平均拷贝数为5或更低为细胞产物的安全规范。因此，拷贝数可视为是确定LV批次效力和临床制造最佳体积浓度的关键参数。
转导期间的细胞浓度固定于约2x 106个细胞/ml。图1、3和5(实线)分别显示了从3个健康供体(即供体6、供体7和供体9)获得的原代T细胞，并用递增体积浓度的慢病毒(LV)-R73进行转导，在每1.0ml转导混合物(可含有约2x 106个细胞)中以LV-R73的体积浓度(例如，以对数标度绘制的3倍连续稀释)依赖方式下，表现出工程化批次(Eng Run)和GMP批次(GMP Run)之间整合LV-R73的拷贝数增加且具有可比性。
相反，图2、4和6(实线)分别显示，从供体6、供体7和供体9获得的Eng Run和GMPRun之间之整合LV-R73拷贝数随着增加感染复数(MOI)有显著差异。
这些结果显示，基于体积浓度，在两个载体制造批次的LV-R73(工程化批次和GMP批次)之间获得了相当的整合慢病毒载体拷贝数。
转基因表达
转基因表达是指使用特异性HLA-dextramer透过流式细胞术检测T细胞表面上的转基因TCR。结果表示为总CD3+CD8+细胞的Dextramer+ve细胞百分比(Dex+的％)。
测试LV-R73转导的T细胞与MHC HLA-A2-肽dextramer的结合。MHC Dextramer(Dex)可能含有携带优化数量MHC和荧光染料分子的葡聚糖聚合物骨架。MHC Dextramer试剂比传统的MHC多聚体携带更多的MHC分子和更多的荧光染料。这增加了特定T细胞的亲合力并增强了染色强度，从而提高了分辨率和信噪比。对于染色，遵循制造商提供的方案。在MACS Quant Analyzer(Miltenyi)上获得样本，并透过Flow Jo软件分析数据。
图1、3和5(虚线)分别显示了从3个健康供体(即供体6、供体7和供体9)获得的原代T细胞，并用LV-R73进行转导，在每1.0ml转导混合物(可含有约2x 106个细胞)中以LV-R73的体积浓度(例如，以对数标度绘制的3倍连续稀释)依赖方式下，表现出大规模工程化批次(Eng Run)和GMP批次(GMP Run)之间转基因(例如，R73 TCR)表达水平(Dex+的％)增加且具有可比性。
但是，当基于病毒滴度确定的感染复数(MOI)值比较Eng run和GMP Run之间的Dex+细胞百分比时，两批(Eng Run和GMP run)显著不同，如图2、4和6(虚线)所示。
这些结果表明，基于体积浓度，两个载体制造批次的LV-R73(工程化批次和GMP批次)在源自健康供体的原代T细胞中产生相当的转基因表达(CD3+CD8+细胞中Dextramer+ve的百分比)。
这些结果表明，在需要使用多个载体批次的高级别临床试验中比较不同载体批次的效力和确定临床制造转基因产物最佳载体体积时，体积方法可能比依赖于例如使用HEK293 T细胞确定病毒滴度的感染复数(MOI)方法更可靠。
T细胞转导的病毒体积浓度优化
在广泛范围比较之后(如图1-6所示)，选择几个体积浓度对从多个健康供体获得的原代T细胞中进行进一步的筛选。使用选定的体积浓度(例如，5μl、7.5μl和10μl)进行小、中和大规模T细胞制造。
转导期间的细胞浓度固定在约2x 106个细胞/ml。从10个健康供体获得的原代T细胞用递增病毒体积浓度的LV-R73进行转导，例如，每0.5ml转导混合物中为5μl、7.5μl和10μl LV-R73(其中可含有约1x 106个细胞)。如上所述，在转导后第8天和第10天测定病毒载体(例如LV-R73)的转基因表达和整合拷贝数。
图7显示了来自10个供体(空心和实心方块)的转导T细胞中平均转基因表达(％Dex+)呈体积浓度依赖性方式增加。也就是说，每0.5ml转导混合物中5μl LV-R73产生最低平均数量的表达转基因的转导T细胞，且每0.5ml转导混合物中10μl LV-R73产生最高平均数量的表达转基因的转导T细胞。另外，表达转基因的转导T细胞的平均数量在转导后8天至转导后10天在每个体积浓度下无显著变化。
图8显示了来自10个供体(空心和实心方块)的转导T细胞中平均整合拷贝数(拷贝数)病毒载体(如：LV-R73)呈体积浓度依赖性方式增加。也就是说，每0.5ml转导混合物中5μl LV-R73产生最低平均整合拷贝数的病毒载体，且每0.5ml转导混合物中10μl LV-R73产生最高平均整合拷贝数的病毒载体。但是，在每个体积浓度下的平均整合拷贝数从转导后8天至转导后10天均降低。这些结果表明，尽管平均整合拷贝数在转导后10天降低，但表达转基因的转导T细胞的平均数量仍然与转导后8天的平均数量相当。
这些结果显示，在不同供体和规模中始终显示最大HLA-Multimer+ve细胞百分比且不超过5个拷贝数的病毒体积浓度可选择作为临床制造的最佳病毒体积浓度。
图9显示了根据本公开内容一个实施方案转导用于免疫疗法之T细胞的方法(90)，包括从多个健康供体获得T细胞(91)、用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞(92)、用多种体积浓度的病毒载体转导激活T细胞(93)、扩增转导T细胞(94)(例如4-6天)、测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或扩增T细胞中整合转基因的拷贝数(95)、确定产生最大平均数量的表达转基因的转导T细胞和/或来自多个健康供体的每个扩增T细胞中最大平均拷贝数的整合转基因的体积浓度(96)、以及以确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞用于免疫治疗(97)。
本公开的优点可能包括能够使用与制造T细胞产物中所用的相同工艺准确定义在T细胞产物生产过程中所用慢病毒载体数量的方法。因为病毒滴度和体积浓度之间没有关系，所以体积浓度方法优于依赖于病毒滴度的感染复数(MOI)方法。因此，本公开的方法可能比使用细胞系衍生的病毒滴度以获得最佳感染复数(MOI)的常规方法更稳健，当制造相同的T细胞产物需要多个慢病毒载体批次时可以减少变异。
本专利说明书中引用的所有参考文献均透过引用并入本文，如同每篇参考文献被具体和单独地指出透过引用并入。任何参考文献的引用均为其在申请日之前的公开内容，不应解释为认可本公开内容无权凭借之前的发明而先于此类参考文献。

Claims (39)

1.权利要求内容为：
一种转导用于免疫治疗之T细胞的方法，包括
(a)从至少一个个体中获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活T细胞，
用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增转导的T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或在来自至少一个个体的每个扩增T细胞中不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以确定的体积浓度用病毒载体转导来自至少一个个体的T细胞以用于免疫治疗。
2.权利要求1所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
3.权利要求1或2所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
4.权利要求1-3任一项中所述的方法，其中多个体积浓度选自由每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml组成的群。
5.权利要求4所述的方法，其中转导混合物包含细胞浓度为约0.1x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约0.5x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约1.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述T细胞获自多个健康个体。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，包括扩增转导的T细胞。
8.权利要求1-7中任一项所述的方法，其中确定在来自至少一个个体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的转导T细胞的体积浓度。
9.权利要求1-8中任一项所述的方法，其中确定在来自至少一个个体的扩增T细胞中产生最大平均拷贝数的整合转基因的体积浓度。
10.权利要求1-9中任一项所述的方法，其中确定的体积浓度为选自由每0.5ml转导混合物含约1μl至约50μl、每0.5ml转导混合物含约5μl至约15μl、和每0.5ml转导混合物含约8μl至约12μl组成的组。
11.权利要求1-10中任一项所述的方法，其中待治疗的个体是癌症患者。
12.权利要求11所述的方法，其中所述癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。
13.权利要求1-12中任一项所述的方法，其中从所述至少一个供体、患者或个体获得的T细胞是CD8+T细胞。
14.一种治疗患者的方法，包括给予患者以体积浓度病毒载体转导的T细胞，
其中T细胞从患者身上获得，
其中体积浓度由以下确定：
(a)从多个健康供体获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或在步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。
15.权利要求14所述的方法，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
16.权利要求14或15所述的方法，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
17.权利要求14-16任一项中所述的方法，其中多个体积浓度选自由每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml组成的群。
18.权利要求17所述的方法，其中转导混合物包含细胞浓度为约0.1x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约0.5x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约1.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml。
19.权利要求14-18中任一项所述的方法，其中确定在来自多个供体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的转导T细胞的体积浓度。
20.权利要求14-19中任一项所述的方法，其中确定在来自多个供体的扩增T细胞中产生最大平均拷贝数的整合转基因的体积浓度。
21.权利要求15-20中任一项所述的方法，其中确定的体积浓度为选自由每0.5ml转导混合物含约1μl至约50μl、每0.5ml转导混合物含约5μl至约15μl、和每0.5ml转导混合物含约8μl至约12μl组成的组。
22.权利要求14-21中任一项所述的方法，其中患者患有癌症。
23.权利要求22所述的方法，其中所述癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。
24.权利要求14-23中任一项所述的方法，其中从多个健康供体和患者获得的T细胞是CD8+T细胞。
25.一种以体积浓度病毒载体转导的用于免疫治疗之T细胞，
其中T细胞从患者身上获得，
其中体积浓度由以下确定
(a)从多个健康供体获得T细胞，
(b)用抗CD3抗体和抗CD28抗体激活步骤(a)中获得的T细胞，用多个体积浓度的病毒载体转导活化的T细胞，
(c)扩增步骤(b)中获得的转导T细胞，
(d)测量在多个体积浓度下表达转基因的扩增T细胞的数量和/或步骤(c)中获得的每个扩增T细胞中整合转基因的拷贝数，
(e)确定体积浓度，其产生最大平均数量的表达转基因的扩增T细胞和/或步骤(d)中测量的不超过五个拷贝的整合转基因之最大平均拷贝数的整合转基因，以及
(f)以步骤(e)所确定的体积浓度用病毒载体转导从患者中获得的T细胞。
26.权利要求25所述的T细胞，其中病毒载体是表达T细胞受体(TCR)的逆转录病毒载体。
27.权利要求25或26所述的T细胞，其中病毒载体是表达TCR的慢病毒载体。
28.权利要求25-27任一项中所述的T细胞，其中多个体积浓度选自由每0.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每1.0ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、每2.5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml、和每5ml转导混合物含约0.01μl至约1ml组成的群。
29.权利要求28所述的方法，其中转导混合物包含细胞浓度为约0.1x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约0.5x106个细胞/ml至约1.0x106个细胞/ml、约1.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约5.0x106个细胞/ml至约1.0x107个细胞/ml、约1.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml或约5.0x107个细胞/ml至约1.0x108个细胞/ml。
30.权利要求25-29中任一项所述的T细胞，其中确定包括确定在来自多个健康供体的扩增T细胞中产生最大平均数量的表达转基因的转导T细胞的体积浓度。
31.权利要求25-29中任一项所述的T细胞，其中确定包括确定在来自多个健康供体的扩增T细胞中产生最大平均拷贝数的整合转基因的体积浓度。
32.权利要求25-31中任一项所述的T细胞，其中确定的体积浓度为选自由每0.5ml转导混合物含约1μl至约50μl、每0.5ml转导混合物含约5μl至约15μl、和每0.5ml转导混合物含约8μl至约12μl组成的组。
33.权利要求25-32中任一项所述的T细胞，其中患者患有癌症。
34.权利要求33所述的T细胞，其中所述癌症选自由肝细胞癌(HCC)、结直肠癌(CRC)、胶质母细胞瘤(GB)、胃癌(GC)、食道癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胰腺癌(PC)、肾细胞癌(RCC)、良性前列腺增生(BPH)、前列腺癌(PCA)、卵巢癌(OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、梅克尔细胞癌(MCC)、小细胞肺癌(SCLC)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、急性骨髓性白血病(AML)、胆囊癌和胆管癌(GBC、CCC)、膀胱癌(UBC)、急性淋巴母细胞白血病(ALL)和子宫癌(UEC)组成的组。
35.一种透过权利要求1-13中任一项所述的方法产生的T细胞群。
36.一种透过权利要求14-24中任一项所述的方法产生的T细胞群。
37.权利要求25所述的T细胞，其中所述扩增在IL-7、IL-10、IL-12、IL-15和IL-21存在下进行，条件是所述活化不在单独的IL-2、单独的IL-7、IL-2、IL-7和IL-15的组合或IL-2和IL-7的组合的存在下进行。
38.权利要求37所述的T细胞，其中转导的T细胞表现出CD45RA+CCR7+或CD45RA+CCR7+CD62L+或CD45RO-CCR7+或CD45RO-CCR7+CD62L+的表型。
39.权利要求37所述的T细胞，其中转导的T细胞表现出CD28+CD27+的表型。
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