TW201934755A - 評估病毒載體效力的方法 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及用一體積濃度的病毒載體轉導的用於免疫療法的 T 細胞及其方法。另一方面，本公開涉及用於轉導 T 細胞的最佳慢病毒載體濃度的評估。本公開進一步提出了透過本文所述方法產生的 T 細胞群。

Description

評估病毒載體效力的方法
本公開涉及用一體積濃度的病毒載體轉導的用於癌症免疫療法的 T 細胞及其方法。一方面，本公開涉及用於轉導 T 細胞的最佳慢病毒載體濃度的評估。另一方面，本公開進一步提出了透過本文所述方法產生的 T 細胞群。
藉由治療目的用之病毒載體或病毒遞送基因的挑戰是臨床劑型的製備和精確定量。病毒疫苗、使用病毒載體的重組蛋白和病毒抗原的生產都需要量化病毒來不斷調整和監測過程，以優化產量並回應不斷變化的需求和應用。
病毒滴度測定或病毒定量涉及計數特定體積的病毒數量以確定病毒濃度。傳統方法包括病毒噬斑測定（確定病毒樣本中噬斑形成單位 (pfu) 的數量）和組織培養感染劑量 (TCID50) 或熒光活性感染劑量 (FAID50)（測量感染性病毒滴度）。該 TCID50 測定法可定量殺死 50% 受感染宿主細胞或在 50% 接種組織培養細胞中產生細胞病變效應所需的病毒量。傳統方法通常檢測慢且為勞動密集型，並且受到包括測定間高度變異性的限制。
酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 是蛋白質測定更現代的演變方法，其利用與酶連接的特異性抗體來檢測樣本中是否存在未知量的抗原（即病毒）。透過酶將試劑轉化為可檢測信號的能力來檢測和/或定量抗體-抗原結合事件，所述可檢測信號可用於計算樣本中抗原的濃度。基於使用 ELISA 的免疫熒光檢測法開發了病毒滴度測定的平板測定法，但是，這些方法是用於定量來自病毒樣本的蛋白質而不是定量感染性病毒。
流式細胞術或 FACS（熒光激活細胞分選術）測定法已用於測量相對較高感染複數 (MOI) 下感染的細胞培養物中受感染細胞的數量。例如，美國專利號 6,248,514 描述了使用流式細胞術分析使用特定範圍的病毒顆粒濃度和吸附時間感染的細胞產率。美國專利號 7,476,507 描述了用於測定受圓環病毒感染的宿主動物宿主細胞培養物的病毒滴度的基於 FACS 的方法。但是，對於許多應用，流式細胞儀器的成本、尺寸和複雜性阻礙了更廣泛的使用。
評估逆轉錄病毒載體滴度的方法通常可分為功能性和非功能性滴定方法。非功能性滴定方法可包括 p24 抗原 ELISA、逆轉錄酶 (RT) 活性的評估，以及透過半定量 northern 印跡、斑點印跡分析或 RT-qPCR 測定載體製劑中的基因組 RNA 濃度。有時這些技術高估了功能性載體滴度並存在某些缺點。例如，定量的 p24 蛋白質庫可包括可變數量的游離 p24 和非功能性載體顆粒的 p24。類似地，RNA 滴度可評估缺陷顆粒，而 RT 測定可以證明 RT 活性。可以透過限制稀釋載體後轉導細胞並隨後評估報告蛋白活性（例如 β-半乳糖苷酶陽性細胞）或透過評估抗生素選擇後菌落形成單位的數量來確定更準確的功能性滴度。用於量化功能性載體滴度的更廣泛和直接的技術可以使用 eGFP 熒光和熒光激活細胞分選術 (FACS)。但是，轉基因表達的 FACS 分析可能僅限於熒光報告蛋白，並且可能無法區分單次或多次整合的細胞。
US20170166866 描述了轉導原代 T 淋巴細胞的方法，包括使原代 T 淋巴細胞與病毒載體（例如慢病毒載體）和是先天免疫系統抑制劑的化合物接觸，所述病毒載體含有感染複數 (MOI) 為 1.5-2.5 的核酸，從而將核酸轉導入 T 淋巴細胞中。
US20170023570 描述了定量樣本中感染性病毒顆粒的高通量方法。這種病毒定量方法包括以下步驟：1) 提供含有病毒的樣本；2) 製備樣本的連續稀釋液；3) 用病毒感染宿主細胞並培養培養物；4) 使受感染細胞中的病毒所表達的抗原與用熒光標記物標記的抗體發生反應；5) 確定感染細胞的數量；和6) 確定樣本中的病毒滴度。仍然需要開發更好的方法來評估用於免疫療法之 T 細胞製造過程中病毒轉導的最佳病毒濃度。
本領域需要在製造 T 細胞產物過程中定量病毒顆粒的準確方法。
一方面，本公開提出了轉導用於免疫療法的 T 細胞的方法，包括： (a) 從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞； (b) 用抗 CD3 抗體和/或抗 CD28 抗體激活 T 細胞； (c) 用病毒載體轉導活化的 T 細胞；和 (d) 擴增轉導的 T 細胞。一方面， T 細胞擴增約 1 天至約 20 天、約 3 天至約 10 天、約 4 天至約 8 天或約 4 天至約 6 天。
一方面，本公開涉及轉導用於免疫療法的 T 細胞的方法，例如，透過以下方式： (a) 從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞； (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活 T 細胞； (c) 用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞； (d) 擴增轉導的 T 細胞； (e) 測量在多個體積濃度的病毒載體下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數； (f) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或在來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (g) 以確定的體積濃度用病毒載體轉導來自患者的 T 細胞以用於免疫治療。
另一方面，本公開涉及有此需要的患者或個體治療方法，包括向患者施用以體積濃度用病毒載體轉導的 T 細胞，其中 T 細胞獲自患者，體積濃度由以下確定 (a) 從多個健康供體獲得 T 細胞， (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活步驟 (a) 中獲得的 T 細胞，用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞， (c) 擴增步驟 (b) 中獲得的轉導 T 細胞， (d) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或在步驟 (c) 中獲得的每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數， (e) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或步驟 (d) 中測量的不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (f) 以步驟 (e) 所確定的體積濃度用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞。
另一方面，本公開涉及以體積濃度病毒載體轉導的用於免疫療法之 T 細胞，其中 T 細胞獲自患者，體積濃度由以下確定 (a) 從多個健康供體獲得 T 細胞， (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活步驟 (a) 中獲得的 T 細胞，用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞， (c) 擴增步驟 (b) 中獲得的轉導 T 細胞， (d) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或在步驟 (c) 中獲得的每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數， (e) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或步驟 (d) 中測量的不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (f) 以步驟 (e) 所確定的體積濃度用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞。
另一方面，病毒載體是表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體。
再一方面，病毒載體是表達 TCR 的慢病毒載體。
一方面、 T 細胞擴增約 1 天至約 20 天、約 2 天至約 15 天、約 2 天至約 12 天、約 3 天至約 10 天、約 4 天至約 8 天、約 4 天至約 6 天、約 4 天至約 5 天、至少約 3 天、至少約 4 天、至少約 5 天、至少約 6 天、不超過約 4 天、不超過約 5 天或不超過約 6 天。
一方面，多個體積濃度為每 0.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 1.0 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 2.5ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、和每 5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml。
另一方面，轉導混合物可含細胞濃度為約 0.1 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 0.5 x 106 個細胞/ml至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 1.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 5.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 1.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml 或約 5.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml。
另一方面，本文描述的方法包括確定體積濃度，其在來自多個健康供體的擴增 T 細胞中產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞。
再一方面，該方法包括確定體積濃度，其在來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中產生不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因。
一方面，確定的體積濃度為每 0.5 ml 轉導混合物含約 1 μl 至約 50 µl、每 0.5 ml 轉導混合物含約 5 μl 至約 15 µl、和每 0.5 ml 轉導混合物含約 8 μl 至約 12 μl。
一方面，有此需要的患者或個體是癌症患者。另一方面，待治療的癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 組成的組。
一方面，T 細胞獲自多個健康供體、患者或個體。
另一方面，從多個健康供體、患者或個體和患者中獲得的 T 細胞是 CD8+ T 細胞和/或 CD4+ T 細胞。
本公開提出了具有本文所述特徵的 T 細胞群。另一方面，本公開進一步提出了透過本文所述方法產生的 T 細胞群。
本公開提出了用一體積濃度的病毒載體轉導的 T 細胞及其方法。一方面，本公開提出了用於轉導 T 細胞的最佳慢病毒載體濃度的評估。
本公開進一步提出了透過本文所述方法產生的 T 細胞群。
一方面，本公開包括轉導 T 細胞的方法，其包括： (a) 從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞； (b) 用抗 CD3 抗體和/或抗 CD28 抗體激活 T 細胞； (c) 用病毒載體轉導活化的 T 細胞；和 (d) 擴增轉導的 T 細胞。
另一方面，本公開包括轉導 T 細胞的方法，其包括： (a) 從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞； (b) 用抗 CD3 抗體和/或抗 CD28 抗體激活 T 細胞； (c) 用病毒載體轉導活化的 T 細胞；和 (d) 任選擴增轉導的 T 細胞； (e) 任選測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或每個 T 細胞中整合轉基因的拷貝數；和 (f) 任選確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或在來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因的，以及 (g) 以確定的體積濃度用病毒載體轉導來自患者的 T 細胞以用於免疫治療。
再一方面，本公開包括轉導 T 細胞的方法，其包括： (a) 從至少一個供體、患者或個體獲得 T 細胞； (b) 用抗 CD3 抗體和/或抗 CD28 抗體激活 T 細胞； (c) 用病毒載體轉導活化的 T 細胞；和 (d) 擴增轉導的 T 細胞； (e) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或每個 T 細胞中整合轉基因的拷貝數； (f) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或在來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (g) 以確定的體積濃度用病毒載體轉導來自患者的 T 細胞以用於免疫治療。
一方面，T 細胞獲自多個健康供體、患者或個體。另一方面，T 細胞獲自一個或更多個、兩個或更多個、三個或更多個、四個或更多個、五個或更多個、十個或更多個或 20 個或更多個健康供體、患者或個體。一方面，T 細胞對患者或個體是自體的。另一方面，T 細胞對患者或個體是同種異體的。
另一方面，病毒載體是表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體。
一方面，多個體積濃度為約 0.01 μl/約 106 個細胞至約 1 ml/約 106 個細胞；約 0.01 μl/約 2 x 106 個細胞至約 1 ml/約 2 x 106 個細胞；約 0.01 μl/約 5 x 106 個細胞至約 1 ml/約 5 x 106 個細胞；約 0.01 μl/約 107 個細胞至約 1 ml/約 107 個細胞；約 1 μl/約 107 個細胞至約 500 μl/約 107 個細胞；約 5 μl/約 107 個細胞至約 150 μl/約 107 個細胞；或者約 8 μl/約 107 個細胞至約 12 μl/約 107 個細胞。
在本文中使用時，術語「約」定義為所述值的 ±5%。
本文使用的術語「體積濃度」是指每體積（例如 ml 和 μl）轉導混合物（培養基或稀釋劑）使用的病毒體積（例如 ml 和 μl）。轉導混合物的體積可透過轉導期間的細胞濃度來確定。例如，如果轉導期間的細胞濃度固定為 2.0 x 106 個細胞/ml，則 2.0 x 106 個轉導細胞可為 1.0 ml 轉導混合物的固定體積，或者 1.0 x 106 個轉導細胞可為 0.5 ml 轉導混合物的固定體積。
另一方面，本文描述的方法包括確定體積濃度，其在來自多個健康供體的擴增 T 細胞中產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞，例如，測量轉基因表達陽性的細胞百分比。
再一方面，該方法包括確定體積濃度，其在來自多個健康供體的擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數。
一方面，患者或個體是癌症患者。另一方面，本文所述的癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 組成的組。
本公開還提出了載體。一方面，「載體」能夠將基因序列轉移至靶細胞。通常，「載體構建體」、「表達載體」和「基因轉移載體」意指能夠指導目的基因表達並且可以將基因序列轉移至靶細胞的任何核酸構建體。因此，該術語包括克隆和表達載體以及整合載體。
已經基於各種逆轉錄病毒科成員設計了逆轉錄病毒載體，包括泡沫病毒、人免疫缺陷病毒 (HIV-1)、猴免疫缺陷病毒 (SIV)、牛免疫缺陷病毒、貓免疫缺陷病毒、馬傳染性貧血病毒 (EIAV)、小鼠白血病病毒 (MLV)、牛白血病病毒、勞斯肉瘤病毒 (RSV)、脾壞死病毒 (SNV) 和小鼠乳腺腫瘤病毒。常用平臺可包括泡沫病毒衍生的和 HIV-1 衍生的慢病毒載體以及 MLV 衍生的 γ 逆轉錄病毒載體。逆轉錄病毒的嗜性可透過摻入外來包膜蛋白來改變，從而擴展靶細胞的潛在靶標群。例如，摻入水泡性口炎病毒 G 糖蛋白 (VSV-G) 包膜蛋白可拓寬嗜性並允許基因在體外轉移到多種細胞（例如：CD34+ 幹細胞）以及在體內轉移到腦、肌肉和肝臟等。摻入桿狀病毒 GP64 和丙型肝炎 E1 和 E2 假型包膜蛋白可增強肝轉導，摻入 RD114 假型化包膜蛋白可能有利於在淋巴造血細胞中轉導。慢病毒載體可以轉導或感染非分裂細胞，通常產生高病毒滴度。慢病毒或 γ 逆轉錄病毒基因轉移系統的選擇取決於靶組織。這些載體可由順式作用長末端重複序列組成，該重複序列具有高達 6-10kb 外來序列的包裝能力。最小順式作用 LTR 足以用於複製和包裝載體，然後將其用於將治療基因整合到靶細胞中以提供永久性轉基因表達。
在某些實施方案中，載體是慢病毒載體。本文所使用的慢病毒載體是包含至少一種可衍生自慢病毒的組分部分的載體。慢病毒的詳細列表可參閱 Coffin et al. (1997) “Retroviruses” Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus pp 758-763) 一文。慢病毒載體產生的方法請參見，例如，美國專利第 5,994,136、6,165,782 和 6,428,953 號，各自內容透過引用整體併入。優選地，慢病毒載體是整合酶缺陷型慢病毒載體 (IDLV)。參見，例如，美國專利公開 2009/0117617，其內容透過引用整體併入。IDLV 可如所述方法產生，例如使用包含天然慢病毒整合酶基因中一個或多個突變的慢病毒載體，例如，如 Leavitt et al.(1996) J. Virol. 70(2):721-728、Philippe et al.(2006) Proc.Natl Acad.Sci USA 103(47):17684-17689 以及 WO 06/010834 所公開的，各自內容透過引用整體併入。在某些實施方案中，IDLV 是 HIV 慢病毒載體，其包含整合酶蛋白 (D64V) 第 64 位突變，如 Leavitt et al.(1996) J. Virol. 70(2):721-728 一文所公開的，其內容透過引用整體併入。
在基因治療應用中，可能需要以特定組織類型高度特異性遞送基因治療載體。因此，透過在病毒外表面上表達配體作為與病毒外殼蛋白的融合蛋白，可以修飾病毒載體以具有對給定細胞類型的特異性。選擇配體以對已知存在於目的細胞類型上的受體具有親和力。例如，Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)（其內容透過引用整體併入）一文報告了莫洛尼鼠白血病病毒可被修飾以表達與 gp70 融合的人調節蛋白，並且重組病毒可感染表達人表皮生長因子受體的某些人乳腺癌細胞。該原理可以擴展到其他病毒-靶細胞對，其中靶細胞表達受體，病毒表達包含細胞表面受體配體的融合蛋白。例如，可改造絲狀噬菌體以展示抗體片段（例如，FAB 或 Fv），其對幾乎任何選定的細胞受體均具有特異性結合親和力。儘管以上描述主要適用於病毒載體，但相同的原理可應用於非病毒載體。可以將此類載體改造為含有特異性攝取序列，從而有利於特定靶細胞的攝取。
基因治療載體可以透過給予個體患者進行體內遞送，通常透過全身給藥（例如，靜脈內、腹膜內、肌肉內、皮下或顱內輸注）或局部給藥遞送，如下所述。或者，可以將載體離體遞送至細胞，例如從個體患者（例如，淋巴細胞、骨髓抽吸物、組織活檢物）或通用供體造血幹細胞移出的細胞，然後將這些細胞重新植入患者體內，通常在選擇摻入載體的細胞後。
合適的細胞包括但不限於真核和原核細胞和/或細胞系。此類細胞或由此類細胞產生的細胞系的非限制性實例包括 COS、CHO（例如：CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV）、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293（例如：HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T）和 perC6 細胞以及諸如草地貪夜蛾 (Sf) 等昆蟲細胞或諸如酵母屬、畢赤酵母屬和裂殖酵母屬等真菌細胞。在某些實施方案中，細胞系是 CHO-K1、MDCK 或 HEK293 細胞系。另外，原代細胞可進行分離並在用核酸酶（例如 ZFN 或 TALEN）或核酸酶系統（例如 CRISPR/Cas）處理後離體使用以重新引入待治療的受試者。合適的原代細胞包括外周血單核細胞 (PBMC) 和其他血細胞亞群，例如但不限於 T 淋巴細胞，如 CD4+ T 細胞或 CD8+ T 細胞。合適的細胞還包括幹細胞，例如：胚胎幹細胞、誘導的多能幹細胞、造血幹細胞 (CD34+)、神經元幹細胞和間充質幹細胞。適於將轉基因導入免疫細胞（例如 T 細胞）的載體包括非整合型慢病毒載體。
在 T 細胞的常規製造中，要使用的病毒載體數量通常基於細胞系（如 293T）上測定的病毒批次滴度。使用該滴度，測試一系列感染複數 (MOI) 的病毒，當指涉用病毒顆粒接種一組細胞時，此為存在於定義空間中之病毒顆粒數量與靶細胞數量的比率。可選擇線性範圍內的最高感染複數 (MOI) 值作為最佳感染複數 (MOI)。但是，在用於測定滴度和滴度依賴性可變感染複數 (MOI) 時，該方法可允許由於使用腫瘤細胞系（例如 293T）而具有很大的變異空間。本公開的實施方案可包括用於確定製造中所使用最佳病毒體積和評估不同病毒載體批次效力的方法。例如，可不使用細胞系（例如 293 T 細胞），透過遵循相同的 T 細胞製造工藝以小規模（例如 24 孔 G-Rex (2 cm2) 每孔中 1-2 百萬個細胞）使用來自健康供體的原代人 T 細胞；中等規模 6 孔 G-Rex (10 cm2) 每孔中可能有 500 萬個細胞，或者大規模 G-Rex 100 (100 cm2) 中可能有 5000 萬個細胞。優良製造規範 (GMP) 規模可從 5-8 G-Rex100 中的 2.50-4 億個細胞開始。不同規模獲得的讀數可能與臨床製造直接相關。
因此，本公開的方法可能比使用細胞系衍生的滴度和感染複數 (MOI) 的常規方法更穩健，當製造相同 T 細胞產物需要多個慢病毒載體批次時可能減少變異。
「外源」分子是通常不存在於細胞中的分子，但可以透過一種或多種遺傳、生物化學或其他方法引入細胞中。「正常存在於細胞」根據細胞的特定發育階段和環境條件確定。因此，例如，僅在肌肉胚胎發育期間存在的分子是相對於成體肌細胞的外源分子。類似地，由熱休克誘導的分子是相對於非熱休克細胞的外源分子。外源分子可包括，例如，功能失常內源性分子的功能形式或功能正常內源性分子的功能失常形式。
外源分子可以是小分子（例如透過組合化學工藝產生），也可以是大分子，例如蛋白質、核酸、碳水化合物、脂質、糖蛋白、脂蛋白、多糖、任何經修飾的上述分子衍生物或包含一種或多種上述分子的任何複合體。核酸包括 DNA 和 RNA，可以為單鏈或雙鏈，可以為直鏈、支鏈或環狀，並且可以為任何長度。核酸包括能夠形成雙鏈體的核酸以及形成三鏈體的核酸。參見，例如，美國專利號 5,176,996 和 5,422,251。蛋白質包括但不限於 DNA 結合蛋白、轉錄因子、染色質重塑因子、甲基化 DNA 結合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙醯化酶、脫乙醯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重組酶、連接酶、拓撲異構酶、回旋酶和解旋酶。
外源分子可以是與內源分子相同類型的分子，例如外源蛋白質或核酸。例如，外源核酸可包含感染病毒基因組、引入細胞的質粒或附加體，或通常不存在於細胞中的染色體。將外源分子引入細胞的方法是本領域技術人員已知的，包括但不限於脂質介導的轉移（即脂質體，包括中性和陽離子脂質）、電穿孔、直接注射、細胞融合、粒子轟擊、磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉移以及病毒載體介導的轉移。
相反，「內源」分子是在特定環境條件下特定發育階段通常存在於特定細胞中的分子。例如，內源核酸可包含染色體、線粒體基因組、葉綠體或其他細胞器，或天然存在的游離核酸。其他內源分子可包括蛋白質，例如，轉錄因子和酶。
出於本公開的目的，「基因」包括編碼基因產物的 DNA 區域（參見下文）以及調節基因產物產生的所有 DNA 區域，無論此類調節序列是否與編碼和/或轉錄序列相鄰。因此，基因包括但不必限於啟動子序列、終止子、轉譯調控序列（如：核糖體結合位點和內部核糖體進入位點）、增強子、沉默子、絕緣子、邊界元件、複製起點、基質附著位點和基因座控制區域。
「基因表達」是指將包含於基因中的信息轉化為基因產物。基因產物可以是基因的直接轉錄產物（例如，mRNA、tRNA、rRNA、反義 RNA、核糖酵素、結構 RNA 或任何其他類型的 RNA）或透過 mRNA 轉譯產生的蛋白質。基因產物還包括透過諸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和編輯的工藝修飾的 RNA，以及透過例如甲基化、乙醯化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻醯化和糖基化修飾的蛋白質。
基因表達的「調節」是指基因活性的變化。表達的調節可包括但不限於基因激活和基因抑制。調節也能是完全調節，即，其中基因表達完全失活或被激活至野生型水平或更高水平；也可能是部分調節，其中基因表達部分減少或部分激活至一部分的野生型水平。
術語「核酸」、「多核苷酸」和「寡核苷酸」可互換使用，是指線性或環狀構象的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，並且是單鏈或雙鏈形式。出於本公開的目的，這些術語不應被理解為限制聚合物長度。這些術語可包括天然核苷酸的已知類似物，以及在鹼基、糖和/或磷酸酯部分（例如硫代磷酸酯骨架）中被修飾的核苷酸。通常，特定核苷酸的類似物具有相同的鹼基配對特異性；即，A 的類似物將與 T 鹼基配對。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」可互換使用，是指氨基酸殘基的聚合物。該術語也適用於氨基酸聚合物，其中一個或多個氨基酸是相應天然存在的氨基酸的化學類似物或修飾的衍生物。
術語「序列」是指任何長度的核苷酸序列，其可以為 DNA 或 RNA，可以為直鏈、環狀或支鏈，可以是單鏈或雙鏈。術語「供體序列」是指插入基因組的核苷酸序列。供體序列可以為任何長度，例如長度為 2 至 10,000 個核苷酸（或其間或其以上的任何整數值），優選長度為約 100 至 1,000 個核苷酸（或其間任何整數），長度更優選為約 200 至 500 個核苷酸。 實施例
實施例 1
批次
臨床前 (R&D)、工程化 (Eng Run) 和GMP (GMP Run) 批次可能是從 LENTIGEN 獲得的三批慢病毒載體。工程化批次可能類似於 GMP 批次（每批 32L，但 QC 和放行規範可能比 GMP 批次更嚴格）。臨床前批次（未顯示）可能是比 Eng Run 和 GMP Run 更小的載體批次製備 (4L)。例如，用於臨床前批次、工程化批次和 GMP 批次的滴度可能分別為 1.1x109 TU/ml、1.9x109 TU/ml 和 8.3 x109 TU/ml。
基於體積濃度不同批次之間轉導效率類似
用表達 R7P1D5 TCR (LV-R73) 的慢病毒載體轉導來自健康供體的 T 細胞可能透過用固定的抗 CD3/抗 CD28 抗體 (Invitrogen) 活化 T 細胞來進行，其中細胞在 TexMACS 培養基 (Miltenyi)、含 IL-7和IL-15 的 5% 人 AB 血清中培養以用於擴增，條件是細胞因子不是單獨的 IL-2，不是單獨的 IL-7，不是IL-2、IL-7 和 IL-15 的組合物，也不是 IL-2 和 IL-7 的組合物。該程序保留了早期 T 細胞分化表型（T 幼稚/scm：CD45RA+CCR7+ 或 CD45RA+CCR7+CD62L+ 或 CD45RO-CCR7+ 或 CD45RO-CCR7+CD62L+），並且轉導細胞顯示出與未轉導 T 細胞相當的增殖。也可能使用其他細胞因子，例如 IL-10、IL-12、IL-21、干擾素和 TGF-β。轉導的細胞還可能顯示 CD28+CD27+ 表型。
拷貝數
拷貝數是指來自 T 細胞產物的提取基因組 DNA 中的原病毒載體基因組定量，以及透過已知拷貝數的參照基因數量進行標準化。確定拷貝數的最常用方法是基於標準 TaqMan 平臺 (Applied Systems) 的定量實時 PCR (qPCR)。因此，拷貝數可指使用定量 PCR 從 T 細胞產物分離的基因組 DNA 中檢測到的整合載體序列平均數。基因組 DNA 可從 T 細胞中分離，並可使用對慢病毒載體和管家基因的特異性引物/探針測定法進行擴增。例如，拷貝數檢測 qPCR 測定法可用於定量相對於內源參照基因（白蛋白）的慢病毒整合基因組。T 細胞產物的有效性和安全性由平均拷貝數確定。較高的整合通常導致較高的轉基因表達，但也增加了插入誘變的風險。FDA 法規描述平均拷貝數為 5 或更低為細胞產物的安全規範。因此，拷貝數可視為是確定 LV 批次效力和臨床製造最佳體積濃度的關鍵參數。
轉導期間的細胞濃度固定於約 2 x 106 個細胞/ml。圖 1、3 和 5（實線）分別顯示了從 3 個健康供體（即供體 6、供體 7 和供體 9）獲得的原代 T 細胞，並用遞增體積濃度的慢病毒 (LV)-R73 進行轉導，在每 1.0 ml 轉導混合物（可含有約 2 x 106 個細胞）中以 LV-R73 的體積濃度（例如，以對數標度繪製的 3 倍連續稀釋）依賴方式下，表現出工程化批次 (Eng Run) 和 GMP 批次 (GMP Run) 之間整合 LV-R73 的拷貝數增加且具有可比性。
相反，圖 2、4 和 6（實線）分別顯示，從供體 6、供體 7 和供體 9 獲得的 Eng Run 和 GMP Run 之間之整合 LV-R73 拷貝數隨著增加感染複數 (MOI) 有顯著差異。
這些結果顯示，基於體積濃度，在兩個載體製造批次的LV-R73（工程化批次和 GMP 批次）之間獲得了相當的整合慢病毒載體拷貝數。
轉基因表達
轉基因表達是指使用特異性 HLA-dextramer 透過流式細胞術檢測 T 細胞表面上的轉基因 TCR。結果表示為總CD3+CD8+ 細胞的 Dextramer+ve 細胞百分比（Dex+ 的 %）。
測試 LV-R73 轉導的 T 細胞與 MHC HLA-A2-肽 dextramer 的結合。MHC Dextramer (Dex) 可能含有攜帶優化數量 MHC 和熒光染料分子的葡聚糖聚合物骨架。MHC Dextramer 試劑比傳統的 MHC 多聚體攜帶更多的 MHC 分子和更多的熒光染料。這增加了特定 T 細胞的親合力並增強了染色強度，從而提高了分辨率和信噪比。對於染色，遵循製造商提供的方案。在MACS Quant Analyzer (Miltenyi) 上獲得樣本，並透過 Flow Jo 軟件分析數據。
圖 1、3 和 5（虛線）分別顯示了從 3 個健康供體（即供體 6、供體 7 和供體 9）獲得的原代 T 細胞，並用 LV-R73 進行轉導，在每 1.0 ml 轉導混合物（可含有約 2 x 106 個細胞）中以 LV-R73 的體積濃度（例如，以對數標度繪製的 3 倍連續稀釋）依賴方式下，表現出大規模工程化批次 (Eng Run) 和 GMP 批次 (GMP Run) 之間轉基因（例如，R73 TCR）表達水平（Dex+ 的 %）增加且具有可比性。
但是，當基於病毒滴度確定的感染複數 (MOI) 值比較 Eng run 和 GMP Run 之間的 Dex+ 細胞百分比時，兩批（Eng Run 和 GMP run）顯著不同，如圖 2、4 和 6（虛線）所示。
這些結果表明，基於體積濃度，兩個載體製造批次的LV-R73（工程化批次和 GMP 批次）在源自健康供體的原代 T 細胞中產生相當的轉基因表達（CD3+CD8+ 細胞中 Dextramer+ve 的百分比）。
這些結果表明，在需要使用多個載體批次的高級別臨床試驗中比較不同載體批次的效力和確定臨床製造轉基因產物最佳載體體積時，體積方法可能比依賴於例如使用 HEK293 T 細胞確定病毒滴度的感染複數 (MOI) 方法更可靠。
T 細胞轉導的病毒體積濃度優化
在廣泛範圍比較之後（如圖 1-6 所示），選擇幾個體積濃度對從多個健康供體獲得的原代 T 細胞中進行進一步的篩選。使用選定的體積濃度（例如，5 μl、7.5 μl 和 10 μl）進行小、中和大規模 T 細胞製造。
轉導期間的細胞濃度固定在約 2 x 106 個細胞/ml。從 10 個健康供體獲得的原代 T 細胞用遞增病毒體積濃度的 LV-R73 進行轉導，例如，每 0.5 ml 轉導混合物中為 5 μl、7.5 μl 和 10 μl LV-R73（其中可含有約 1 x 106 個細胞）。如上所述，在轉導後第 8 天和第 10 天測定病毒載體（例如 LV-R73）的轉基因表達和整合拷貝數。
圖 7 顯示了來自 10 個供體（空心和實心方塊）的轉導 T 細胞中平均轉基因表達 (%Dex+) 呈體積濃度依賴性方式增加。也就是說，每 0.5 ml 轉導混合物中 5 μl LV-R73 產生最低平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞，且每 0.5 ml 轉導混合物中 10 μl LV-R73 產生最高平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞。另外，表達轉基因的轉導 T 細胞的平均數量在轉導後 8 天至轉導後 10 天在每個體積濃度下無顯著變化。
圖 8 顯示了來自 10 個供體（空心和實心方塊）的轉導 T 細胞中平均整合拷貝數（拷貝數）病毒載體（如：LV-R73）呈體積濃度依賴性方式增加。也就是說，每 0.5 ml 轉導混合物中 5 μl LV-R73 產生最低平均整合拷貝數的病毒載體，且每 0.5 ml 轉導混合物中 10 μl LV-R73 產生最高平均整合拷貝數的病毒載體。但是，在每個體積濃度下的平均整合拷貝數從轉導後 8 天至轉導後 10 天均降低。這些結果表明，儘管平均整合拷貝數在轉導後 10 天降低，但表達轉基因的轉導 T 細胞的平均數量仍然與轉導後 8 天的平均數量相當。
這些結果顯示，在不同供體和規模中始終顯示最大 HLA-Multimer+ve 細胞百分比且不超過 5 個拷貝數的病毒體積濃度可選擇作為臨床製造的最佳病毒體積濃度。
圖 9 顯示了根據本公開內容一個實施方案轉導用於免疫療法之 T 細胞的方法 (90)，包括從多個健康供體獲得 T 細胞 (91)、用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活 T 細胞 (92)、用多種體積濃度的病毒載體轉導激活 T 細胞 (93)、擴增轉導 T 細胞 (94)（例如 4-6 天）、測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數 (95)、確定產生最大平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞和/或來自多個健康供體的每個擴增 T 細胞中最大平均拷貝數的整合轉基因的體積濃度 (96)、以及以確定的體積濃度用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞用於免疫治療 (97)。
本公開的優點可能包括能夠使用與製造 T 細胞產物中所用的相同工藝準確定義在 T 細胞產物生產過程中所用慢病毒載體數量的方法。因為病毒滴度和體積濃度之間沒有關係，所以體積濃度方法優於依賴於病毒滴度的感染複數 (MOI) 方法。因此，本公開的方法可能比使用細胞系衍生的病毒滴度以獲得最佳感染複數 (MOI) 的常規方法更穩健，當製造相同的 T 細胞產物需要多個慢病毒載體批次時可以減少變異。
本專利說明書中引用的所有參考文獻均透過引用併入本文，如同每篇參考文獻被具體和單獨地指出透過引用併入。任何參考文獻的引用均為其在申請日之前的公開內容，不應解釋為認可本公開內容無權憑藉之前的發明而先於此類參考文獻。
90‧‧‧方法
91～97‧‧‧步驟
圖 1 顯示了當基於體積濃度比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 6 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體（慢病毒 (LV)-R73）拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（MHC Dextramer (Dex)+ 的 %）相似。
圖 2 顯示了當基於感染複數 (MOI) 比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 6 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（Dex+ 的 %）不同。
圖 3 顯示了當基於體積濃度比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 7 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（Dex+ 的 %）相似。
圖 4 顯示了當基於感染複數 (MOI) 比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 7 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（Dex+ 的 %）不同。
圖 5 顯示了當基於體積濃度比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 9 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（Dex+ 的 %）相似。
圖 6 顯示了當基於感染複數 (MOI) 比對時工程化 (Eng Run) 和 GMP (GMP Run) 批次中從 9 號健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 拷貝數（實線）和表達轉基因 (R7P1D5 TCR)（虛線）的 T 細胞數量（Dex+ 的 %）不同。
圖 7 顯示了在用三種選定體積濃度病毒載體轉導的 10 個健康供體獲得的 T 細胞中表達轉基因 (R7P1D5 TCR) 的 T 細胞數量（CD3+CD8+ 細胞的 %Dex+），以選擇最佳病毒體積。
圖 8 顯示了在用三種選定體積濃度病毒載體轉導的 10 個健康供體獲得的 T 細胞中整合病毒載體 (LV-R73) 的拷貝數，以選擇最佳病毒體積。
圖 9 顯示了根據本公開一個實施方案所述的方法。
國內寄存資訊 (請依寄存機構、日期、號碼順序註記) 無
國外寄存資訊 (請依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 無

Claims (39)

  1. 一種轉導用於免疫治療之 T 細胞的方法，包括 (a) 從至少一個個體中獲得 T 細胞， (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活 T 細胞， 用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞， (c) 擴增轉導的 T 細胞， (d) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數， (e) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或在來自至少一個個體的每個擴增 T 細胞中不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (f) 以確定的體積濃度用病毒載體轉導來自至少一個個體的 T 細胞以用於免疫治療。
  2. 請求項 1 所述的方法，其中病毒載體是表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體。
  3. 請求項 1 或 2 所述的方法，其中病毒載體是表達 TCR 的慢病毒載體。
  4. 請求項 1-3 任一項中所述的方法，其中多個體積濃度選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 1.0 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 2.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、和每 5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml 組成的群。
  5. 請求項 4 所述的方法，其中轉導混合物包含細胞濃度為約 0.1 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 0.5 x 106 個細胞/ml至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 1.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 5.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 1.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml 或約 5.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml。
  6. 請求項 1-5 中任一項所述的方法，其中所述 T 細胞獲自多個健康個體。
  7. 請求項 1-6 中任一項所述的方法，包括擴增轉導的 T 細胞。
  8. 請求項 1-7 中任一項所述的方法，其中確定在來自至少一個個體的擴增 T 細胞中產生最大平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞的體積濃度。
  9. 請求項 1-8 中任一項所述的方法，其中確定在來自至少一個個體的擴增 T 細胞中產生最大平均拷貝數的整合轉基因的體積濃度。
  10. 請求項 1-9 中任一項所述的方法，其中確定的體積濃度為選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 1 μl 至約 50 µl、每 0.5 ml 轉導混合物含約 5 μl 至約 15 µl、和每 0.5 ml 轉導混合物含約 8 μl 至約 12 μl 組成的組。
  11. 請求項 1-10 中任一項所述的方法，其中待治療的個體是癌症患者。
  12. 請求項 11 所述的方法，其中所述癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 組成的組。
  13. 請求項 1-12 中任一項所述的方法，其中從所述至少一個供體、患者或個體獲得的 T 細胞是 CD8+ T 細胞。
  14. 一種治療患者的方法，包括給予患者以體積濃度病毒載體轉導的 T 細胞， 其中 T 細胞從患者身上獲得， 其中體積濃度由以下確定 (a) 從多個健康供體獲得 T 細胞， (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活步驟 (a) 中獲得的 T 細胞，用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞， (c) 擴增步驟 (b) 中獲得的轉導 T 細胞， (d) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或在步驟 (c) 中獲得的每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數， (e) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或步驟 (d) 中測量的不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (f) 以步驟 (e) 所確定的體積濃度用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞。
  15. 請求項 14 所述的方法，其中病毒載體是表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體。
  16. 請求項 14 或 15 所述的方法，其中病毒載體是表達 TCR 的慢病毒載體。
  17. 請求項 14-16 任一項中所述的方法，其中多個體積濃度選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 1.0 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 2.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、和每 5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml 組成的群。
  18. 請求項 17 所述的方法，其中轉導混合物包含細胞濃度為約 0.1 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 0.5 x 106 個細胞/ml至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 1.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 5.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 1.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml 或約 5.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml。
  19. 請求項 14-18 中任一項所述的方法，其中確定在來自多個供體的擴增 T 細胞中產生最大平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞的體積濃度。
  20. 請求項 14-19 中任一項所述的方法，其中確定在來自多個供體的擴增 T 細胞中產生最大平均拷貝數的整合轉基因的體積濃度。
  21. 請求項 15-20 中任一項所述的方法，其中確定的體積濃度為選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 1 μl 至約 50 µl、每 0.5 ml 轉導混合物含約 5 μl 至約 15 µl、和每 0.5 ml 轉導混合物含約 8 μl 至約 12 μl 組成的組。
  22. 請求項 14-21 中任一項所述的方法，其中患者患有癌症。
  23. 請求項 22 所述的方法，其中所述癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 組成的組。
  24. 請求項 14-23 中任一項所述的方法，其中從多個健康供體和患者獲得的 T 細胞是 CD8+ T 細胞。
  25. 一種以體積濃度病毒載體轉導的用於免疫治療之 T 細胞， 其中 T 細胞從患者身上獲得， 其中體積濃度由以下確定 (a) 從多個健康供體獲得 T 細胞， (b) 用抗 CD3 抗體和抗 CD28 抗體激活步驟 (a) 中獲得的 T 細胞，用多個體積濃度的病毒載體轉導活化的 T 細胞， (c) 擴增步驟 (b) 中獲得的轉導 T 細胞， (d) 測量在多個體積濃度下表達轉基因的擴增 T 細胞的數量和/或步驟 (c) 中獲得的每個擴增 T 細胞中整合轉基因的拷貝數， (e) 確定體積濃度，其產生最大平均數量的表達轉基因的擴增 T 細胞和/或步驟 (d) 中測量的不超過五個拷貝的整合轉基因之最大平均拷貝數的整合轉基因，以及 (f) 以步驟 (e) 所確定的體積濃度用病毒載體轉導從患者中獲得的 T 細胞。
  26. 請求項 25 所述的 T 細胞，其中病毒載體是表達 T 細胞受體 (TCR) 的逆轉錄病毒載體。
  27. 請求項 25 或 26 所述的 T 細胞，其中病毒載體是表達 TCR 的慢病毒載體。
  28. 請求項 25-27 任一項中所述的 T 細胞，其中多個體積濃度選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 1.0 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、每 2.5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml、和每 5 ml 轉導混合物含約 0.01 μl 至約 1 ml 組成的群。
  29. 請求項 28 所述的方法，其中轉導混合物包含細胞濃度為約 0.1 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 0.5 x 106 個細胞/ml至約 1.0 x 106 個細胞/ml、約 1.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 5.0 x 106 個細胞/ml 至約 1.0 x 107 個細胞/ml、約 1.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml 或約 5.0 x 107 個細胞/ml 至約 1.0 x 108 個細胞/ml。
  30. 請求項 25-29 中任一項所述的 T 細胞，其中確定包括確定在來自多個健康供體的擴增 T 細胞中產生最大平均數量的表達轉基因的轉導 T 細胞的體積濃度。
  31. 請求項 25-29 中任一項所述的 T 細胞，其中確定包括確定在來自多個健康供體的擴增 T 細胞中產生最大平均拷貝數的整合轉基因的體積濃度。
  32. 請求項 25-31 中任一項所述的 T 細胞，其中確定的體積濃度為選自由每 0.5 ml 轉導混合物含約 1 μl 至約 50 µl、每 0.5 ml 轉導混合物含約 5 μl 至約 15 µl、和每 0.5 ml 轉導混合物含約 8 μl 至約 12 μl 組成的組。
  33. 請求項 25-32 中任一項所述的 T 細胞，其中患者患有癌症。
  34. 請求項 33 所述的 T 細胞，其中所述癌症選自由肝細胞癌 (HCC)、結直腸癌 (CRC)、膠質母細胞瘤 (GB)、胃癌 (GC)、食道癌、非小細胞肺癌 (NSCLC)、胰腺癌 (PC)、腎細胞癌 (RCC)、良性攝護腺增生 (BPH)、攝護腺癌 (PCA)、卵巢癌 (OC)、黑色素瘤、乳腺癌、慢性淋巴細胞白血病 (CLL)、梅克爾細胞癌 (MCC)、小細胞肺癌 (SCLC)、非霍奇金淋巴瘤 (NHL)、急性骨髓性白血病 (AML)、膽囊癌和膽管癌（GBC、CCC）、膀胱癌 (UBC)、急性淋巴母細胞白血病 (ALL) 和子宮癌 (UEC) 組成的組。
  35. 一種透過請求項 1-13 中任一項所述的方法產生的 T 細胞群。
  36. 一種透過請求項 14-24 中任一項所述的方法產生的 T 細胞群。
  37. 請求項 25 所述的 T 細胞，其中所述擴增在 IL-7、IL-10、IL-12、IL-15 和 IL-21存在下進行，條件是所述活化不在單獨的 IL-2、單獨的 IL-7、IL-2、IL-7 和 IL-15 的組合或 IL-2 和 IL-7 的組合的存在下進行。
  38. 請求項 37 所述的 T 細胞，其中轉導的 T 細胞表現出 CD45RA+CCR7+ 或 CD45RA+CCR7+CD62L+ 或 CD45RO-CCR7+ 或 CD45RO-CCR7+CD62L+ 的表型。
  39. 請求項 37 所述的 T 細胞，其中轉導的 T 細胞表現出 CD28+CD27+ 的表型。
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