TW202242122A - 慢病毒包裝系統以及使用其以提高宿主細胞之慢病毒產量的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種慢病毒包裝系統，其包含：一轉移質體，其包含一TAR嵌合 5’ LTR的核苷酸序列；至少一包裝質體，包含：一編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、一 rev基因的核苷酸序列、一 gag基因的核苷酸序列及一 pol基因的核苷酸序列；及一包膜質體。本發明因包含上開質體而可表現TAR RNA結合蛋白之基因，使所生產之慢病毒有較高之病毒效價，且將所生產之慢病毒用於細胞轉導時亦能提升轉導率及基因傳遞效率。本發明另提供一種提高宿主細胞之慢病毒產量的方法，其包含使用前述之慢病毒包裝系統轉染所述宿主細胞，並能進一步降低製造基因改造細胞之成本。

Description

慢病毒包裝系統以及使用其以提高宿主細胞之慢病毒產量的方法
本發明是關於一種慢病毒包裝系統，尤指一種包含編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列之質體及包含一TAR嵌合 5’ LTR的核苷酸序列之質體的慢病毒包裝系統。
慢病毒(lentivirus)為一種反轉錄病毒，被廣泛用於傳遞標的基因至難以轉染(hard-to-transfect)的細胞，例如：初代T細胞。有別於其他的反轉錄病毒，慢病毒可被轉導至分裂(dividing)及未分裂(non-dividing)的細胞。且若與VSV-G蛋白合併使用，則可感染不同來源的細胞。此外慢病毒的RNA基因體容量約為10 Kb，因而可用於傳遞較大或較複雜的基因序列。由於慢病毒具有這些優點，而被廣泛應用於臨床治療。
慢病毒之製備，通常是將含有標的基因的轉移質體及包含慢病毒包裝所需之病毒基因的其他質體共同轉染至293T細胞。在質體轉染後，包含標的基因之序列的慢病毒顆粒會被釋放至培養基中。接著，收取培養基、並進一步濃縮、配製成待使用濃度儲存於-80°C。
慢病毒包裝系統在過去數十年持續發展，最初的第一代慢病毒包裝系統包含三個質體，分別為轉移質體、包膜質體、及一包含必要的HIV-1病毒基因( gag、 pol、 tat及 rev)及一些附屬基因( vif、 vpu、 vpr及 nef)之質體。其中病毒之 gag基因編碼有許多病毒殼體蛋白； pol基因編碼有用於病毒包裝及感染的反轉錄酶、嵌合酶(integrase)及蛋白酶。而由於前述之四個附屬基因對於病毒包裝或是感染標的細胞並不是必須的，因此第二代慢病毒包裝系統即將前述之四個附屬基因移除。在第一代及第二代的病毒包裝系統中，轉移質體上包含標的基因之病毒基因體的轉錄是由作為啟動子的5’ LTR (long terminal repeat)及TAT蛋白所驅動，其中，TAT蛋白是一種轉錄活化調控蛋白(trans-activating regulatory protein)，其可結合到LTR中的TAR (trans-activation response)序列。
而在第三代慢病毒包裝系統，為了進一步增加慢病毒的安全性，尤其是為了避免慢病毒複製能力的發展，而將包圍(flank)在標的基因兩端的LTR進行修飾、並將 rev基因移到第四個質體上，進一步降低基因重組的機會。而經修飾的LTR不再具有啟動子的活性，轉移質體上的病毒基因體序列之轉錄改由加在經修飾之5’ LTR前的勞氏肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter，RSV promoter)或巨細胞病毒啟動子(cytomegalovirus promoter，CMV promoter)所驅動。在此情況下， tat基因是沒有用處的，所以在第三代慢病毒包裝系統中被移除了，透過減少基因來增加慢病毒包裝系統的感染效率。
然而，與第二代慢病毒包裝系統相比，第三代慢病毒包裝系統雖然提高了安全性，卻犧牲了慢病毒的產量。因此亟需一種能提高製造病毒效率的慢病毒包裝系統。
為了克服現有技術之缺點，本發明之目的在於不損及安全的情況下增加慢病毒包裝系統所生產之慢病毒產量。
為達上述發明目的，本發明提供一種慢病毒包裝系統(packaging system)，其包含：一轉移 (transfer)質體，其包含TAR嵌合 5’ LTR(trans-activation response element-reserved chimeric 5’ long terminal repeat)的核苷酸序列；至少一包裝 (packaging)質體，包含一編碼TAR RNA結合蛋白(TAR RNA binding protein)之基因的核苷酸序列、一 rev基因的核苷酸序列、一 gag基因的核苷酸序列及一 pol基因的核苷酸序列；及一包膜 (envelope)質體。
本發明藉由於第三代慢病毒包裝系統中加入一包含編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列的質體，而能提升所生產之慢病毒之產量及病毒效價，特別是病毒之功能效價(functional titer)，且亦能提升所產出之慢病毒於轉導時之基因傳遞效能。
較佳的，所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列為 tat基因的核苷酸序列。
較佳的，所述 tat基因的核苷酸序列係包含如SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列。其為所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的至少一部分，且因為SEQ ID NO：1所示之核苷酸序列不含內含子，與第二代慢病毒包裝系統常用之 tat基因的核苷酸序列不同，而能具有較小的質體尺寸。
較佳的，所述TAR嵌合 5’ LTR的核苷酸序列中之TAR之核苷酸序列係包含如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。
較佳的，所述TAR嵌合 5’ LTR的核苷酸序列，其5’ LTR的U3被破壞，並改以CMV或RSV啟動子驅動。以使病毒不足以複製下去，提高安全性，而此TAR嵌合 5’ LTR核苷酸序列係與第三代慢病毒包裝系統相同。在本發明的一實施態樣中，是以RSV啟動子驅動。
較佳的，所述至少一包裝質體的數量等於所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的數量，例如：當所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的數量為各一，共四個時，質體的數量亦為四個，亦即所述至少一包裝質體係為第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及第四包裝質體，且所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、所述第二包裝質體包含 rev基因的核苷酸序列、所述第三包裝質體包含 gag基因的核苷酸序列及所述的四包裝質體包含 pol基因的核苷酸序列。較佳的，所述各個包裝質體具有各一序列。
較佳的，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體及一第二包裝質體，且所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列之其中一者，而所述第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的其餘者。例如：第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列，而第二包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列。又或是第一包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列，第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列。
較佳的，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體及一第二包裝質體，且所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列之其中二者，而所述第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的其餘者。且第一包裝質體與第二包裝質體包含的核苷酸序列各自不同。例如：所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列及 rev基因的核苷酸序列；而所述第二包裝質體包含所述 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列。或是所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列及所述 gag基因的核苷酸序列；而所述第二包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列。或是所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列及所述 pol基因的核苷酸序列；而所述第二包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列及 gag基因的核苷酸序列。
較佳的，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體、一第二包裝質體及一第三包裝質體，且所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列之其中二者，而所述第二包裝質體及所述第三包裝質體分別包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的其餘任一者。且第一包裝質體、第二包裝質體與第三包裝質體包含的核苷酸序列各自不同。在一實施態樣下，所述第一包裝質體包含所述 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列；而所述第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列；而所述第三包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列。在此實施態樣下，不僅不會因為共轉染時的質體數量增加而導致慢病毒產量下降，卻能使所生產之慢病毒產量較質體數量較少的第三代慢病毒包裝系統所生產之慢病毒高。
較佳的，所述轉移質體與第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及包膜質體之重量比為3至12：3至7：1至4：1至4：1至6，更佳的，所述轉移質體與第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及包膜質體之重量比為5至11：4至7：2至3：1至2：2至4。在此比例下，可產生較多之慢病毒。更佳的，所述轉移質體與第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及包膜質體之重量比為5：5：2：2：4。在此比例下，可產生較多之慢病毒。再更佳的，所述轉移質體與第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及包膜質體之重量比為10：6：3：1：3。在此比例下，可產生較多之慢病毒。
較佳的，所述包膜質體包含編碼水泡性口炎病毒醣蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G)的基因的核苷酸序列或狒狒內源性病毒包膜 (baboon endogenous virus envelope)的基因的核苷酸序列，而有助於包膜的形成及增加所製得之病毒感染力與可感染之細胞種類。
較佳的，所述慢病毒包裝系統進一步包含至少一或多個質體包含 vpu基因的核苷酸序列、 nef基因的核苷酸序列、 vif基因的核苷酸序列、 vpr基因的核苷酸序列。
較佳的，所述轉移質體可進一步包含欲傳遞之標的基因。
較佳的，所述欲傳遞之標的基因為包含編碼抗CD19受體的核苷酸序列，所述抗CD19受體為專一性結合CD19抗原之受體。
依據本發明，所述包含抗CD19受體係如 Porter, David L., et al."Chimeric antigen receptor–modified T cells in chronic lymphoid leukemia." N engl j Med 365 (2011): 725-733中之抗CD19受體-BBz的核苷酸，而BBz即為共同刺激(co-stimulatory)4-1BB和細胞內域(endodomain)的CD3ζ。而可進一步用於製備用於治療癌症的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor，CAR)細胞。在本發明之一實施態樣中，包含編碼抗CD19受體的核苷酸序列是使用編碼抗CD19受體-BBz的核苷酸序列，即抗CD19受體-BBz(後簡稱為CD19-BBz)的核苷酸序列。
本發明另外提供一種慢病毒，其係由前述之慢病毒包裝系統製備而得。所述製得的慢病毒與第三代慢病毒包裝系統相比多了TAT蛋白於病毒顆粒中，且經測試後與第三代慢病毒包裝系統相比具有更高的轉導效率。
本發明另外提供一種經分離的細胞，其係經由如前述之慢病毒將基因轉導至有核細胞而得。較佳的，所述有核細胞包含經分離的T細胞、自然殺手細胞、自然殺手T細胞、或脂肪幹細胞，因此所述經分離的細胞可進一步用於製備用於治療癌症的嵌合抗原受體細胞，意即，本發明另提供一種前述之經分離的細胞的用途，其是用於製備治療癌症的藥物。本發明另外提供一種提高宿主細胞之慢病毒產量之方法，其包含使用前述之慢病毒包裝系統轉染所述宿主細胞。
較佳的，所述宿主細胞包含哺乳類動物細胞。
較佳的，所述哺乳類動物細胞包含人胚胎腎細胞(HEK293)或293T細胞(HEK293T)，其中293T細胞為HEK 293再轉殖SV40病毒的T-抗原基因後的細胞。
在一實施態樣中，所述宿主細胞為293T細胞。
在一實施態樣中，所述宿主細胞為 pkr基因剔除之293T細胞。本發明之慢病毒包裝系統以 pkr基因剔除之293T細胞進行慢病毒生產，能確實提升所生產的慢病毒之病毒效價。
本發明的慢病毒包裝系統可以提升所生產之慢病毒的病毒效價，用於T細胞轉導時，亦能提升轉導率及基因傳遞效率。因此，可避免因病毒效價過低導致轉導體積增加及轉導效率降低而影響T細胞品質的問題。且因病毒效價高，轉導時所需的慢病毒體積較低，因此能降低所生產的慢病毒於基因傳遞應用(如用於製造治療癌症的嵌合抗原受體細胞(CAR-T))的成本。
以下配合圖式及本發明的製備例與實驗例，進一步闡述本發明為達成預定發明目的所採取的技術手段。
製備例1：構築含有編碼TAR RNA結合蛋白之基因之包裝質體
首先，將pAll-Cas9-B2M_1-DP質體(將B2M gRNA DNA片段接入經BsmBI酶切之購自中研院RNAi Core，產品編號C6-8-67之pAll-Cas9.Ppuro質體而得pAll-Cas9-B2M質體，再以PCR擴增及SacII酶切的方式將anti-puromycin gene expression cassette刪除而得)經PspXI/AgeI酶切後之包含CMV啟動子的DNA片段連接至經XmaI/SalI酶切線狀化的yTA-empty(將部分WPRE片段從pAll-Cas9.Ppuro質體中以PCR方式擴增並以TA cloning方式接入購自益生公司的 yTA 載體(T&A TMCloning Kit，FYC001-20P，YEASTERN BIOTECH)所得之yTA-WPRE_P再使用SacII酶切yTA-WPRE_P質體移除位於兩個SacII切點間的序列後所得)載體(其上具有習知的表達載體基本元件：Ampr、Ampr promoter及ori)以製得yTA-CMV質體。而本製備例中使用之編碼TAR RNA結合蛋白的基因為不含內含子的 tat基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示則是經由pCMVdeltaR8.91質體(購自中研院RNAi Core)擴增後，經NheI/BsrGI酶切，並插入經NheI/BsrGI 酶切線狀化的 yTA-CMV 質體，獲得如圖1所示之yTA-CMV- tat表現質體，具有3749鹼基對。
製備例2：構築含有CD19-BBz之轉移質體
將包含TAR嵌合5’ LTR的核苷酸序列且以RSV啟動子驅動之pLAS5w.Ppuro質體(購自中研院RNAi Core，商品編號C6-8-39)，去除hPGK 啟動子及PAC基因(委託GenScript執行)而得pLAS5w質體，接著將編碼有CD19-BBz的核苷酸序列從Lenti-EF1a-CD19 plasmid (委託Creative Biolabs製造)以BstBI和NheI酶切接入前述pLAS5w質體，其中，TAR嵌合5’ LTR中所含TAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
實驗例1：製備慢病毒
將293T細胞以每毫升(mL)1.5x10 7細胞之密度種於T875培養瓶(大規模)、以每毫升1x10 6細胞之密度種於10公分培養皿(小規模)以含有10%胎牛血清的DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium，11965-092，Gibco)培養基於37°C、5%二氧化碳下培養三天後，使用轉染試劑PolyJet (SignaGen Laboratories)，依據操作手冊的方式將表1中第二代慢病毒包裝系統(比較例1) 、第三代慢病毒包裝系統(比較例2) 及本發明之慢病毒包裝系統(包含實施例1及實施例2，兩實施例之差異僅為各包裝質體之比例不相同)質體組合物於含有10%胎牛血清的DMEM培養基共轉染至293T細胞，以在小規模(10公分培養皿)或大規模(T875 培養瓶)下分別製備具有欲傳遞之標的基因CD19-BBz之慢病毒(本發明之慢病毒包裝系統的實施例2僅於小規模製備慢病毒)，其中，比較例1之第二代慢病毒包裝系統(購自中研院)及比較例2之第三代慢病毒包裝系統(購自Aldevron)為習知技術。次日，以Opti-MEM(51985-034，Gibco)取代原含有10%胎牛血清的DMEM培養基，24小時後收取第一次包含慢病毒顆粒的上層液，再加入Opti-MEM培養基培養24小時再收取第二次包含慢病毒顆粒的上層液完成所有的收取程序後，將所有包含慢病毒顆粒的上層液混合在一起，並利用Lenti-X 濃縮試劑 (Takara Bio)進行濃縮100倍，即將含有慢病毒顆粒的上層液體體積縮小至原本的1/100，得到100倍濃縮慢病毒。
表1、用於慢病毒製備的包裝系統之質體組成
包裝 系統 質體 10公分培養皿 (小規模) T875 培養瓶 (大規模)
添加量 (μg) 總量 (μg) 添加量 (μg) 添加量 (μg)
第二代慢病毒包裝系統(比較例1) 如製備例2所述之包含有CD19-BBz的轉移質體(以RSV啟動子驅動，且如圖2A所示，圖上之LTR分為U3、R及U5三個區域。其中，R區域嵌合有TAR(即內含TAR序列)，而∆U3指受破壞的U3區域) 2.5 5 N/A N/A
pCMV deltaR8.91 (購自中研院) 2.25 N/A N/A
pMD.G(購自中研院) 0.25 N/A N/A
第三代慢病毒包裝系統(比較例2) 如製備例2所述之包含有CD19-BBz的轉移質體(以RSV啟動子驅動，且如圖2A所示，圖上之LTR分為U3、R及U5三個區域。其中，R區域嵌合有TAR(即內含TAR序列)，而∆U3指受破壞的U3區域) 2.5 8 50 160
包含gag 基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列之質體(以CMV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 2.5 50
包含rev基因的核苷酸序列之質體(以OG-RSV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 1 20
包含編碼VSV-G的基因的核苷酸序列之包膜質體(以PGK/CMV Fusion啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 2 40
實施例1-本發明之慢病毒包裝系統(圖2B所示) 如製備例2所述之包含有CD19-BBz的轉移質體(以RSV啟動子驅動，且如圖2A所示，圖上之LTR分為U3、R及U5三個區域。其中，R區域嵌合有TAR(即內含TAR序列)，而∆U3指受破壞的U3區域) 2.5 9 50 180
包含gag 基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列之質體(以CMV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 2.5 50
包含rev基因的核苷酸序列之質體(以OG-RSV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 1 20
包含編碼VSV-G的基因的核苷酸序列之包膜質體(以PGK/CMV Fusion啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 2 40
製備例1之yTA-CMV-tat質體(以CMV啟動子驅動) 1 20
實施例2-之本發明慢病毒包裝系統 如製備例2所述之包含有CD19-BBz的轉移質體(以RSV啟動子驅動，且如圖2A所示，圖上之LTR分為U3、R及U5三個區域。其中，R區域嵌合有TAR(即內含TAR序列)，而∆U3指受破壞的U3區域) 4 9.2 N/A N/A
包含gag 基因的核苷酸序列及pol基因的核苷酸序列之質體(以CMV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 2.4 N/A N/A
包含rev基因的核苷酸序列之質體(以OG-RSV啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 1.2 N/A N/A
包含編碼VSV-G的基因的核苷酸序列之包膜質體(以PGK/CMV 融合(Fusion)啟動子驅動) (購自Aldevron，pALD-Lenti (Ampicillin版本) 0.4 N/A N/A
製備例1之yTA-CMV-tat質體(以CMV啟動子驅動) 1.2 N/A N/A
將實驗例1製備之慢病毒經過病毒效價的測試，具體而言，病毒效價是以3倍序列稀釋(3倍至6561倍)之實驗例1中各慢病毒樣品轉導(transducing)至Jurkat細胞進行測定。首先，將50 μL的慢病毒樣品加入100 μL的X-Vivo15培養基，並進行3倍序列稀釋，重複此稀釋步驟直到稀釋6561倍，得出多組經序列稀釋的慢病毒樣品。接著，每組經序列稀釋之慢病毒樣品各取50 μL加入96孔盤(U底)之培養有4×10 4/100 μL/盤孔 Jurkat細胞的含有10%胎牛血清之RPMI 1640 (11875-085，Gibco)培養基中(為第0天)，接著於第2天時，在每一孔加入100μL新鮮的含有10%胎牛血清之RPMI 1640培養基。於培養箱再培養24小時後，使用為biotin-conjugated goat anti-mouse IgG F(ab)2 fragment (JacksonImmunoResearch)及Streptavidin-PE (Invitrogen) 之抗體檢測CD19-BBz、利用流式細胞儀分析目標蛋白的表現量測得病毒的轉導效力。並以以下算式計算病毒有效效價： 病毒效價 (TU/ml) =(% 表現有CD19-BBz之細胞/100) ×4×10 4×20×稀釋倍數
其中，使用稀釋倍數為729倍的實施例2之本發明慢病毒包裝系統所製得的慢病毒樣品時，表現有CD19-BBz之細胞的表現比率為16.09%，而得出病毒效價為9.38×10 7轉導單位(transducing unit，TU)/ml，而稀釋倍數的選擇是選用第一個表現百分比低於20%的稀釋倍數，以此稀釋倍數樣本的數值來計算效價。且實施例2製備之慢病毒樣品之病毒效價優於實施例1製備之慢病毒樣品。此外，如圖3所示，利用實施例1之本發明慢病毒包裝系統生產的CD19-BBz慢病毒，其病毒效價不論是在大規模下或小規模下皆顯著優於利用第三代慢病毒包裝系統生產的慢病毒效價，在小規模情況下約為第三代慢病毒包裝系統(比較例2)生產的慢病毒效價之3.48倍，在大規模情況下則約大於第三代慢病毒包裝系統(比較例2)生產的慢病毒效價之4.16倍。並進一步將病毒效價乘上病毒體積以得到病毒產量，因各實施例、比較例之最終生產得到的病毒體積相同，所以產量或是病毒效價增加的幅度是一樣的。亦即，在小規模的情況下，利用實施例1的本發明之慢病毒包裝系統生產的CD19-BBz慢病毒的產量為利用第三代的慢病毒包裝系統(比較例2)產量的3.48倍；大規模的情況下，利用實施例1的本發明之慢病毒包裝系統實施例1的CD19-BBz慢病毒的產量亦為第三代的慢病毒包裝系統(比較例2)的4.16倍，顯著優於利用第三代的慢病毒包裝系統(比較例2)的慢病毒產量。因此，利用本發明之慢病毒包裝系統的慢病毒產量不論是在大規模或小規模的情況下，因同時表現TAT蛋白，確實有助於生產慢病毒的產量，皆明顯優於利用第三代的慢病毒包裝系統(比較例2)。
製備例3：製備 pkr基因剔除之293T細胞
黏合兩部分互補的引子以製備24鹼基對的PKR 引導RNA (guide RNA；gRNA)，並連接至經BsmBI酶切線狀化的Cas9-T2A-eGFP-DP質體，以獲得Cas9-PKR-T2A-eGFP-DP質體後。利用標靶 pkr基因序列的gRNA (gRNA targeting pkrgenomic sequence)：GCAACCUACCUCCUAUCAUG (SEQ ID NO：3)與蛋白激酶R [Protein kinase R； pkr，又名真核轉譯起始因子2 (Eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2；eIF2AK2)]基因之結合以Cas 9基因編輯、DNA雙股裁切技術製備 pkr基因剔除之293T細胞。具體而言，將前述含有gRNA的Cas9-PKR-T2A-eGFP-DP質體利用磷酸鈣法轉染至293T細胞，並將轉染後之293T細胞於96孔盤中稀釋至0.5細胞/孔後，以西方墨點法進行確認。其中，西方墨點法是將293T細胞以RIPA 裂解緩衝液 (RIPA lysis buffer)裂解，以蒐集細胞裂解液。接著分析細胞裂解液之總蛋白質，利用rabbit anti-PKR 多株抗體(GTX132826, GeneTex)偵測PKR蛋白之表現，並以管家基因GAPDH作為內部對照組，並挑選96孔盤中的293T細胞株：#1、#4、#12、#17、#20、#23、#26的基因編輯結果顯示於圖4中，可看出#12之293T細胞株有成功剔除 pkr基因，將用於實驗例2製備慢病毒。
實驗例2：以 pkr基因剔除之293T細胞製備慢病毒
實驗例2之方法類似於實驗例1，不同之處在於本實驗例是將第三代慢病毒包裝系統(比較例2)及實施例1之本發明慢病毒包裝系統質體組合物以轉染試劑PolyJet (SignaGen Laboratories)依據操作手冊於小規模(10公分培養皿)情況下共轉染至製備例3經西方墨點法證實之 pkr基因剔除之293T細胞(#12之293T細胞株)。並如製備例2之病毒效價測試步驟，測試第三代慢病毒包裝系統(比較例2)及實施例1之本發明慢病毒包裝系統質體組合物經 pkr基因剔除之293T細胞製備之慢病毒之效價，其結果如圖5所示，在小規模情況下利用實施例1之本發明慢病毒包裝系統質體組合物經 pkr基因剔除之293T細胞製備之慢病毒效價約為第三代慢病毒包裝系統(比較例2)生產經 pkr基因剔除之293T細胞所生產之慢病毒效價的22.2倍。因此，本發明之慢病毒包裝系統以 pkr基因剔除之293T細胞進行慢病毒製備確實能顯著提升所生產的慢病毒效價。
實驗例3：感染能力測試－初級T細胞轉導
將來自健康捐贈者的周邊血液單核細胞(Peripheral blood mononuclear cells；PBMC) 以Ficoll (GE)處理，再以CD3/CD28擴增磁珠(Expander Beads)(ThermoFisher)純化及活化之初級T細胞。次日，以實驗例1中之第二代、第三代及實施例1的本發明之慢病毒包裝系統於小規模下製備之慢病毒，轉導至前述純化之初級T細胞(為轉導第一天)，簡而言之，是將1毫升之總數為1x10 6初級T細胞和實驗例1中製得之慢病毒(依照MOI(Multiplicity of Infection) 1、MOI 3及MOI 5)共同培養。並在慢病毒轉導兩天後將CD3/CD28微珠移除，最後，於慢病毒轉導的第六天利用流式細胞儀檢測標的基因－CD19-BBz於T細胞中的表現量。具體而言，是將1x10 5初級T細胞懸浮於100 μL染色液(染色液為含有1%FCS (Fetal Calf Serum)之 PBS溶液)後，加入第一抗體(Biotin-conjugated goat anti mouse IgG F(ab)2)於室溫下靜置20分鐘，以1 mL染色液清洗初級T細胞兩次後，再次將初級T細胞顆粒懸浮於含有Streptavidin-PE之染色液(總體積100 μL)中於室溫下靜置20分鐘，再次以1 mL染色液清洗初級T細胞兩次後，最後將初級T細胞懸浮於適量之染色液中進行流式細胞儀分析。
實驗結果如圖6A-6C所示，於圖6A中，實施例1之本發明慢病毒包裝系統所生產之慢病毒以MOI 1、MOI 3及MOI 5轉導之T細胞，其CD19-BBz表現率均高於第二代、第三代慢病毒包裝系統生產之慢病毒所轉導之T細胞。因此，與第二代、第三代慢病毒包裝系統相比，本發明之慢病毒包裝系統所生產之慢病毒具有最佳之轉導率、轉導效率及基因傳送效果。而於圖6B中，實施例1之本發明慢病毒包裝系統所生產之慢病毒以MOI 1、MOI 3及MOI 5轉導T細胞，以經螢光標定之抗體檢測T細胞CD19-BBz之表現，每一細胞之平均螢光強度均高於第二代、第三代慢病毒包裝系統生產之慢病毒所轉導之T細胞。且如圖6C，由於經實施例1之本發明慢病毒包裝系統所生產之慢病毒轉導之T細胞之轉導率及平均螢光強度均優於第二代慢病毒包裝系統，約為第二代慢病毒包裝系統的1.2倍，因此，本發明之慢病毒包裝系統可提升所生產之慢病毒之活性。
因此，本發明的慢病毒包裝系統可以顯著增加慢病毒的產量及活性，能於基因改造細胞時有效提升傳遞基因之效率，進而能降低基因改造細胞之成本，且利用 pkr基因剔除之293T細胞生產之慢病毒更能增強所生產之慢病毒的效能。
以上所述僅是本發明的較佳實施例而已，並非對本發明做任何形式上的限制，雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然而並非用以限定本發明，任何熟悉本專業的技術人員，在不脫離本發明技術方案的範圍內，當可利用上述揭示的技術內容作出些許更動或修飾為等同變化的等效實施例，但凡是未脫離本發明技術方案的內容，依據本發明的技術實質對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與修飾，均仍屬於本發明技術方案的範圍內。
無
圖1為本發明所述之yTA-CMV- tat表現載體之示意圖。 圖2A為實施例1之慢病毒包裝系統之包含TAR嵌合5’-LTR轉移質體示意圖。 圖2B為實施例1之慢病毒包裝系統之質體組合物示意圖。 圖3為本發明之慢病毒包裝系統相較於第三代慢病毒包裝系統，於大規模及小規模下所生產之慢病毒之病毒效價倍數。 圖4為製備例3中以西方墨點法測試各細胞株之PKR蛋白之表現量。 圖5為本發明之慢病毒包裝系統相較於第三代慢病毒包裝系統，於小規模下利用 pkr基因剔除之293T細胞所生產之慢病毒之病毒效價倍數。 圖6A為第二代、第三代及本發明之慢病毒包裝系統生產之慢病毒之轉導率。 圖6B為第二代、第三代及本發明之慢病毒包裝系統生產之慢病毒轉導後T細胞之平均螢光強度。 圖6C為本發明之慢病毒包裝系相較於第二代慢病毒包裝系統，所生產之慢病毒之轉導率及轉導後T細胞之平均螢光強度的倍數。
無
 
                        序列表
          <![CDATA[<110>  沛爾生技醫藥股份有限公司 PELL BIO-MED TECHNOLOGY CO., LTD]]>
          <![CDATA[<120>  慢病毒包裝系統以及使用其以提高宿主細胞之慢病毒產量的方法]]>
          <![CDATA[<160>  3     ]]>
          <![CDATA[<170>  PatentIn 版本 3.5]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  261]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  不含內含子的tat基因的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          atggagccag tagatcctag actagagccc tggaagcatc caggaagtca gcctaaaact       60
          gcttgtacca attgctattg taaaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg tttcatgaca      120
          aaagccttag gcatctccta tggcaggaag aagcggagac agcgacgaag agctcatcag      180
          aacagtcaga ctcatcaagc ttctctatca aagcagccca cctcccaacc ccgaggggac      240
          ccgacaggcc cgaaggaata a                                                261
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  57]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  TAR嵌合5'LTR的核苷酸序列中的TAR的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          ggtctctctg gttagaccag atctgagcct gggagctctc tggctaacta gagaacc           57
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  標靶pkr基因序列的gRNA]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          gcaaccuacc uccuaucaug                                                   20
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002

Claims (13)

  1. 一種慢病毒包裝系統，其包含： 一轉移 (transfer)質體，其包含一TAR嵌合5’ LTR(trans-activation response element-reserved chimeric 5’ long terminal repeat)的核苷酸序列及一3’ LTR的核苷酸序列，其中，所述TAR嵌合5’ LTR的核苷酸序列及所述3’ LTR的核苷酸序列中的U3區域均被破壞； 至少一包裝 (packaging)質體，包含一編碼TAR RNA結合蛋白(TAR RNA binding protein)之基因的核苷酸序列、一 rev基因的核苷酸序列、一 gag基因的核苷酸序列及一 pol基因的核苷酸序列，其中，所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列為tat基因的核苷酸序列； 及一包膜 (envelope)質體。
  2. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體及一第二包裝質體，且 所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列之其中二者， 而所述第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的其餘者。
  3. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體、一第二包裝質體、一第三包裝質體及一第四包裝質體，且 所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 所述第二包裝質體包含 rev基因的核苷酸序列、 所述第三包裝質體包含 gag基因的核苷酸序列、且 所述第四包裝質體分別包含 pol基因的核苷酸序列。
  4. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述至少一包裝質體係為一第一包裝質體、一第二包裝質體及一第三包裝質體，且 所述第一包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列之其中二者， 而所述第二包裝質體及所述第三包裝質體分別包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列、 rev基因的核苷酸序列、 gag基因的核苷酸序列及 pol基因的核苷酸序列的其餘任一者。
  5. 如請求項4所述之慢病毒包裝系統，其中， 所述第一包裝質體包含所述 gag基因的核苷酸序列及所述 pol基因的核苷酸序列； 所述第二包裝質體包含所述編碼TAR RNA結合蛋白之基因的核苷酸序列；且 所述第三包裝質體包含所述 rev基因的核苷酸序列。
  6. 如請求項5所述之慢病毒包裝系統，其中，所述轉移質體與第一包裝質體、第二包裝質體、第三包裝質體及包膜質體之重量比為3至12：3至7：1至4：1至4：1至6。
  7. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述 tat基因的核苷酸序列係包含如SEQ ID NO：1所示之序列。
  8. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述包膜質體包含編碼水泡性口炎病毒醣蛋白(vesicular stomatitis virus glycoprotein，VSV-G)的基因的核苷酸序列或狒狒內源性病毒包膜 (baboon endogenous virus envelope)的基因的核苷酸序列。
  9. 如請求項1所述之慢病毒包裝系統，其中，所述TAR嵌合5’ LTR的核苷酸序列中之TAR之核苷酸序列係包含如SEQ ID NO：2所示之核苷酸序列。
  10. 一種提高宿主細胞之慢病毒產量的方法，其包含使用如請求項1至9中任一項所述之慢病毒包裝系統轉染所述宿主細胞，其中，所述宿主細胞為 pkr基因剔除之293T細胞。
  11. 一種提高宿主細胞之慢病毒產量的方法，其包含使用如請求項1至9中任一項所述之慢病毒包裝系統轉染所述宿主細胞。
  12. 如請求項11所述之提高宿主細胞之慢病毒產量的方法，其中，所述宿主細胞包含哺乳類動物細胞。
  13. 如請求項12所述之提高宿主細胞之慢病毒產量的方法，其中所述哺乳類動物細胞包含人胚胎腎細胞(HEK293)或293T細胞(HEK293T)。
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