DE102018100967A1

DE102018100967A1 - Verfahren zur feststellung der wirksamkeit von viralen vektoren

Info

Publication number: DE102018100967A1
Application number: DE102018100967.4A
Authority: DE
Inventors: Agathe BOURGOGNE; Ali Mohamed; Chih-Chiang Tsou; Harpreet Singh; Mamta KALRA; Steffen Walter
Original assignee: Immatics US Inc
Current assignee: Immatics US Inc
Priority date: 2018-01-17
Filing date: 2018-01-17
Publication date: 2019-07-18
Anticipated expiration: 2038-01-18
Also published as: DE102018100967B4; CA3088165A1; US20190216852A1; EP3740216A1; MA51644A; PL3740216T3; EP3740216B1; TW201934755A; DK3740216T3; WO2019143772A1; CN111936153A; SG11202006498PA; HUE058665T2; ES2916048T3

Abstract

Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf T-Zellen, die bei einer volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie mit einem viralen Vektor transduziert werden und auf Verfahren dafür. Unter einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Ermittlung der optimalen lentiviralen Vektorkonzentrationen zum Transduzieren der T-Zellen. Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin T-Zell-Populationen bereit, die durch in dieser Offenbarung beschriebene Verfahren hergestellt werden.

Description

HINTERGRUND
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Offenbarung bezieht sich auf T-Zellen, die bei einer volumetrischen Konzentration für die Krebsimmuntherapie mit einem viralen Vektor transduziert werden und auf Verfahren dafür. Unter einem Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Ermittlung der optimalen lentiviralen Vektorkonzentrationen zum Transduzieren der T-Zellen. Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die vorliegende Offenbarung weiterhin T-Zell-Populationen bereit, die durch in dieser Offenbarung beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Stand der Technik
Eine Herausforderung bei dem Transport eines Gens durch einen viralen Vektor oder einen Virus für therapeutische Zwecke stellt die Zubereitung und genaue Quantifizierung der klinischen Dosierungsformen dar. Für die Zubereitung von viralen Impfstoffen, rekombinanten Proteinen, die virale Vektoren und virale Antigene verwenden, ist eine Virusquantifizierung notwendig, um den Vorgang fortlaufend anzupassen und zu überwachen, um die hergestellten Mengen zu optimieren und auf die sich ständig verändernden Anforderungen und Anwendungen zu reagieren.
Die Bestimmung des Virustiters oder die Quantifizierung des Virus erfordert das Zählen der Anzahl der Viren in einem spezifischen Volumen, um die Viruskonzentration zu bestimmen. Traditionelle Verfahren umfassen die Virus-Plaque-Assays, welche die Anzahl von Plaque-bildenden Einheiten [pfu - plaque forming units] in einer Virusprobe und die Gewebekultur-Infektionsdosis [TCID₅₀-Tissue Culture Infective Dose] oder fluoreszenzaktive Infektionsdosis [FAID₅₀ - Fluorescence Active Infectious Dose], die den infektiösen Virustiter misst, bestimmen. Dieser TCID₅₀-Assay quantifiziert die Menge an Viren, die benötigt wird, um 50% der infizierten Wirte zu töten oder in 50% der angeimpften Gewebekulturzellen einen zytopathischen Effekt zu erzielen. Die herkömmlichen Verfahren sind im Allgemeinen langsam und arbeitsintensiv und leiden an Einschränkungen, einschließlich einem hohen Grad an Interassay-Varianz.
Der Enzymimmunoassay [ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay] ist eine modernere Variante eines Protein-Assays, der einen spezifischen Antikörper verwendet, der mit einem Enzym verbunden ist, um die Anwesenheit einer unbekannten Menge an Antigenen (d.h. Viren) in einer Probe nachzuweisen. Das Antikörper-Antigen-bindende Ereignis wird durch die Fähigkeit des Enzyms nachgewiesen und/oder quantifiziert, ein Reagenz in ein auffindbares Signal umzuwandeln, das verwendet werden kann, um die Konzentration des Antigens in der Probe zu berechnen. Die Plattenassays der Virustiterbestimmung, die auf dem Immunfluoreszenznachweis basieren, der einen ELISA verwendet, wurden entwickelt, jedoch werden sie verwendet, um Proteine von Virusproben zu quantifizieren und nicht, um infektiöse Viren zu quantifizieren.
Durchflusszytometrie oder fluoreszenzaktivierte Zellsortierung [FACS - fluorescence-activated cell sorter] wurden verwendet, um die Anzahl an infizierten Zellen in Zellkulturen zu messen, die mit einer ziemlich hohen Infektionsmultiplizität [MOI - multiplicies of infection] infiziert sind. Zum Beispiel beschreibt US Patent Nr. 6,248,514 die Verwendung der Durchflusszytometrie, um Zellen zu analysieren, die unter Verwendung von spezifischen Bereichen von viralen Partikelkonzentrationen und Adsorptionszeitausbeuten infiziert wurden. US Patent Nr. 7,476,507 beschreibt FACS-basierte Verfahren zum Bestimmen der Virustiter einer Kultur von Wirtstier-Wirtszellen, die mit einem Circovirus infiziert wurden. Jedoch verhindern die Kosten, die Größe und die Komplexizität der Instrumente für die Durchflusszytometrie für viele Anwendungen eine weitergehende Verwendung.
Verfahren zur Bestimmung von retroviralen Vektortitern können im Allgemeinen in zweckmäßige und nicht-zweckmäßige Titrationsverfahren unterteilt werden. Nicht-zweckmäßige Titrationsverfahren können einen p24 Antigen ELISA, die Bestimmung der Aktivität der reversen Transkriptase (RT) und die Bestimmung der genomischen RNA-Konzentration in Vektor-Zubereitungen durch halb-quantitatives Northern Blotting, Dotblot-Analysen oder RT-qPCR umfassen. Manchmal überschätzen diese Techniken den zweckmäßigen Vektortiter und leiden an bestimmten Nachteilen. Zum Beispiel kann der p24 Proteinpool eine variable Menge von freiem p24 und p24 von nicht-zweckmäßigen Vektorpartikeln umfassen. Gleichermaßen können RNA-Titer schadhafte Partikel herausfinden, während der RT-Assay RT-Aktivität zeigen kann. Genauere zweckmäßige Titer können durch die Transduktion von Zellen infolge der limitierenden Verdünnung von Vektoren und der anschließenden Abschätzung der Reporterproteinaktivität, z. B. β-Galaktosidase positive Zellen oder durch die Bestimmung von koloniebildenden Einheiten infolge der antibiotischen Auswahl bestimmt werden. Weiter verbreitete und direkte Techniken für die Quantifizierung von zweckmäßigen Vektortitern können eGFP-Fluoreszenz und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) verwenden. Jedoch kann die FACS-Analyse der transgenen Expression auf fluoreszierende Reporterproteine beschränkt werden und kann nicht zwischen Zellen mit einzelnen oder multiplen Einschlüssen unterscheiden.
US20170166866 beschreibt ein Verfahren zum Transduzieren eines primären T-Lymphozyten, einschließlich des Inkontaktbringens eines primären T-Lymphozyten mit einem viralen Vektor, z. B. einem lentiviralen Vektor, der eine Nukleinsäure bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1,5 bis 2,5 enthält und eine Zusammensetzung, bei der es sich um einen Inhibitor des angeborenen Immunsystems handelt, so dass die Nukleinsäure in T-Lymphozyten transduziert wird.
US20170023570 beschreibt ein Verfahren des Quantifizierens von infektiösen Viruspartikeln in einer Probe mit hohem Durchsatz. Dieses Verfahren der Virusquantifizierung umfasst folgende Schritte: 1) Bereitstellen einer Probe, die einen Virus enthält; 2) Zubereiten von seriellen Verdünnungen der Probe; 3) Infizieren der Wirtszelle mit dem Virus und Inkubieren der Kultur; 4) Reagieren eines Antigens, das durch den Virus in infizierten Zellen exprimiert wird mit einem Antikörper, der mit einer fluoreszierenden Markierung markiert wird; 5) Bestimmen der Anzahl von infizierten Zellen; und 6) Bestimmen des Virustiters in der Probe. Es bleibt die Notwendigkeit, bessere Verfahren für das Ermitteln der optimalen Viruskonzentrationen für die Virus-Transduktion bei der Herstellung von T-Zellen für die Immuntherapie zu entwickeln.
Auf diesem Gebiet gibt es einen Bedarf für präzise Verfahren für die Quantifizierung von Viruspartikeln bei der Herstellung von T-Zellprodukten.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG
Unter einem Gesichtspunkt stellt die Offenbarung Verfahren für das Transduzieren von T-Zellen für die Immuntherapie bereit, die Folgendes umfasst:

(a) Erhalten von T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person;
(b) Aktivieren der T-Zellen mit einem Anti-CD3 Antikörper und/oder einem Anti-CD28 Antikörper;
(c) Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor; und
(d) Vermehren der transduzierten T-Zellen.

Unter einem Gesichtspunkt werden die T-Zellen für ungefähr 3 bis ungefähr 10 Tage, für ungefähr 4 bis ungefähr 8 Tage oder ungefähr 4 bis zu ungefähr 6 Tage vermehrt.
Unter einem Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf ein Verfahren für das Transduzieren von T-Zellen für die Immuntherapie, zum Beispiel durch:

(a) Erhalten von T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person;
(b) Aktivieren der T-Zellen mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper;
(c) Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen;
(d) Vermehren der transduzierten T-Zellen;
(e) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen des viralen Vektors exprimieren;
(f) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern zu überschreiten, und
(g) Transduzieren von T-Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, mit dem viralen Vektor bei einer identifizierten volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie.

Unter einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten oder einer Person, welche diese Behandlung benötigt, einschließlich dem Verabreichen von T-Zellen an den Patienten, die mit einem Virusvektor bei einer volumetrischen Konzentration, bei der die T-Zellen von dem Patienten erhalten werden, transduziert wurden, und die volumetrische Konzentration durch folgendes bestimmt wird:

(a) Erhalten von T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern,
(b) Aktivieren der T-Zellen, die von Schritt (a) erhalten wurden, mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, der die aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen transduziert,
(c) Vermehren der transduzierten T-Zellen, die von Schritt (b) erhalten wurden,
(d) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen, die von Schritt (c) erhalten wurden, bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren;
(e) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens, das durch Schritt (d) gemessen wird, zu überschreiten und
(f) Transduzieren von T-Zellen, die mit dem viralen Vektor bei der durch Schritt (e) identifizierten volumetrischen Konzentration von dem Patienten erhalten wurden.

Unter einem anderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf T-Zellen, die mit einem Virusvektor bei einer volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie, bei der die T-Zellen von einem Patienten erhalten werden, transduziert wurden, und die volumetrische Konzentration durch folgendes bestimmt wird:

(a) Erhalten von T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern,
(b) Aktivieren der T-Zellen, die von Schritt (a) erhalten wurden, mit einem Anti-CD3 Antikörper und ein Anti-CD28-Antikörper, der die aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen transduziert,
(c) Vermehren der transduzierten T-Zellen, die von Schritt (b) erhalten wurden,
(d) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen, die von Schritt (c) erhalten wurden, bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren;
(e) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens, das durch Schritt (d) gemessen wird, zu überschreiten und
(f) Transduzieren von T-Zellen, die mit dem viralen Vektor bei der durch Schritt (e) identifizierten volumetrischen Konzentration von dem Patienten erhalten wurden.

Unter einem anderen Gesichtspunkt handelt es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt handelt es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor, der einen TCR exprimiert.
Unter einem Gesichtspunkt werden die T-Zellen für ungefähr 3 bis ungefähr 10 Tage, ungefähr 4 bis ungefähr 8 Tage, ungefähr 4 bis ungefähr 6 Tage, ungefähr 4 bis ungefähr 5 Tage, mindestens ungefähr 3 Tage, mindestens ungefähr 4 Tage, mindestens ungefähr 5 Tage, mindestens ungefähr 6 Tage, nicht mehr als ungefähr 4 Tage, nicht mehr als ungefähr 5 Tage oder nicht mehr als ungefähr 6 Tage vermehrt.
Unter einem Gesichtspunkt liegt die Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen im Bereich von ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 1,0 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 2,5 ml der Transduktionsmischung und ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 5 ml der Transduktionsmischung.
Unter einem anderen Gesichtspunkt kann die Transduktionsmischung eine Zellkonzentration von ungefähr 0,1 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 5,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml, oder von ungefähr 5,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml umfassen.
Unter einem anderen Gesichtspunkt umfassen die hier beschriebenen Verfahren das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen in den vermehrten Zellen exprimieren, von der Vielzahl von gesunden Spendern ergibt.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt umfasst das Verfahren das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern zu überschreiten.
Unter einem Gesichtspunkt liegt die identifizierte volumetrische Konzentration im Bereich von ungefähr 1 µl bis ungefähr 50 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 5 µl bis ungefähr 15 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, und ungefähr 8 µl bis ungefähr 12 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung.
Unter einem Gesichtspunkt handelt es sich bei dem Patienten oder der Person, welche die Behandlung benötigt, um einen Krebspatienten. Unter einem anderen Gesichtspunkt, wird der zu behandelnde Krebs aus der folgenden Gruppe von Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom [HCC - hepatocellular carcinoma], kolorektales Karzinom [CRC - colorectal carcinoma], Glioblastom (GB), Magenkrebs [GC - gastric cancer], Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom [NSCLC - non-small cell lung cancer], Pankreaskrebs [PC - pancreatic cancer], Nierenzellkarzinom [RCC - renal cell carcinoma], gutartige Prostatahyperplasie [BPH - benign prostate hyperplasia], Prostatakrebs [PCA - prostate cancer], Eierstockkrebs [OC - ovarian cancer], Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie [CLL - chronic lymphocytic leukemia], Merkelzellkarzinom [MCC - Merkel cell carcinoma], kleinzelliger Lungenkrebs [SCLC - small cell lung cancer], Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom [GBC, CCC - gallbladder cancer, cholangiocarcinoma], Harnblasen-Karzinom [UBC - urinary bladder cancer], akute lymphoblastische Leukämie [ALL - acute lymphoblastic leukemia] und Gebärmutterkrebs [UEC - uterine cancer].
Unter einem Gesichtspunkt werden die T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern, Patienten oder Personen erhalten.
Unter einem anderen Gesichtspunkt sind die T-Zellen, die von einer Vielzahl von gesunden Spendern, Patienten oder Personen und dem Patienten erhalten werden, CD8+ T-Zellen und/oder CD4+ T-Zellen.
Die Offenbarung stellt T-Zell-Populationen mit den hier beschriebenen Eigenschaften bereit. Unter einem anderen Gesichtspunkt stellt die Offenbarung weiterhin T-Zell-Populationen bereit, die durch in dieser Offenbarung beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Figurenliste
Für ein weiteres Verständnis des Charakters, der Gegenstände und der Vorteile der vorliegenden Offenbarung sollte Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung genommen werden, die in Zusammenhang mit den folgenden Zeichnungen gelesen wird, während gleiche Referenznummern gleiche Elemente bezeichnen.

1A zeigt ähnliche Zahlen für die Kopie des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 6 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von volumetrischen Konzentrationen abgestimmt sind.
1B zeigt verschiedene Zahlen für die Kopie des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 6 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von MOI abgestimmt sind.
1C zeigt eine ähnliche Anzahl an Kopien des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 7 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von volumetrischen Konzentrationen abgestimmt sind.
1D zeigt verschiedene Anzahlen an Kopien des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 7 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von MOI abgestimmt sind.
1E zeigt ähnliche Anzahlen an Kopien des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 9 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von volumetrischen Konzentrationen abgestimmt sind.
1F zeigt verschiedene Anzahlen an Kopien des integrierten viralen Vektors (LV-R73) und Menge (% an Dex+) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1 D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von dem gesunden Spender # 9 in Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run)-Chargen erhalten wurden, wenn sie auf Grundlage von MOI abgestimmt sind.
2 zeigt die Menge (% Dex+ von CD3+CD8+ Zellen) von T-Zellen, die das Transgen (R7P1D5 TCR) in T-Zellen exprimieren, die von 10 gesunden Spendern erhalten wurden, die mit viralen Vektoren bei drei ausgewählten volumetrischen Konzentrationen transduziert werden, um das optimale Virus-Volumen auszuwählen.
3 zeigt die Anzahl an Kopien des integrierten viralen Vektors (LV-R73) in T-Zellen, die von 10 gesunden Spendern erhalten wurden, die mit viralen Vektoren bei drei ausgewählten volumetrischen Konzentrationen transduziert werden, um das optimale Virus-Volumen auszuwählen.
4 illustriert ein Verfahren in Übereinstimmung mit einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Offenbarung stellt T-Zellen bereit, die bei einer volumetrischen Konzentration mit einem viralen Vektor transduziert werden und Verfahren dafür. Unter einem Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Offenbarung auf die Ermittlung der optimalen lentiviralen Vektorkonzentrationen zum Transduzieren der T-Zellen.
Die vorliegende Offenbarung stellt weiterhin T-Zell-Populationen bereit, die durch in dieser Offenbarung beschriebene Verfahren hergestellt werden.
Unter einem Gesichtspunkt umfasst die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Transduzieren von T-Zellen, das Folgendes umfasst:

Unter einem anderen Gesichtspunkt umfasst die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zum Transduzieren von T-Zellen, das Folgendes umfasst:

(a) Erhalten von T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person;
(b) Aktivieren der T-Zellen mit einem Anti-CD3 Antikörper und/oder einem Anti-CD28 Antikörper;
(c) Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor; und
(d) gegebenenfalls das Vermehren der transduzierten T-Zellen.
(e) gegebenenfalls das Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der T-Zellen bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren; und
(f) gegebenenfalls das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern zu überschreiten, und
(g) Transduzieren von T-Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, mit dem viralen Vektor bei einer identifizierten volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie.

Unter noch einem anderen Gesichtspunkt umfasst die vorliegende Offenbarung ein Verfahren für das Transduzieren von T-Zellen, das Folgendes umfasst:

(a) Erhalten von T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person;
(b) Aktivieren der T-Zellen mit einem Anti-CD3 Antikörper und/oder einem Anti-CD28 Antikörper;
(c) Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor; und
(d) Vermehren der transduzierten T-Zellen;
(e) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der T-Zellen bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren; und
(f) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern zu überschreiten, und
(g) Transduzieren von T-Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, mit dem viralen Vektor bei einer identifizierten volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie.

Unter einem Gesichtspunkt werden die T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern, Patienten oder Personen erhalten. Unter einem anderen Gesichtspunkt werden die T-Zellen von einem oder mehr, zwei oder mehr, drei oder mehr, vier oder mehr, fünf oder mehr, zehn oder mehr oder 20 oder mehr gesunden Spendern, Patienten oder Personen erhalten.
Unter einem anderen Gesichtspunkt handelt es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Unter einem Gesichtspunkt liegt die Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen im Bereich von ungefähr 0,01 µl pro ungefähr 10⁶ Zellen bis ungefähr 1 ml pro ungefähr 10⁶ Zellen, von ungefähr 0,01 µl pro ungefähr 2 × 10⁶ Zellen bis ungefähr 1 ml pro ungefähr 2 × 10⁶ Zellen, von ungefähr 0,01 µl pro ungefähr 5 × 10⁶ Zellen zu ungefähr 1 ml pro ungefähr 5 × 10⁶ Zellen; von ungefähr 0,01 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen bis ungefähr 1 ml pro ungefähr 10⁷ Zellen, von ungefähr 1 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen zu ungefähr 500 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen, von ungefähr 5 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen bis ungefähr 150 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen oder von ungefähr 8 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen zu ungefähr 12 µl pro ungefähr 10⁷ Zellen.
Der Begriff „ungefähr“ wird vorliegend als ±5% des zitierten Wertes definiert gebraucht.
Der vorliegend verwendete Begriff „volumetrische Konzentration“ bezieht sich auf das Volumen, z. B. ml und µl des Virus, der pro Volumen verwendet wird, z. B. ml und µl der Transduktionsmischung. Das Volumen der Transduktionsmischung kann durch die Zellkonzentration während der Transduktion bestimmt werden. Wenn zum Beispiel die Zellkonzentration während der Transduktion auf 2,0 × 10⁶ Zellen/ml festgelegt ist, dann können 2,0 × 10⁶ transduzierte Zellen in einem festgelegten Volumen von 1,0 ml der Transduktionsmischung oder 1,0 × 10⁶ transduzierten Zellen können in einem festgelegten Volumen von 0,5 ml Transduktionsmischung enthalten sein.
Unter einem anderen Gesichtspunkt umfassen die hier beschriebenen Verfahren das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern exprimieren, von der Vielzahl von gesunden Spendern ergibt, z. B. Messen des Prozentsatzes von Zellen, die für die Expression des Transgens positiv getestet wurden.
Unter noch einem anderen Gesichtspunkt umfasst das Verfahren das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien von 5 Kopien des integrierten Transgens in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl an gesunden Spendern nicht überschreitet.
Unter einem Gesichtspunkt handelt es sich bei dem Patienten oder der Person um einen Krebspatienten. Unter einem anderen Gesichtspunkt, wird der hier beschriebene Krebs aus der folgenden Gruppe von Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom (HCC), kolorektales Karzinom (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), Pankreaskrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartige Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasen-Karzinom (UBC), akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC).
Die Offenbarung stellt weiterhin Vektoren bereit. Unter einem Gesichtspunkt ist ein „Vektor“ in der Lage, Gensequenzen an Zielzellen zu übertragen. Typischerweise bezeichnen „Vektorkonstruktion“, „Expressionsvektor“, und „Genübertragungsvektor“ alle Nukleinsäurekonstruktionen, die in der Lage sind, die Expression eines interessierenden Gens zu steuern und die Gensequenzen auf Zielzellen übertragen können. Daher umfasst der Begriff das Klonen und Expressionsvektoren sowie das Integrieren von Vektoren.
Retrovirale Vektoren wurden auf Grundlage von mehreren Mitgliedern der Gruppe der Retroviridae einschließlich dem Foamyvirus, dem menschlichen Immunschwächevirus [HIV-1 - Human Immunodeficiency Virus], dem Affen-Immunschwächevirus [SIV - Simian Immunodeficiency Virus], dem Rinder-Immunschwächevirus [Bovine Immunodeficiency Virus], dem Katzen-Immunschwächevirus [Feline Immunodeficiency Virus], dem Virus, der infektiöse Anämie bei Einhufern hervorruft, [EIAV - Equine Infectious Anemia Virus], dem Maus-Leukämievirus [MLV - Murine Leukemia Virus], dem Rinder-Leukämievirus [Bovine Leukemia Virus], dem Rous-Sarkom-Virus [RSV - Rous Sarcoma Virus], dem Milz-Nekrose-Virus [SNV - Spleen Necrosis Virus] und dem Maus-Mammatumor-Virus erschaffen. Üblicherweise verwendete Plattformen können die vom Foamyvirus und dem HIV-1 abgeleiteten lentiviralen Vektoren und die vom MLV abgeleiteten gammaretroviralen Vektoren umfassen. Der Tropismus eines Retroviruses kann dadurch verändert werden, indem fremde Hüllproteine aufgenommen werden und dadurch die potentielle Zielpopulation von Zielzellen vergrößert wird. Zum Beispiel kann die Aufnahme des G Glykoprotein-(VSV-G) Hüllproteins des vesikulären Stomatitis-Virus den Tropismus erweitern und die Genübertragung in eine breite Vielfalt von Zellen in vitro, z. B. CD34+ Stammzellen und in vivo, z. B. Gehirn-, Muskel- und Leberzellen ermöglichen. Die Aufnahme von den Pseudotypisierungs-Hüllproteinen E1 und E2 des Baculovirus GP64 und Hepatitis C kann die Transduktion in Leberzellen erhöhen und die Aufnahme von RD114 Pseudotypisierungs-Hüllprotein kann bevorzugt die Transduktion in lymphohämopoietischen Zellen fördern. Lentivirale Vektoren können nichtteilende Zellen transduzieren oder infizieren und erzeugen typischerweise hohe virale Titer. Die Auswahl eines lentiviralen oder eines gammaretroviralen Genübertragungssystems hängt von dem Zielgewebe ab. Diese Vektoren können aus cis-wirkenden langen terminalen Wiederholungen mit einer Einschleusungskapazität von bis zu 6-10 kb fremder Sequenz bestehen. Die Minimum cis-wirkenden LTRs reichen für eine Replikation und Einschleusung der Vektoren aus, die anschließend dafür verwendet werden, das therapeutische Gen in die Zielzelle zu integrieren, um eine dauerhafte Expression des Transgens zu ermöglichen.
In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem Vektor um einen lentiviralen Vektor. Ein lentiviraler Vektor, wie hier verwendet, ist ein Vektor, der mindestens einen Bestandteil, der von einem Lentivirus abgeleitet werden kann, umfasst. Eine detaillierte Liste von Lentiviren ist in Coffin et al. zu finden. (1997) „Retroviren“ Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds: J M Coffin, S M Hughes, H E Varmus Seiten 758-763). Lentivirale Vektoren können durch Verfahren hergestellt werden. Siehe z. B. US Patente Nummern 5,994,136, 6,165,782 und 6,428,953 , deren Inhalte vollständig durch Hinweis aufgenommen werden. Bevorzugt handelt es sich bei dem lentiviralen Vektor um einen lentiviralen Vektor, der hinsichtlich Integrase defizient ist [IDLV - integrase deficient lentiviral vector]. Siehe z. B. US Patentveröffentlichung 2009/0117617 , deren Inhalt vollständig durch Hinweise aufgenommen wird. IDLVs können, wie beschrieben, hergestellt werden, zum Beispiel durch die Verwendung von lentiviralen Vektoren, die eine oder mehrere Mutationen in dem nativen Lentivirus Integrase-Gen aufweisen, zum Beispiel wie in Leavitt et al. (1996) J. Virol. 70(2):721-728; Philippe et al. (2006) Proc. Natl Acad. Sci USA 103(47): 17684-17689; und der WO 06/010834 offenbart, deren Inhalte vollständig durch Hinweis aufgenommen werden. In bestimmten Ausführungsformen handelt es sich bei dem IDLV um einen lentiviralen Vektor von HIV, der eine Mutation an Position 64 des Integraseproteins (D64V) umfasst, wie in Leavitt et al. (1996) J. Virol. 70(2):721-728 beschrieben, deren Inhalt vollständig durch Hinweis aufgenommen wurde.
In Anwendungen der Gentherapie kann es wünschenswert sein, dass der Gentherapie-Vektor mit einem hohen Grad an Spezifizität zu einem bestimmten Gewebetyp transportiert wird. Demgemäß kann ein viraler Vektor modifiziert werden, damit er für einen gegebenen Zelltyp Spezifität aufweist, indem ein Ligand als ein Fusionsprotein mit einem viralen Hüllprotein an der äußeren Oberfläche des Virus exprimiert wird. Der Ligand wird so ausgewählt, dass er Affinität für einen Rezeptor aufweist, von dem man weiß, dass er auf dem interessierenden Zelltyp vorhanden ist. Zum Beispiel berichteten Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), deren Inhalt vollständig durch Hinweis aufgenommen wird, dass der Moloney Maus-Leukämie-Virus so modifiziert werden kann, dass er humanes Heregulin, das mit gp70 fusioniert ist, exprimiert und der rekombinante Virus bestimmte humane Brustkrebszellen, die den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor exprimieren, infiziert. Dieses Prinzip kann auf andere Virus-Zielzellenpaare ausgeweitet werden, bei denen die Zielzelle einen Rezeptor exprimiert und der Virus ein Fusionsprotein exprimiert, das einen Liganden für den Zell-Oberflächen-Rezeptor umfasst. Zum Beispiel können filamentöse Phagen so erzeugt werden, dass sie Antikörperfragmente (z. B. FAB oder Fv) mit einer spezifischen Bindungsaffinität für jeden gewählten Zell-Rezeptor aufweisen. Obwohl die oben aufgeführte Beschreibung hauptsächlich für virale Vektoren gilt, können dieselben Prinzipien auf nicht-virale Vektoren angewendet werden. Solche Vektoren können so erzeugt werden, dass sie spezifische Aufnahmesequenzen enthalten, die die Aufnahme durch spezifische Zielzellen bevorzugt fördern.
Gentherapie-Vektoren können in vivo durch Verabreichung an einen einzelnen Patienten transportiert werden, typischerweise durch systemische Verabreichung (z. B. intravenös, intraperitonal, intramuskulär, subdermal oder durch intrakranielle Infusion) oder durch topische Anwendung, wie unten beschrieben. Alternativ können Vektoren ex vivo zu Zellen transportiert werden, wie zum Beispiel Zellen, die von einem einzelnen Patienten explantiert wurden (z. B. Lymphozyten, Knochenmarksaugproben, Gewebebiopsien) oder universellen Spenderhämatopoietischen Stammzellen, worauf eine Reimplantation der Zellen in einen Patienten folgt, gewöhnlich nach der Auswahl von Zellen, die in den Vektor aufgenommen wurden.
Geeignete Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, eukaryotische und prokaryotische Zellen und/oder Zelllinien. Nicht-begrenzte Beispiele für solche Zellen oder Zelllinien, die aus solchen Zellen erzeugt wurden, umfassen COS, CHO (z. B. CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (z. B. HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) und perC6 Zellen sowie Insektenzellen, wie zum Beispiel Spodoptera fugiperda (Sf) oder Pilzzellen wie zum Beispiel Saccharomyces, Pichia und Schizosaccharomyces. In bestimmten Ausführungsformen ist die Zelllinie eine CHO-K1, MDCK oder HEK293 Zelllinie. Darüber hinaus können Primärzellen isoliert werden und ex vivo für die Wiedereinführung in das zu behandelnde Subjekt nach der Behandlung mit den Nukleasen (z. B. ZFNs oder TALENs) oder Nuklease-Systemen (z. B. CRISPR/Cas) verwendet werden. Geeignete Primärzellen umfassen mononukleare Zellen aus dem Peripherblut (PBMC) und andere Untergruppen von Blutzellen wie zum Beispiel, aber nicht beschränkt auf, T-Lymphozyten, wie zum Beispiel CD4+ T-Zellen oder CD8+ T-Zellen. Geeignete Zellen umfassen auch Stammzellen, wie zum Beispiel embryonale Stammzellen, induzierte pluripotente Stammzellen, hämatopoietische Stammzellen (CD34+), neuronale Stammzellen und mesenchymale Stammzellen. Vektoren, die für die Einführung von Transgenen in Immunzellen (z. B. T-Zellen) geeignet sind, umfassen nicht-integrierende lentivirale Vektoren.
Bei der konventionellen Herstellung von T-Zellen basiert die Menge von dem zu verwendenden viralen Vektor häufig auf dem Titer der Virus-Charge, die auf einer Zelllinie wie 293T bestimmt wird. Unter Verwendung dieses Titers wird der Virus über einen Bereich der Infektionsmultiplizität [MOI - multiplicity of infection] getestet, bei dem es sich um das Verhältnis der Anzahl von Viruspartikeln zur Anzahl von Zielzellen, die in einem definierten Raum vorhanden sind, handelt, wenn auf eine Gruppe von Zellen verwiesen wird, die mit Viruspartikeln angeimpft wurden. Der höchste MOI Wert in dem linearen Bereich kann als der optimale MOI ausgewählt werden. Jedoch kann dieses Verfahren viel Raum für Abweichungen lassen, weil eine Tumorzelllinie, z. B. 293T für die Bestimmung des Titers und eine Titer-abhängige Variable (MOI) verwendet werden. Ausführungsformen der vorliegenden Offenbarung können Verfahren für die Bestimmung des optimalen Virus-Volumens umfassen, die bei der Herstellung und der Feststellung der Wirksamkeit von unterschiedlichen viralen Vektor-Chargen angewendet werden. Zum Beispiel können anstelle von Zelllinien wie zum Beispiel 293T-Zellen primäre humane T-Zellen von gesunden Spendern verwendet werden, indem man demselben T-Zell-Herstellungsprozess in kleinem Maßstab folgt, z. B. 1-2 Millionen Zellen in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte G-Rex (2 cm²), wobei der Herstellungsprozess in mittlerem Maßstab z. B. 5 Millionen Zellen in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte G-Rex (10 cm²) umfassen kann oder Herstellungsprozess in großem Maßstab 50 Millionen Zellen in einem G-Rex 100 (100 cm²) umfassen kann. Die Skala für einen guten Herstellungsprozess [GMP - Good Manufacturing Process] kann mit 250-400 Millionen Zellen in 5-8 G-Rex100 beginnen. Die Anzeigen, die man von verschiedenen Skalen erhalten hat, können für die klinische Herstellung direkt relevant sein.
Als solches können Verfahren der vorliegenden Offenbarung robuster als konventionelle Verfahren sein, die etablierte Zelllinien verwenden, um einen optimalen MOI zu erhalten und können Abweichungen reduzieren, wenn multiple lentivirale Vektor-Chargen für die Herstellung derselben T-Zell-Produkte benötigt werden.
Ein „exogenes“ Molekül ist ein Molekül, das normalerweise nicht in einer Zelle vorhanden ist, aber durch ein oder mehrere genetische, biochemische oder andere Verfahren in eine Zelle eingeführt werden kann. „Normale Anwesenheit in der Zelle“ wird im Hinblick auf das spezielle Entwicklungsstadium und die Umweltbedingungen der Zelle bestimmt. Daher handelt es sich zum Beispiel bei einem Molekül, das nur während der Embryonalentwicklung des Muskels vorhanden ist um ein exogenes Molekül im Hinblick auf eine adulte Muskelzelle. Entsprechend ist ein durch einen Hitzeschock induziertes Molekül im Hinblick auf eine Zelle, die keinem Hitzeschock ausgesetzt war, ein exogenes Molekül. Ein exogenes Molekül kann zum Beispiel eine funktionierende Version eines nicht-funktionierenden endogenen Moleküls oder eine nicht-funktionierende Version eines normal funktionierenden endogenen Moleküls umfassen.
Ein exogenes Molekül kann, unter Anderem, ein kleines Molekül sein, wie es zum Beispiel durch einen kombinatorischen chemischen Prozess erzeugt wird oder ein Makromolekül, wie zum Beispiel ein Protein, eine Nukleinsäure, ein Kohlenhydrat, ein Lipid, ein Glykoprotein, ein Lipoprotein, ein Polysaccharid, ein beliebiges modifiziertes Derivat eines der oben aufgeführten Moleküle oder ein beliebiger Komplex, der eines oder mehrere der oben aufgeführten Moleküle umfasst. Nukleinsäuren umfassen DNA und RNA, können einzelsträngig oder doppelsträngig sein, können linear, verzweigt oder ringförmig sein und können alle Längen aufweisen. Einige Nukleinsäuren sind in der Lage, Duplexmoleküle sowie Triplexmoleküle zu bilden. Siehe, zum Beispiel, US-Patent Nummern 5,176,996 und 5,422,251. Proteine umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, DNA-bindende Proteine, Transkriptionsfaktoren, chromatinremodellierende Faktoren, methylierte DNA-bindende Proteine, Polymerasen, Methylasen, Demethylasen, Acetylasen, Deacetylasen, Kinasen, Phosphatasen, Integrasen, Rekombinasen, Ligasen, Topoisomerasen, Gyrasen und Helikasen.
Ein exogenes Molekül kann derselbe Molekültyp wie ein endogenes Molekül sein, z. B. ein exogenes Protein oder eine Nukleinsäure. Zum Beispiel kann eine exogene Nukleinsäure ein infizierendes Virus-Genom, ein Plasmid oder ein Episom umfassen, das in eine Zelle eingeführt worden ist oder ein Chromosom, das normalerweise in der Zelle nicht vorhanden ist. Verfahren für die Einführung von exogenen Molekülen in Zellen sind den Fachleuten bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Lipid-vermittelte Übertragung (d. h. Liposomen, einschließlich neutralen und kationischen Lipiden), Elektroporation, direkte Injektion, Zellfusion, Partikelbombardierung, Kalziumphosphat-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Übertragung und die virale Vektor-vermittelte Übertragung.
Dagegen ist ein „endogenes“ Molekül ein Molekül, das normalerweise in einer bestimmten Zelle in einem bestimmten Entwicklungsstadium unter bestimmten Umweltbedingungen vorhanden ist. Zum Beispiel kann eine endogene Nukleinsäure ein Chromosom, das Genom eines Mitochondriums, einen Chloroplasten oder eine andere Organelle oder eine natürlich vorkommende episomale Nukleinsäure umfassen. Zusätzliche endogene Moleküle können Proteine, zum Beispiel Transkriptionsfaktoren und Enzyme umfassen.
Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung umfasst ein „Gen“ einen DNA-Abschnitt, der ein Genprodukt (siehe unten) sowie alle DNA-Regionen kodiert, welche die Erzeugung des Genprodukts regulieren, unabhängig davon, ob diese regulatorischen Sequenzen direkt neben kodierenden und/oder transkribierten Sequenzen liegen. Demgemäß umfasst ein Gen, aber ist nicht notwendigerweise beschränkt auf, Promotorsequenzen, Terminatoren, translatorischen regulatorischen Sequenzen wie zum Beispiel Ribosom-bindende Stellen und interne Ribosom-Eintritts-Stellen, Enhancer, Silencer, Isolatoren, Randelemente, Replikationsursprünge, Matrix-Verbindungsstellen und Locus-Kontrollregionen.
„Gen-Expression“ bezieht sich auf die Umwandlung der Informationen, die in einem Gen vorhanden sind, in ein Genprodukt. Ein Genprodukt kann das direkte transkriptorische Produkt eines Gens (z. B. mRNA, tRNA, rRNA, Antisense-RNA, Ribozyme, strukturelle RNA oder irgendein anderer Typ von RNA) oder ein Protein, das durch die Translation einer mRNA erzeugt wurde, sein. Genprodukte umfassen auch RNAs, welche durch Prozesse wie z. B. Capping, Polyadenylierung, Methylierung und Editing modifiziert werden und Proteine, die zum Beispiel durch Methylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung, ADP-Ribosylierung, Myristilierung und Glykosylierung modifiziert werden.
„Modulierung“ der Gen-Expression bezieht sich auf eine Änderung in der Aktivität eines Gens. Die Modulierung der Expression kann eine Gen-Aktivierung und Gen-Repression umfassen, ist aber nicht darauf beschränkt. Die Modulierung kann auch vollständig sein, d. h. dass die Gen-Expression völlig inaktiviert oder auf Wildtypniveau oder darüber hinaus aktiviert wird oder sie kann teilweise erfolgen, wobei die Gen-Expression auf einen Bereich des Wildtypniveaus teilweise reduziert oder teilweise aktiviert wird.
Die Begriffe „Nukleinsäure“, „Polynukleotid“ und „Oligonukleotid“ werden austauschbar verwendet und beziehen sich auf ein Deoxyribonukleotid oder Ribonukleotidpolymer in linearer oder ringförmiger Anordnung und entweder in einzel- oder doppelsträngiger Form. Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung sollten diese Begriffe nicht als limitierend im Hinblick auf die Länge eines Polymers ausgelegt werden. Die Begriffe können bekannte Analoge von natürlichen Nukleotiden umfassen sowie Nukleotide, die bezüglich der Basen-, Zucker- und/oder Phosphatreste (z. B. Phosphorothioatgerüste) modifiziert wurden. Im Allgemeinen weist ein Analog eines bestimmten Nukleotids dieselbe Spezifität bezüglich der Basenpaarung auf; d. h. ein Analog von A wird mit T eine Basenpaarung eingehen.
Die Begriffe „Polypeptid“, „Peptid“ und „Protein“ werden austauschbar verwendet, um auf ein Polymer aus Aminosäureresten hinzuweisen. Der Begriff bezieht sich auch auf Aminosäurepolymere, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren chemische Analoge oder modifizierte Derivate von entsprechenden, natürlich vorkommenden Aminosäuren sind.
Der Begriff „Sequenz“ bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz jeglicher Länge, bei der es sich um DNA oder RNA handeln kann und die linear, ringförmig oder verzweigt und entweder einzel- oder doppelsträngig sein kann. Der Begriff „Spendersequenz“ bezieht sich auf eine Nukleotidsequenz, welche in ein Genom aufgenommen wird. Eine Spender-Sequenz kann jede Länge haben, zum Beispiel eine Länge zwischen 2 und 10.000 Nukleotiden (oder irgendein ganzzahliger Wert innerhalb oder über diesem Intervall) und bevorzugt eine Länge zwischen ungefähr 100 und 1.000 Nukleotiden (oder irgendeine ganze Zahl in diesem Intervall), noch bevorzugter mit einer Länge zwischen ungefähr 200 und 500 Nukleotiden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Chargen
Engineering (Eng Run) und GMP (GMP Run) Chargen können zwei Chargen von lentiviralen Vektoren sein, die von LENTIGEN erhalten wurden. Engineering-Chargen können der GMP-Charge ähneln (jede davon 32L, aber die Qualitätskontrollen und Freigabespezifikationen können für die GMP-Charge strenger sein). Präklinische Chargen (nicht gezeigt) können kleinere Vektor-Chargen-Zubereitungen (4L) als Eng Run und GMP Run sein. Titer, zum Beispiel für die prä-klinische Charge, die Engineering Charge und GMP Charge können jeweils 1,1×10⁹ TU/ml, 1,9×10⁹ TU/ml, und 9,9×10⁹ TU/ml sein.
Ähnliche Transduktionseffizienz zwischen verschiedenen Chargen auf der Grundlage von volumetrischen Konzentrationen
Die Transduktion von T-Zellen von gesunden Spendern mit einem lentiviralen Vektor, der R7P1D5 TCR (LV-R73) exprimiert, kann durchgeführt werden, indem T-Zellen mit immobilisierten anti-CD3/anti-CD28 Antikörpern (Invitrogen) aktiviert werden, wobei die Zellen in TexMACS Medien (Miltenyi), 5% humanem AB Serum mit IL-7 und IL-15 kultiviert werden. Dieser Vorgang bewahrte einen frühen T-Zellen Differenzierungsphänotyp (T naive/scm: CD45RA+CD62L+ CCR7+, CD28+CD27+) und die transduzierten Zellen zeigten eine Proliferation, welche der Proliferation von nicht-transduzierten T-Zellen vergleichbar war.
Anzahl an Kopien
Die Anzahl an Kopien bezieht sich auf die Quantifizierung des proviralen Vektor-Genoms in der extrahierten genomischen DNA von dem T-Zell-Produkt und deren Normalisierung durch die Menge eines Referenzgens mit einer bekannten Anzahl an Kopien. Das am häufigsten angewendete Verfahren, um die Anzahl an Kopien festzustellen, ist eine quantitative Echtzeit-pCR (qPCR), die auf einer Standard TaqMan Plattform (Applied Systems) basiert. Daher kann sich die Anzahl an Kopien auf die durchschnittliche Anzahl an integrierten Vektor-Sequenzen beziehen, die in der genomischen DNA aufgefunden wurden, die unter Verwendung der quantitativen PCR aus den T-Zell-Produkten isoliert wurden. Genomische DNA kann unter Verwendung eines Primer/Gensonden-Assays, der für den lentiviralen Vektor und das Haushaltsgen (house-keeping gene) spezifisch ist, aus den T-Zellen isoliert und vermehrt werden. Zum Beispiel kann ein qPCR Assay für die Bestimmung der Anzahl an Kopien verwendet werden, um in Lentivektoren integrierte Genome in Bezug auf ein endogenes Referenzgen (Albumin) zu quantifizieren. Die Wirksamkeit und Sicherheit von T-Zell-Produkten werden durch die durchschnittliche Anzahl an Kopien bestimmt. Eine höhere Integration führt im Allgemeinen zu einer höheren Expression von Transgenen, aber sie erhöht auch das Risiko einer Insertionsmutagenese. FDA-Verordnungen beschreiben eine durchschnittliche Anzahl an Kopien von 5 oder weniger in dem Sicherheitsdatenblatt für zelluläre Produkte. Daher kann die Anzahl an Kopien als ein kritischer Parameter bei der Bestimmung der Wirksamkeit einer LV-Charge und der optimalen volumetrischen Konzentration für die klinische Herstellung betrachtet werden.
Die Zellkonzentration während der Transduktion wurde auf ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml festgelegt. 1A, 1C und 1E (durchgezogene Linien) zeigen primäre T-Zellen, die von 3 gesunden Spendern erhalten wurden, d.h. jeweils Spender 6, Spender 7 und Spender 9, die mit steigenden volumetrischen Konzentrationen des Lentivirus (LV)-R73 transduziert wurden, zeigen steigende und vergleichbare Anzahlen an Kopien von integriertem LV-R73 zwischen Engineering-Chargen (Eng Run) und GMP-Chargen (GMP Run) in einer Weise, die von der volumetrischen Konzentration abhängig ist, d.h. 0,01 µl, 0,1 µl, 1,0 µl, 10 µl und 100 µl von LV-R73 pro 1,0 ml an Transduktionsmischung, die ungefähr 2 × 10⁶ Zellen enthalten kann.
Im Gegensatz dazu, wie in den 1B, 1D und 1F (durchgezogene Linien) gezeigt, wurden signifikante Unterschiede bei den Anzahlen an Kopien von integriertem LV-R73 zwischen Eng Run und GMP Run jeweils von Spender 6, Spender 7 und Spender 9 mit steigendem MOI erhalten.
Diese Ergebnisse zeigen, dass auf der Grundlage von volumetrischen Konzentrationen vergleichbare Anzahlen an Kopien von integrierten lentiviralen Vektoren zwischen zwei Vektor-Herstellungschargen von LV-R73 (Engineering Charge und GMP Charge) erhalten wurden.
Expression von Transgenen
Die Expression von Transgenen bezieht sich auf das Auffinden von transgenetischer TCR auf der Oberfläche von T-Zellen mittels der Durchflusszytometrie, wobei ein spezifisches HLA-Dextramer verwendet wird. Ergebnisse werden als Prozentsatz von Dextramer+ve Zellen der Gesamtheit der CD3+CD8+ Zellen (% von Dex+) dargestellt.
T-Zellen, die durch LV-R73 transduziert wurden, werden auf ihre Bindung an ein MHC HLA-A2-Peptid-Dextramer getestet. Das MHC Dextramer (Dex) kann ein Dextran-Polymer-Gerüst enthalten, das eine optimierte Anzahl an MHC und Fluorochrom-Molekülen enthält. MHC Dextramer-Reagenzien tragen mehr MHC Moleküle und mehr Fluorochrome als herkömmliche MHC Multimere. Dies erhöht die Avidität für die spezifische T-Zelle und verbessert die Färbungsintensität und erhöht damit die Auflösung und das Signal-Rausch-Verhältnis. Zum Färben wurde das vom Hersteller bereitgestellte Protokoll befolgt. Proben wurden auf dem MACS Quant Analyzer (Miltenyl) erfasst und die Daten wurden mittels der Flow Jo Software analysiert.
1A, 1C und 1E (gestrichelte Linien) zeigen primäre T-Zellen, die von 3 gesunden Spendern erhalten wurden, d.h. jeweils Spender 6, Spender 7 und Spender 9 die mit LV-R73 transduziert wurden, zeigen steigende und vergleichbare Niveaus an Transgenen, z. B. R73 TCR, Expression (% von Dex⁺) zwischen großformatigen Engineering Chargen (Eng Run) und GMP Chargen (GMP Run) in einer Weise, die von der volumetrischen Konzentration abhängig ist, d. h. 0,01 µl, 0,1 µl, 1,0 µl, 10 µl und 100 µl von LV-R73 pro 1,0 ml an Transduktionsmischung, die ungefähr 2 × 10⁶ Zellen enthalten kann.
Wenn jedoch % von Dex+ Zellen zwischen Eng Run und GMP Run auf der Grundlage von MOI-Werten, die durch Virus-Titer bestimmt wurden, verglichen werden, unterschieden sich die zwei Chargen (Eng Run und GMP Run) erheblich, wie in den 1B, 1D und 1F (gestrichelte Linien) gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, dass auf der Grundlage von volumetrischen Konzentrationen zwei Vektor-Herstellungschargen von LV-R73 (Engineering Charge und GMP Charge) eine vergleichbare Expression von Transgenen (% Dextrame+ve von CD3+CD8+ Zellen) in primären T-Zellen verursachen, die von gesunden Spendern abgeleitet wurden.
Optimierung der volumetrischen Virus-Konzentration für die Transduktion von T-Zellen
Nach einem Vergleich über einen großen Bereich, zum Beispiel von 0,01 bis 100 µl, wie in den 1A-1F gezeigt, werden einige wenige volumetrische Konzentrationen für ein weiteres Screenen in primären T-Zellen, die von mehreren gesunden Spendern erhalten wurden, ausgewählt. Durchgänge für die T-Zell-Herstellung im kleinen, mittleren und großen Maßstab wurden unter Auswählen von volumetrischen Konzentrationen, zum Beispiel 5 µl, 7,5 µl und 10 µl, durchgeführt.
Die Zellkonzentration während der Transduktion wurde auf ungefähr 2 × 10⁶ Zellen/ml festgelegt. Primäre T-Zellen, die von 10 gesunden Spendern erhalten wurden, wurden mit LV-R73 bei steigenden volumetrischen Virus-Konzentrationen, zum Beispiel 5 µl, 7,5 µl und 10 µl von LV-R73 pro 0,5 ml Transduktionsmischung transduziert, die ungefähr 1 × 10⁶ Zellen enthalten kann. Die Expression von Transgenen und das Integrieren der Anzahl an Kopien des viralen Vektors, zum Beispiel LV-R73 wurden, wie oben beschrieben, 8 Tage und 10 Tage nach der Transduktion bestimmt.
2 zeigt die durchschnittliche Expression von Transgenen (%Dex⁺) in transduzierten T-Zellen von 10 Spendern (offene und geschlossene Vierecke), die in einer Weise ansteigen, die von der volumetrischen Konzentration abhängt. Das heißt, 5 µl von LV-R73 pro 0,5 ml der Transduktionsmischung ergaben die niedrigste Durchschnittsmenge der transduzierten T-Zellen, die das Transgen exprimieren und 10 µl von LV-R73 pro 0,5 ml von Transduktionsmischung ergaben die höchste Durchschnittsmenge der transduzierten T-Zellen, die das Transgen exprimieren. Darüber hinaus ändert sich die Durchschnittsmenge der transduzierten T-Zellen, die das Transgen exprimieren, nicht bedeutend im Zeitraum von 8 bis 10 Tagen nach der Transduktion bei jeder volumetrischen Konzentration.
3 zeigt die durchschnittliche Anzahl an Kopien eines viralen Vektors, zum Beispiel LV-R73 in transduzierten T-Zellen von 10 Spendern (offene und geschlossene Vierecke), die in einer Weise ansteigen, die von der volumetrischen Konzentration abhängt. Das heißt, 5 µl von LV-R73 pro 0,5 ml der Transduktionsmischung ergaben die niedrigste Durchschnittsmenge von Integrationskopien des viralen Vektors und 10 µl von LV-R73 pro 0,5 ml von Transduktionsmischung ergaben die höchste Durchschnittsmenge von Integrationskopien des viralen Vektors. Jedoch sinkt die durchschnittliche Anzahl an Integrationskopien im Zeitraum von 8 bis 10 Tagen nach der Transduktion bei jeder volumetrischen Konzentration. Diese Ergebnisse zeigen, dass, obwohl die durchschnittliche Anzahl an Integrationskopien 10 Tage nach der Transduktion abnimmt, die durchschnittliche Menge der transduzierten T-Zellen, die das Transgen exprimieren, vergleichbar zu der Menge 8 Tage nach der Transduktion bleibt.
Diese Ergebnisse zeigen eine volumetrische Virus-Konzentration, die beständig einen Maximum % HLA-Multimer+ve Zellen über verschiedene Spender und Skalen aufweist, ohne die Anzahl an Kopien von 5 zu übersteigen, die als optimale volumetrische Virus-Konzentration für die klinische Herstellung ausgewählt werden kann.
4 zeigt ein Verfahren (40) für das Transduzieren von T-Zellen für die Immuntherapie gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung einschließlich dem Erhalten von T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern (41), dem Aktivieren der T-Zellen mit einem anti-CD3 Antikörper und einem anti-CD28 Antikörper (42), Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen (43), Vermehren der transduzierten T-Zellen (44), z. B. für 4-6 Tage, Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an integrierten Transgenen in den vermehrten T-Zellen bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen (45) exprimieren, Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die eine maximale Durchschnittsmenge der transduzierten T-Zellen ergibt, die das Transgen und/oder eine maximale durchschnittliche Anzahl an Kopien von integrierten Transgenen in jeder der vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern (46) exprimieren und Transduzieren der T-Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, bei dem der virale Vektor bei der identifizierten volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie (47) liegt.
Vorteile der vorliegenden Offenbarung können Verfahren umfassen, die genau die Menge an lentiviralem Vektor definieren können, der während der Herstellung des T-Zell-Produkts verwendet wird, wobei derselbe Prozess, wie bei der Herstellung des T-Zell-Produkts, angewendet wird. Als solches können Verfahren der vorliegenden Offenbarung robuster als konventionelle Verfahren sein, die etablierte Zelllinien verwenden, um einen optimalen MOI zu erhalten und können Abweichungen reduzieren, wenn multiple lentivirale Vektor-Chargen für die Herstellung derselben T-Zell-Produkte benötigt werden.
Alle in dieser Spezifikation zitierten Referenzen werden vorliegend durch Hinweis aufgenommen, als ob aufgezeigt wurde, dass jede Referenz spezifisch und einzeln durch Hinweis aufgenommen werden sollte. Die Nennung von einem Referenz dient dessen Offenbarung vor dem Anmeldedatum und sollte nicht als Einräumung ausgelegt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht dafür berechtigt ist, solch eine Referenz aufgrund einer vorherigen Erfindung vorzudatieren
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

US 6248514 [0005]
US 7476507 [0005]
US 20170166866 [0007]
US 20170023570 [0008]
US 5994136 [0041]
US 6165782 [0041]
US 6428953 [0041]
US 2009/0117617 [0041]

Claims

Folgendes wird beansprucht:
Verfahren für das Transduzieren von T-Zellen für die Immuntherapie, das folgendes umfasst: (a) Erhalten von T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person, (b) Aktivieren der T-Zellen mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28 Antikörper, Transduzieren der aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen, (c) Vermehren der transduzierten T-Zellen, (d) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren; (e) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person zu überschreiten, und (f) Transduzieren von T-Zellen, die von einem Patienten erhalten wurden, mit dem viralen Vektor bei der identifizierten volumetrischen Konzentration für die Immuntherapie.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor handelt, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor handelt, der einen TCR exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, wobei die Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 1,0 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 2,5 ml einer Transduktionsmischung und ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
Das Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Transduktionsmischung eine Zellkonzentration von ungefähr 0,1 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 5,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml oder von ungefähr 5,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, wobei die T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern erhalten werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-6, welches das Vermehren von transduzierten T-Zellen umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-7, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der transduzierten T-Zellen ergibt, welche das Transgen in den vermehrten T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person exprimieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien der integrierten Transgene in den vermehrten T-Zellen von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person ergibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, wobei die identifizierte volumetrische Konzentration aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 1 µl bis ungefähr 50 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 5 µl bis ungefähr 15 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, und ungefähr 8 µl bis ungefähr 12 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, wobei der zu behandelnde Patient ein Krebspatient ist.
Das Verfahren nach Anspruch 11, wobei der Krebs aus der folgenden Gruppe von Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom (HCC), kolorektales Karzinom (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), Pankreaskrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartige Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasen-Karzinom (UBC), akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1-12, wobei die T-Zellen, die von mindestens einem Spender, Patienten oder einer Person erhalten wurden, CD8⁺-T-Zellen sind.
Verfahren zum Behandeln eines Patienten, welches das Verabreichen von T-Zellen, die bei einer volumetrischen Konzentration mit einem viralen Vektor transduziert werden, umfasst, wobei die T-Zellen von dem Patienten erhalten werden, wobei die volumetrische Konzentration bestimmt wird durch (a) Erhalten von T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern, (b) Aktivieren der T-Zellen, die von Schritt (a) erhalten wurden, mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, der die aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen transduziert, (c) Vermehren der transduzierten T-Zellen, die von Schritt (b) erhalten wurden, (d) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen, die von Schritt (c) erhalten wurden, bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren; (e) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens, das durch Schritt (d) gemessen wird, zu überschreiten, und (f) Transduzieren von T-Zellen, die mit dem viralen Vektor bei der durch Schritt (e) identifizierten volumetrischen Konzentration von dem Patienten erhalten wurden.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor handelt, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
Verfahren nach Ansprüchen 14 oder 15, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor handelt, der einen TCR exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-16, wobei die Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 1,0 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 2,5 ml einer Transduktionsmischung und ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Transduktionsmischung eine Zellkonzentration von ungefähr 0,1 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 5,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml, oder von ungefähr 5,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-18, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der transduzierten T-Zellen ergibt, welche das Transgen in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern exprimieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-19, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern ergibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 15-20, wobei die identifizierte volumetrische Konzentration aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 1 µl bis ungefähr 50 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 5 µl bis ungefähr 15 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, und ungefähr 8 µl bis ungefähr 12 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-21, wobei der Patient Krebs hat.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Krebs aus der folgenden Gruppe von Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom (HCC), kolorektales Karzinom (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), Pankreaskrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartige Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasen-Karzinom (UBC), akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC).
Verfahren nach einem der Ansprüche 14-23, wobei die T-Zellen, die sowohl von der Vielzahl von gesunden Spendern als auch dem Patienten erhalten wurden, CD8⁺ T-Zellen sind.
T-Zellen, die für eine Immuntherapie bei einer volumetrischen Konzentration mit einem viralen Vektor transduziert werden. wobei die T-Zellen von einem Patienten erhalten werden, wobei die volumetrische Konzentration bestimmt wird durch (a) Erhalten von T-Zellen von einer Vielzahl von gesunden Spendern, (b) Aktivieren der T-Zellen, die von Schritt (a) erhalten wurden, mit einem Anti-CD3 Antikörper und einem Anti-CD28-Antikörper, der die aktivierten T-Zellen mit einem viralen Vektor bei einer Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen transduziert, (c) Vermehren der transduzierten T-Zellen, die von Schritt (b) erhalten wurden, (d) Messen einer Menge der vermehrten T-Zellen, die das Transgen und/oder eine Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in jeder der vermehrten T-Zellen, die von Schritt (c) erhalten wurden, bei der Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen exprimieren; (e) Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der vermehrten T-Zellen ergibt, welche das Transgen und/oder einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens exprimieren, ohne fünf Kopien des integrierten Transgens, das durch Schritt (d) gemessen wird, zu überschreiten, und (f) Transduzieren von T-Zellen, die mit dem viralen Vektor bei der durch Schritt (e) identifizierten volumetrischen Konzentration von dem Patienten erhalten wurden.
T-Zellen nach Anspruch 25, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen retroviralen Vektor handelt, der einen T-Zell-Rezeptor (TCR) exprimiert.
T-Zellen nach Ansprüchen 25 oder 26, wobei es sich bei dem viralen Vektor um einen lentiviralen Vektor handelt, der einen TCR exprimiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 25-27, wobei die Vielzahl von volumetrischen Konzentrationen aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 1,0 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 2,5 ml einer Transduktionsmischung und ungefähr 0,01 µl bis ungefähr 1 ml pro 5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Transduktionsmischung eine Zellkonzentration von ungefähr 0,1 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 0,5 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 5,0 × 10⁶ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml, von ungefähr 1,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml, oder von ungefähr 5,0 × 10⁷ Zellen/ml bis ungefähr 1,0 × 10⁸ Zellen/ml umfasst.
T-Zellen nach einem der Ansprüche 25-29, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Menge der transduzierten T-Zellen ergibt, welche das Transgen in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern exprimieren.
T-Zellen nach einem der Ansprüche 25-29, wobei das Identifizieren der volumetrischen Konzentration, die einen maximalen Durchschnitt der Anzahl an Kopien des integrierten Transgens in den vermehrten T-Zellen von der Vielzahl von gesunden Spendern ergibt.
T-Zellen nach einem der Ansprüche 25-31, wobei die identifizierte volumetrische Konzentration aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus ungefähr 1 µl bis ungefähr 50 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, ungefähr 5 µl bis ungefähr 15 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung, und ungefähr 8 µl bis ungefähr 12 µl pro 0,5 ml einer Transduktionsmischung besteht.
T-Zellen nach einem der Ansprüche 25-32, wobei der Patient Krebs hat.
Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Krebs aus der folgenden Gruppe von Erkrankungen ausgewählt: hepatozelluläres Karzinom (HCC), kolorektales Karzinom (CRC), Glioblastom (GB), Magenkrebs (GC), Ösophaguskarzinom, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (NSCLC), Pankreaskrebs (PC), Nierenzellkarzinom (RCC), gutartige Prostatahyperplasie (BPH), Prostatakrebs (PCA), Eierstockkrebs (OC), Melanom, Brustkrebs, chronische lymphozytische Leukämie (CLL), Merkelzellkarzinom (MCC), kleinzelliger Lungenkrebs (SCLC), Non-Hodgkin-Lymphom (NHL), akute myeloische Leukämie (AML), Gallenblasenkrebs und Cholangiokarzinom (GBC, CCC), Harnblasen-Karzinom (UBC), akute lymphoblastische Leukämie (ALL) und Gebärmutterkrebs (UEC).
Population von T-Zellen, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1-13.
Population von T-Zellen, hergestellt durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 14-24.