CN111929383A - 一种测定血浆中（z）-阿枯米定碱浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定血浆中（Z）‑阿枯米定碱浓度的方法，采用液质联用系统测定，先取待测样品，加入一定量的有机溶媒蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀，预处理后，经色谱柱分离，用质谱检测器检测，本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，适合于测定血浆中（Z）‑阿枯米定碱的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法。
背景技术
（Z）-阿枯米定碱（（Z）-Akuammidine）是从马钱科胡蔓藤属植物钩吻（Gelsemiumelegans Benth.）的干燥根和根茎中分离得到的生物碱类新化合物。体外实验证明（Z）-阿枯米定碱具有显著的抗肿瘤、免疫调节、镇痛镇静等生物活性，是一种具有良好开发前景的新药源化合物。其结构式如图1所示。
目前尚未关于（Z）-阿枯米定碱体内测定方法的文献报道。本发明建立了（Z）-阿枯米定碱在大鼠体内的测定方法，通过该方法对（Z）-阿枯米定碱的药物代谢情况进行探索性研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是建立一种准确、高效测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
一种测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：
（1）血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；
（2）将步骤（1）预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18柱；流动相：体积比为85:15的乙腈与0.1%甲酸水溶液；流速：0.2-0.5 mL•min-1；柱温：30-40 ℃；进样量：5 μL；洗脱方式为等度洗脱；
（3）质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；离子源电压：4500 V；离子源温度：400 ℃；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas 1：50 psi；离子源Gas 2：60 psi；CXP：9 V；EP：10 V；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：（Z）-阿枯米定碱，[M-H]+，m/z 353.3→166.1，Dwell150，DP 100，Collision Energy 40；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.1→121.2，Dwell 150，DP 80，Collision Energy 20。
（4）计算：采用内标法，以（Z）-阿枯米定碱和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算（Z）-阿枯米定碱的浓度。
步骤（1）中，取血浆样品50 μL，加入内标50 ng•mL-1替硝唑甲醇溶液10 μL和200 μL甲醇或乙腈，振荡3 min，12000 rpm离心10 min，离心后取上清液。
步骤（2）中，色谱柱长度为100 mm，内径为3.0 mm，填料粒径为3.5m。
其中，所述的血浆为给予了含（Z）-阿枯米定碱药物的血浆。
其中，所述血浆为人或动物的血浆。
其中，所述血浆为大鼠血浆。
有益效果：本发明方法与现有技术相比具有如下优势：
（1）预处理方法简便：一步有机溶媒蛋白沉淀法，适用于常规测定。
（2）专属性强：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱作为固定相，乙腈和水的混合液作为流动相，等度洗脱，（Z）-阿枯米定碱保留时间为0.46 min左右，内标替硝唑保留时间为0.47 min左右，1.5 min完成测定，内源性物质不干扰二者的测定。
（3）灵敏度高：血浆最低定量限为0.4 ng•mL-1。
（4）本发明方法快速、准确、灵敏度高、操作简便，为（Z）-阿枯米定碱的血药浓度测定提供依据，具有新药开发的前景。本方法的血浆标准曲线线性范围为0.4~320 ng•mL-1，日内和日间精密度RSD均小于6.13%。
附图说明
图1为（Z）-阿枯米定碱的结构式。
图2为（Z）-阿枯米定碱对照品的质谱图。
图3为替硝唑（内标）对照品的质谱图。
图4为大鼠空白血浆的色谱图。
图5为大鼠空白血浆加入（Z）-阿枯米定碱和内标对照品的色谱图。
图6为大鼠给予（Z）-阿枯米定碱后血浆样品再加入内标对照品的色谱图。
注：图中离子通道1为（Z）-阿枯米定碱，[M-H]+，m/z 353.3→166.1，保留时间为0.46 min左右；离子选择通道2为内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.1→121.2，保留时间为0.47min左右。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例：大鼠血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的测定
一、实验材料与仪器
（Z）-阿枯米定碱：分离自钩吻的干燥根和根茎；替硝唑（内标）：购于中国食品药品检定研究院，批号：100336-201704；试验用水：超纯水；甲醇：色谱纯（Merck Company）。
API 4000 LC-MS/MS三重四级杆质谱仪，配有电喷雾化离子源（ESI），色谱工作站：Analyst 1.6；Agilent 1200高效液相色谱仪；AE240电子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；MICRO-17R冷冻离心机（美国Thermo公司）；WH-2微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；Drict-Q5超纯水机（法国Millipore公司）。
二、液质条件
1. 液相色谱条件
色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（dp 3.5 m，100 mm ID×3.0 mm）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液（85:15，v/v）；流速：0.4 mL•min-1；柱温：35 ℃。
2. 质谱条件
离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；离子源电压：4500 V；离子源温度：400 ℃；气帘气Curtain gas：20 psi；离子源Gas 1：50psi；离子源Gas 2：60 psi；CXP：9 V；EP：10 V；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：（Z）-阿枯米定碱，[M-H]+，m/z 353.3→166.1，Dwell 150，DP 100，CollisionEnergy 40；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.1→121.2，Dwell 150，DP 80，Collision Energy20。
三、实验过程：
1. （Z）-阿枯米定碱标准溶液的配制：
精密称取（Z）-阿枯米定碱 11.81 mg，置于10 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得1.181 mg•mL-1 （Z）-阿枯米定碱的储备液。精密量取适量储备液以甲醇依次稀释，配成浓度分别为2、5、10、50、200、400、800、1600 ng•mL-1的（Z）-阿枯米定碱标准溶液。
2. 大鼠血浆样品的采集与处理：
大鼠尾静脉注射（Z）-阿枯米定碱溶液，给药量为1 mg•kg-1，于注射前及注射后5、10、20、30、45 min、1、2、2.5、3、4 h眼眶采血200 μL，注入肝素管内，3000 rpm离心10 min，制备血浆。取大鼠血浆50 μL，加入50 ng•mL-1内标替硝唑甲醇溶液10 μL，甲醇200 μL，振荡3min进行蛋白沉淀，12000 rpm离心10 min，上清液5 μL进样分析。
3. 专属性：
取没有给予过（Z）-阿枯米定碱的大鼠空白血浆50 μL，加入210 μL甲醇，振荡3 min进行蛋白沉淀，12000 rpm离心10 min，上清液5 μL进样分析。
取1.5 mL塑料离心管数支，加入（Z）-阿枯米定碱标准溶液10 μL，40 ℃氮气吹干，加入没有给予过（Z）-阿枯米定碱的大鼠空白血浆50 μL，旋涡30 s混匀，加入替硝唑甲醇溶液（内标，50 ng•mL-1）10 μL，甲醇200 μL，振荡3 min进行蛋白沉淀，12000 rpm离心10 min，上清液5 μL进样分析。
如图2至6，结果显示，在本实验所采用的LC-MS/MS条件下，血浆样品无杂峰对检测组分造成干扰，（Z）-阿枯米定碱保留时间在0.46 min左右，内标替硝唑保留时间在0.47min左右。（Z）-阿枯米定碱和内标互不干扰，峰形良好，基线平稳。
4. 线性试验
大鼠血浆标准曲线：取1.5 mL塑料离心管数支，分别精密加入不同浓度的（Z）-阿枯米定碱标准溶液10 μL，40 ℃氮气吹干，加入没有给予过（Z）-阿枯米定碱的大鼠空白血浆50μL旋涡30 s混匀，配成含（Z）-阿枯米定碱的浓度分别为0.4、1、2、10、40、80、160、320 ng•mL-1的含药血浆。加入替硝唑甲醇溶液（内标，50 ng•mL-1）10 μL，甲醇200 μL，振荡3 min进行蛋白沉淀，12000 rpm离心10 min，上清液5 μL进样分析。计算（Z）-阿枯米定碱和内标峰面积的比值ƒ，以峰面积比值ƒ对血药浓度C作回归计算，得回归方程：ƒ = 0.0123×C－0.0014（r = 0.9993），W=1/cc，（Z）-阿枯米定碱血浆浓度在0.4~320 ng•mL-1范围内线性关系良好。最低定量限为0.4 ng•mL-1。
5. 准确度和精密度
按照大鼠血浆标准曲线方法配制含（Z）-阿枯米定碱浓度为0.8、120、240 ng•mL-1的低、中、高的含（Z）-阿枯米定碱血浆样品，按“大鼠血浆样品的处理”处理方法分别处理。连续做3天，每天每个浓度各做5份样品，计算（Z）-阿枯米定碱峰面积As和内标峰面积Ai的比值ƒ，代入当天的血浆标准曲线中求得（Z）-阿枯米定碱实测浓度，由实测浓度计算日内、日间精密度和相对标准偏差（RSD），实测浓度与加入浓度的比值即为准确度。结果显示，日内和日间精密度RSD均小于6.13%，准确度符合要求。
6. 测定结果
上述6只给予过（Z）-阿枯米定碱的大鼠血浆中（Z）-阿枯米定碱含量（给药后30 min）分别为22.23、28.61、19.55、21.98、18.87、29.45 ng•mL-1。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，血浆样品经预处理后经液质联用系统检测其浓度，具体方法包括如下步骤：
（1）血浆样品预处理：取血浆样品，加入内标替硝唑甲醇溶液，加入甲醇或乙腈进行蛋白沉淀，离心后取上清液；
（2）将步骤（1）预处理后的血浆样品进行液相色谱分离：色谱条件中色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18柱；流动相：体积比为85:15的乙腈与0.1%甲酸水溶液；流速：0.2-0.5 mL•min-1；柱温：30-40 ℃；进样量：5 μL；洗脱方式为等度洗脱；
（3）质谱测定，条件为：离子源：电喷雾离子化电离源ESI；离子检测方式：多反应监测MRM；离子极性：正离子；离子源电压：4500 V；离子源温度：400 ℃；气帘气Curtain gas：20psi；离子源Gas 1：50 psi；离子源Gas 2：60 psi；CXP：9 V；EP：10 V；脱溶剂气和锥孔气均为高纯氮气；检测对象的离子通道：（Z）-阿枯米定碱，[M-H]+，m/z 353.3→166.1，Dwell150，DP 100，Collision Energy 40；内标替硝唑，[M-H]+，m/z 248.1→121.2，Dwell 150，DP 80，Collision Energy 20；
（4）计算：采用内标法，以（Z）-阿枯米定碱和内标替硝唑的峰面积比值代入标准曲线方程计算（Z）-阿枯米定碱的浓度。
2.根据权利要求1所述的测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，步骤（1）中，取血浆样品50 μL，加入内标50 ng•mL-1替硝唑甲醇溶液10 μL和200 μL甲醇或乙腈，振荡3 min，12000 rpm离心10 min，离心后取上清液。
3.根据权利要求1所述的测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，步骤（2）中，色谱柱长度为100 mm，内径为3.0 mm，填料粒径为3.5 m。
4.根据权利要求1所述的测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，所述的血浆为给予了含（Z）-阿枯米定碱药物的血浆。
5.根据权利要求1所述的测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，所述血浆为人或动物的血浆。
6.根据权利要求1所述的测定血浆中（Z）-阿枯米定碱浓度的方法，其特征在于，所述血浆为大鼠血浆。
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