CN111925978A - 一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法 - Google Patents

一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，采用CCK‑8法进行测试，在接种细胞悬液后，向每孔加入10μl营养液进行培养；所述营养液为20～40mmol/L的L‑谷氨酰胺；在CCK‑8细胞染色孵育后，向每孔加入10μl终止液以终止反应。本发明在进行细胞接种培养时加入适量营养液可促进细胞生长和分化增殖，缩短细胞预培养时间；在进行CCK‑8细胞毒性检测后，加入反应终止液，可有效控制反应时间，减少在做大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性测试时前后放置时间不一致所带来的实验误差。

Description

一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法
技术领域
本发明涉及医疗材料中甲醛体外毒理学评价研究领域。更具体地说，本发明涉及一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法。
背景技术
目前进行医疗材料中甲醛细胞毒性评价时采用的方法大多参考《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》(GB/T 16886.5-2017)，但标准相关的试验操作步骤较为烦琐、周期较长。
相较于《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》(GB/T 16886.5-2017)标准方法，CCK-8细胞毒性检测法具有灵敏度高，操作简单等特点。然而，在进行大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性测试实验时，CCK-8细胞毒性检测方法步骤中因无法控制反应时间，会影响实验结果的准确度且检测时间受限。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，在进行细胞接种培养时加入适量营养液可促进细胞生长和分化增殖，缩短细胞预培养时间；在进行CCK-8细胞毒性检测后，加入反应终止液，可有效控制反应时间，减少在做大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性测试时前后放置时间不一致所带来的实验误差。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，采用CCK-8法进行测试，在CCK-8细胞染色孵育后，向每孔加入10μl终止液以终止反应。
优选的是，在接种细胞悬液后，向每孔加入10μl营养液进行培养。
优选的是，所述营养液为20～40mmol/L的L-谷氨酰胺。
优选的是，所述终止液为盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液中的一种或多种。
优选的是，所述终止液为质量分数为1～2％的盐酸溶液。
优选的是，所述终止液为质量分数为2～3％的硫酸溶液。
优选的是，所述终止液为质量分数为3～5％的磷酸溶液。
优选的是，所述终止液为质量分数为2～4％体积比为1:1:1的盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液。
优选的是，包括：
使用含10％胎牛血清的MEM培养基扩增培养小鼠成纤维细胞L-929，经过质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化以后，制备细胞悬液(5×104～1×105个/ml)；96孔板中最外周36个孔每孔加100μl培养基，其余每孔加入90μl细胞悬液或培养基后，再加10μl浓度为20～40mmol/L的L-谷氨酰胺，转动96孔板，使细胞悬液与L-谷氨酰胺充分混合，37℃、5％CO2条件下预培养12～18h；
96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组，分别设置阳性对照组、甲醛污染组、空白对照组，在最外周36孔中设置一组背景对照组，其中，阳性对照组设置6个梯度浓度，分别包含1、5、25、50、75、100mg/L的甲醛溶液，甲醛污染组为10μl医疗材料浸提液；
将培养板在37℃、5％CO2的条件下孵育24h，再向每孔加入10μl CCK-8溶液，置于37℃、5％CO2的条件下孵育3h，最后加入10μl终止液以使反应及时终止，遮盖避光于2～8℃条件下保存，一周内使用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。
本发明至少包括以下有益效果：
向制备的细胞悬液中加入适量的L-谷氨酰胺，可使细胞得到修复的同时促进细胞生长和增殖，节省一定的预培养时间，提高培养效率；
进行CCK-8染色孵育后，加入终止液使反应及时终止，可增加检测其吸光度的时间间隔，在一周内完成吸光度检测即可，适用于大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测定。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例1中甲醛浓度与细胞存活率的关系曲线。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
20～40mmol/L L-谷氨酰胺：取适量L-谷氨酰胺溶于无菌水中，在超净工作台内，利用无菌注射器吸取过0.22μm膜后，每取1ml装于2ml无菌试管中，封口膜封口，冷冻保存。
质量分数为1～2％盐酸溶液：在超净工作台内，用无菌水配制1～2％盐酸溶液，利用无菌注射器吸取过0.22μm膜后，每取1ml装于2ml无菌试管中，封口膜封口保存。
质量分数为2～3％硫酸溶液：在超净工作台内，用无菌水配制2～3％硫酸溶液，利用无菌注射器吸取过0.22μm膜后，每取1ml装于2ml无菌试管中，封口膜封口保存。
质量分数为3～5％磷酸溶液：在超净工作台内，用无菌水配制3～5％磷酸溶液，利用无菌注射器吸取过0.22μm膜后，每取1ml装于2ml无菌试管中，封口膜封口保存。
质量分数为2～4％混合酸：在超净工作台内，用无菌水配制2～4％体积比为1:1:1的盐酸溶液、硫酸溶液、、磷酸溶液，利用无菌注射器吸取过0.22μm膜后，每取1ml装于2ml无菌试管中，封口膜封口保存。
<实施例1>
一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，包括以下步骤：
使用含10％胎牛血清的MEM培养基扩增培养小鼠成纤维细胞L-929，经过质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化以后，制备细胞悬液(5×104～1×105个/ml)；96孔板中最外周36孔每孔加100μl的MEM培养基，其余每孔加入90μl细胞悬液或MEM培养基后，再加10μl浓度为20mmol/L的L-谷氨酰胺，转动96孔板，使细胞悬液与L-谷氨酰胺充分混合，37℃、5％CO2条件下预培养18h；
96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组，分别设置阳性对照组、甲醛污染组、空白对照组，在最外周36孔中设置一组背景对照组，其中，阳性对照组设置6个梯度浓度，如图1所示，分别包含1、5、25、50、75、100mg/L的甲醛溶液，甲醛污染组为加入10μl医疗材料浸提液；
将培养板在37℃、5％CO2的条件下孵育24h，再向每孔加入10μl CCK-8溶液，置于37℃、5％CO2的条件下孵育3h，最后加入10μl质量分数为1％的盐酸作为终止液以使反应及时终止，遮盖避光于2～8℃条件下保存，一周内使用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。
<实施例2>
实施2的测试方法同实施例1，其中，不同的是，L-谷氨酰胺的浓度为40mmol/L；37℃、5％CO2条件下预培养12h；终止液为质量分数为2％的盐酸溶液。
<实施例3>
实施3的测试方法同实施例1，其中，不同的是，终止液为质量分数为2％的硫酸溶液。
<实施例4>
实施4的测试方法同实施例1，其中，不同的是，L-谷氨酰胺的浓度为40mmol/L；37℃、5％CO2条件下预培养12h；终止液为质量分数为3％的硫酸溶液。
<实施例5>
实施5的测试方法同实施例1，其中，不同的是，37℃、5％CO2条件下预培养16h；终止液为质量分数为2％的磷酸溶液。
<实施例6>
实施6的测试方法同实施例1，其中，不同的是，L-谷氨酰胺的浓度为30mmol/L；37℃、5％CO2条件下预培养14h；终止液为质量分数为5％的磷酸溶液。
<实施例7>
实施7的测试方法同实施例1，其中，不同的是，终止液为质量分数为2％混合酸，所述混合酸为体积比为1:1:1的质量分数分别为1～2％盐酸溶液、2～3％硫酸溶液、3～5％磷酸溶液。
<实施例8>
实施8的测试方法同实施例1，其中，不同的是，L-谷氨酰胺的浓度为40mmol/L，37℃、5％CO2条件下预培养12h；终止液为质量分数为4％混合酸，所述混合酸为体积比为1:1:1的质量分数分别为1～2％盐酸溶液、2～3％硫酸溶液、3～5％磷酸溶液。
<对比例1>
采用CCK-8法(不加营养液及反应终止液)测试医疗材料中甲醛体外细胞毒性。
<细胞毒性测试结果>
实施例1～8和对比例1的细胞毒性测试结果如下，细胞存活率的结果如表1所示。
表1细胞毒性测试结果
Figure BDA0002572921180000051
实施例1～8在一周内使用酶标仪完成每孔的吸光度测试，对比例1在加入CCK-8溶液孵育3h后立即进行吸光度测试。由表1可知，实施例1～8和对比例1的细胞毒性测试结果较为一致。表明加入营养液和终止液后，并不会对细胞毒性测试结果产生影响，并且在加入营养液后，可缩短预培养时间，在加入反应终止液后，有效控制了反应时间，可将吸光度测试时间延长为一周之内，减少了在做大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性测试时前后放置时间不一致所带来的实验误差，使检测结果更准确。
<细胞毒性稳定性测试>
取实施例1孵育后加入终止液的和对比例1孵育后的96孔板，遮盖避光于2～8℃条件下分别保存1h、6h、12h、1d、2d、4d、7d，使用酶标仪分别测定各时间点每孔在450nm处的吸光度，并计算医疗材料浸提液试验孔细胞存活率，测试结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002572921180000052
由表2可知，实施例1中医疗材料浸提液试验孔的细胞存活率在一周内没有发生变化，表明在加入终止液后反应及时终止，延长了检测吸光度的时间间隔，在一周内完成其吸光度检测即可，适用于大批量医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测定。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (9)

1.一种医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，采用CCK-8法进行测试，其特征在于，在CCK-8细胞染色孵育后，向每孔加入10μl终止液以终止反应。
2.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，在接种细胞悬液后，向每孔加入10μl营养液进行培养。
3.如权利要求2所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，所述营养液为20～40mmol/L的L-谷氨酰胺。
4.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，所述终止液为盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，所述终止液为质量分数为1～2％的盐酸溶液。
6.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性测试方法，其特征在于，所述终止液为质量分数为2～3％的硫酸溶液。
7.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，所述终止液为质量分数为3～5％的磷酸溶液。
8.如权利要求1所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，所述终止液为质量分数为2～4％体积比为1:1:1的盐酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液。
9.如权利要求1～8任一项所述的医疗材料中甲醛体外细胞毒性的测试方法，其特征在于，包括：
使用含10％胎牛血清的MEM培养基扩增培养小鼠成纤维细胞L-929，经过质量分数为0.25％的胰蛋白酶消化以后，制备细胞悬液(5×104～1×105个/ml)；96孔板中最外周36孔每孔加100μl的MEM培养基，其余每孔加入90μl细胞悬液或MEM培养基后，再加10μl浓度为20～40mmol/L的L-谷氨酰胺，转动96孔板，使细胞悬液与L-谷氨酰胺充分混合，37℃、5％CO2条件下预培养12～18h；
96孔板(除最外周36孔)每列6孔为一组，分别设置阳性对照组、甲醛污染组、空白对照组，在最外周36孔中设置一组背景对照组，其中，阳性对照组设置6个梯度浓度，分别包含1、5、25、50、75、100mg/L的甲醛溶液，甲醛污染组为10μl医疗材料浸提液；
将96孔板在37℃、5％CO2的条件下孵育24h，再向每孔加入10μl CCK-8溶液，置于37℃、5％CO2的条件下孵育3h，最后加入10μl终止液以使反应及时终止，遮盖避光于2～8℃条件下保存，一周内使用酶标仪测定每孔在450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。
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