CN111925405B - 一种甲基异茜草素a环糖基化衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种甲基异茜草素a环糖基化衍生物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物及其制备方法和应用，属于医药技术领域。本发明提供了一种具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物，可以作为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)激动剂靶向性作用于VEGFR1，并且同时激活Notch2/Hey1信号通路和抑制JNK/p38信号通路，起到治疗脂肪肝的作用。
Figure DDA0002641707120000011

Description

一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物及其制备方法和应用。
背景技术
非酒精性脂肪肝是指因肝内脂肪氧化减弱，脂肪酸合成增多，肝细胞内脂肪堆积所致的一种综合代谢性疾病。非酒精性脂肪肝是一种常见的肝脏病理改变，而非一种独立的疾病。非酒精性脂肪肝病正严重威胁人类的健康，成为仅次于病毒性肝炎的第二大肝病，发病率在不断升高，且发病年龄日趋年轻化。临床上，非酒精性脂肪肝患者往往血清总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)明显升高，高密度脂蛋白明显下降。因此，TC、TG和高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的测定作为检测脂肪肝的有效指标。同时，当肝脏细胞受损时，丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)溢出导致血清ALT和AST含量升高，所以通过测量血清ALT和AST活性可反映非酒精性脂肪肝患者肝细胞损害的程度及肝细胞的修复情况。
目前，临床上没有治疗非酒精性脂肪肝的统一标准，常用的辅助性干预手段包括胰岛素增敏剂、调脂药以及抗氧化剂等，种类少。治疗非酒精性脂肪肝的常用药物包括：①西药类如蛋氨酸胆碱、卵磷脂、水飞蓟素、肌苷、辅酶A、肉毒碱乳清酸盐等，主要作用为保护肝细胞、增加脂肪转运功能；②抗氧化剂如甲基异茜草素、还原型谷胱甘肽、牛磺酸、维生素E，主要作用是抑制胆固醇、甘油三酯氧化及脂质堆积；③中药类如姜黄、制何首乌、山楂等，主要作用为降血脂，防止胆固醇在肝内沉积。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物及其制备方法和应用。本发明提供的甲基异茜草素A环糖基化衍生物对非酒精性脂肪肝有治疗作用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物，具有式I所示的结构：
Figure BDA0002641707100000021
本发明还提供了上述技术方案所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合进行取代反应，得到具有式II所示结构的化合物；
Figure BDA0002641707100000022
将所述具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH混合进行水解反应，得到式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物。
优选地，所述甲基异茜草素与3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物的摩尔比为1：1～1.1。
优选地，所述取代反应的时间为10～30min。
优选地，所述水解反应的时间为1～3h。
优选地，所述具有式II所示结构的化合物与NaOMe的摩尔比为1：6。
本发明还提供了上述技术方案所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的甲基异茜草素A环糖基化衍生物在制备预防和/或治疗脂肪肝药物中的应用。
优选地，所述脂肪肝为非酒精性脂肪肝。
优选地，所述治疗非酒精性脂肪肝药物包含大于10mg/kg具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物、其衍生物、其立体异构体或可药用盐，以及药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。
优选地，所述治疗非酒精性脂肪肝药物的剂型包括片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或药学上可接受的纳米制剂剂型。
本发明提供了一种具有式I所示的结构甲基异茜草素A环糖基化衍生物，能够作为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)激动剂，靶向性作用于VEGFR1，并且同时激活Notch2/Hey1信号通路和抑制JNK/p38信号通路，起到治疗非酒精性脂肪肝的作用。
本发明还提供了上述技术方案所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的制备方法，本发明提供的制备方法经取代和水解两步得到产物，步骤简单，操作容易，收率高。
附图说明
图1为本发明制备甲基异茜草素A环糖基化衍生物的反应原理图；
图2为具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的碳核磁谱图；
图3为不同实验分组对初体质量的影响；
图4为不同实验分组对末体质量的影响；
图5为不同实验分组对对肝指数的影响；
图6为不同实验分组对血清TG含量的影响；
图7为不同实验分组对血清TC含量的影响；
图8为不同实验分组对血清HDL-C含量的影响；
图9为不同实验分组对血清ALT含量的影响；
图10为不同实验分组对血清AST含量的影响；
图11为不同实验分组对血清SOD含量的影响；
图12为不同实验分组对血清MDA含量的影响；
图13为不同实验分组对肝脏镜下结构影响；
图14为不同实验分组对肝脏VEGFR1表达免疫组化的影响；
图15为不同实验分组对肝脏VEGFR1表达WesternBlot的影响；
图16为对肝脏VEGFR1表达WesternBlot的影响统计图；
图17为对肝脏Hey1和p38免疫荧光的影响；
图18为甲基异茜草素A环糖基化衍生物治疗脂肪肝机制信号通路图。
具体实施方式
本发明提供了一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物，具有式I所示的结构：
Figure BDA0002641707100000041
在本发明中，所述具有式I所示的结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的化学命名为1-脱氧核糖-2-甲基-3羟基蒽醌(4-hydroxy-2-(((2S,4R,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)oxy)-3-methylanthracene-9,10-dione)，分子式为C20H18O7，分子量为370。
图18为甲基异茜草素A环糖基化衍生物治疗脂肪肝机制信号通路图，甲基异茜草素A环糖基化衍生物作为血管内皮细胞生长因子受体1(VEGFR1)激动剂靶向性作用于VEGFR1，并且同时激活Notch2/Hey1信号通路和抑制JNK/p38信号通路，起到治疗脂肪肝的作用。
本发明还提供了上述技术方案所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的制备方法，包括以下步骤：
将甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合进行取代反应，得到具有式II所示结构的化合物；
Figure BDA0002641707100000042
所述式II中Tol为对甲苯甲酰基；
将所述具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH混合进行水解反应，得到具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物。
在本发明中，若无特殊说明，本发明所用的原料均为市售商品。
本发明将甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合进行取代反应，得到具有式II所示结构的化合物。
在本发明中，所述甲基异茜草素与3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物的摩尔比优选为1：1～1.1。
在本发明中，所述取代反应的时间优选为10～30min，更优选为20min，所述取代反应的时间以甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合后开始计算；所述取代反应的温度优选为室温，不需要额外的加热或降温。
在本发明中，所述甲基异茜草素、NaH和CH3CN的用量比优选为1mmol：1.5mmol：3mL。
在本发明中，所述甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN的加料顺序优选为：先向反应容器中依次加入甲基异茜草素和CH3CN搅拌混合，然后在0℃条件下加入NaH并继续搅拌10分钟，最后加入3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物继续搅拌，本发明对所述搅拌的参数没有特殊的限定，能够使原料混合均匀即可。在本发明中，所述NaH优选以NaH-矿物油的形式加入，本发明对所述NaH-矿物油中矿物油的具体种类没有特殊的限定。在本发明的具体实施例中，所述NaH-矿物油中NaH的质量分数优选为60％。
所述取代反应完成后，本发明优选加入100％乙酸淬灭反应，本发明对所述乙酸的用量没有特殊的限定，能够使所述取代反应淬灭即可。
所述取代反应完成后，本发明优选将所得淬灭后取代反应产物依次进行减压蒸馏和硅胶柱分离，得到所述具有式II所示结构的化合物。本发明优选用薄层色谱监测反应是否完全。本发明对所述减压蒸馏的具体参数没有特殊的限定，能够除去CH3CN即可。在本发明中，所述硅胶柱分离使用的洗脱剂优选为环己烷和乙酸乙酯的混合液，所述混合液中环己烷和乙酸乙酯的体积比优选为3：7。在本发明中，所述硅胶柱分离的流速优选为5mL/min。
在本发明中，所述甲基异茜草素优选由包括以下步骤的方法制备得到：
将邻苯二甲酸酐、2,6-二羟基甲苯、AlCl3和氯化钠混合进行环合反应，得到所述甲基异茜草素。
在本发明中，所述邻苯二甲酸酐和2,6-二羟基甲苯的摩尔比优选为4.5:4。
在本发明中，所述环合反应的温度优选为170℃，所述环合反应的时间优选为45min，所述环合反应的时间以所有原料混合后开始计算。在本发明中，由130℃升温至170℃的时间优选不超过5min。
在本发明中，所述邻苯二甲酸酐与AlCl3的摩尔比优选为1:10。在本发明中，所述AlCl3优选为无水AlCl3。
在本发明中，所述邻苯二甲酸酐与氯化钠的摩尔比优选为0.9:4.1。
在本发明中，所述邻苯二甲酸酐、2,6-二羟基甲苯、AlCl3和氯化钠的加料顺序优选为先向反应容器中加入氯化钠和部分AlCl3，熔融后得到混合物，将邻苯二甲酸酐和2,6-二羟基甲苯混合均匀后，加入所述混合物中，然后再加入剩余AlCl3。在本发明中，所述部分AlCl3与剩余AlCl3的质量比为1:1。在本发明中，所述熔融的温度优选为130℃。
所述环合反应完成后，本发明优选将所得环合反应产物自然冷却后加入冰水和盐酸，然后用乙酸乙酯萃取，所得有机相合并并用无水硫酸钠干燥，再依次经减压蒸馏和硅胶柱分离，得到所述甲基异茜草素。
在本发明中，所述盐酸的质量浓度优选为36.5％，所述冰水与盐酸的体积比优选为2：1。
在本发明中，所述乙酸乙酯的萃取次数优选为3次。
本发明对所述减压蒸馏的具体参数没有特殊的限定，能够除去乙酸乙酯即可。在本发明中，所述硅胶柱分离使用的洗脱剂优选为石油醚-乙酸乙酯的混合液，所述混合液中石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为5：1。在本发明中，所述硅胶柱分离的流速优选为5mL/min。
得到具有式II所示结构的化合物后，本发明将所述具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH混合进行水解反应，得到所述甲基异茜草素A环糖基化衍生物。
在本发明中，所述水解反应的时间优选为1～3h，更优选为2h，所述水解反应的温度优选为室温，不需要额外的加热或降温。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物与NaOMe的摩尔比优选为1：6。
在本发明中，所述具有式II所示结构的化合物与CH3OH的用量比优选为1mmol：10mL。
在本发明中，所述所述具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH的加料顺序优选为：先向反应容器中加入具有式II所示结构的化合物和CH3OH，室温搅拌溶解，然后再加入NaOMe。本发明对所述搅拌溶解的具体参数没有特殊的限定，能够使原料混合均匀即可。
所述水解反应完成后，本发明优选加入乙酸淬灭反应，本发明对所述乙酸的用量没有特殊的限定，能够使所述水解反应淬灭即可。本发明优选用薄层色谱监测反应是否完全。
所述水解反应完成后，本发明优选将所得淬灭后水解反应产物依次进行减压蒸馏和硅胶柱分离，得到式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物。本发明对所述减压蒸馏的具体参数没有特殊的限定，能够除去CH3OH即可。在本发明中，所述硅胶柱分离使用的洗脱剂优选为环己烷和乙酸乙酯的混合液，所述混合液中环己烷和乙酸乙酯的体积比优选为1：1。在本发明中，所述硅胶柱分离的流速优选为5mL/min。
图1为本发明制备甲基异茜草素A环糖基化衍生物的反应原理图，邻苯二甲酸酐、2,6-二羟基甲苯、AlCl3和氯化钠混合进行环合反应，得到甲基异茜草素；甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合进行取代反应，得到具有式II所示结构的化合物；具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH混合进行水解反应，得到所述甲基异茜草素A环糖基化衍生物。
本发明还提供了上述技术方案所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物或上述技术方案所述制备方法制得的甲基异茜草素A环糖基化衍生物在制备治疗脂肪肝药物中的应用。
在本发明中，所述脂肪肝优选为非酒精性脂肪肝。
在本发明中，所述治疗非酒精性脂肪肝药物优选包含有效剂量大于10mg/kg的具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物、其衍生物、其立体异构体或可药用盐，以及药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。
在本发明中，所述治疗非酒精性脂肪肝药物的剂型优选包括片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或药学上可接受的纳米制剂剂型。
为了进一步说明本发明，下面结合实例对本发明提供的甲基异茜草素A环糖基化衍生物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
药物：甲基异茜草素(购自南京春秋生物工程有限公司)；2,6-二羟基甲苯、邻苯二甲酸酐、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物(安耐吉化学有限公司)；复方蛋氨酸胆碱片(中国通化东宝药业股份有限公司)；VEGFR1一抗(BM4021，武汉博士德生物工程有限公司)；Hey1一抗(ab98072)、p38一抗(ab170099)(abcam贸易有限公司)。
甲基异茜草素A环糖基化衍生物合成：
(1)在50mL圆底烧瓶中加入无水AlCl3(22.5mmol,3g)，氯化钠(20.5mmol,1.2g)，130℃加热至熔融，把邻苯二甲酸酐(4.5mmol,670mg)和2,6-二羟基甲苯(4mmol,500mg)混合均匀后，加入烧瓶中，之后再加入无水AlCl3(22.5mmol,3g)，温度升至170℃并搅拌反应45分钟。反应结束后，冷却并加入冰水和盐酸(冰水10mL，盐酸为市售盐酸，质量浓度36.5％，用量5mL)，用乙酸乙酯萃取3次，每次加入乙酸乙酯15mL，有机相合并并用无水硫酸钠干燥。减压蒸馏(旋转蒸发仪，45℃)除去溶剂后粗产品过硅胶柱分离(石油醚和乙酸乙酯体积比为5：1，流速5mL/min，洗脱液1000mL)，得甲基异茜草素(650mg,64％)。
(2)在25mL圆底烧瓶中加入254mg甲基异茜草素(1mmol)，3mLCH3CN，0℃条件下加入60mgNaH(1.5mmol,60wt％in矿物油)，并搅拌10分钟，加入428mg3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物(1.1mmol)，继续室温搅拌20分钟。反应结束后，加入乙酸淬灭反应，减压蒸馏除去溶剂后过硅胶柱分离(洗脱剂：环己烷和乙酸乙酯体积比为3：7，流速5mL/min，洗脱液1000mL)，得具有式II所示结构的化合物(562mg,收率93％)。
(3)在25mL圆底烧瓶中加入605mg具有式II所示结构的化合物(1mmol)，10mLCH3OH，室温搅拌溶解，加入254mgNaOMe(6mmol)，继续室温搅拌2小时。反应结束后，加入乙酸淬灭反应，减压蒸馏除去溶剂后过硅胶柱分离(洗脱剂：环己烷和乙酸乙酯的体积比为1：1，流速5mL/min，洗脱液1000mL)，得333mg固体产物(90％)。
对固体产物进行谱图表征，溶剂为氘代二甲亚砜：1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ:2.02(s,3H),2.25-2.29(m,1H),2.39-2.43(m,1H),3.30-3.33(m,1H),3.41-3.45(m,1H),3.90(t,J＝2.4Hz,1H),4.34(s,1H),4.73(t,J＝4.8Hz,1H),5.26(d,J＝4.8Hz,1H),6.08(s,1H),7.39(t,J＝3.0Hz,1H),7.89-7.90(m,2H),8.12-8.16(m,2H),12.88-12.89(m,1H).13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ:8.8,41.5,62.8,70.9,88.9,102.5,106.0,110.8,120.5,126.9,127.3,132.1,133.2,133.3,135.1,135.2,161.3,161.8,182.0,187.3.其中图2为具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的碳核磁谱图。
结果显示，该固体产物具有式I所示结构。
实施例2动物实验
1、动物：Sprague-Dawley(SD)大鼠，6周龄、雄性、180～220g、清洁级，由湖南师范大学提供。
2、实验分组：大鼠在实验室适应饲养1周，在活动、进食、粪便均无异常，56只大鼠按随机数字表随机分为7组：(1)正常对照组：常规饮食12周；(2)非酒精性脂肪肝疾病模型组：高脂饮食(由普通饲料加15wt％猪油，8wt％蛋黄粉，2wt％胆固醇)8周造模成功后，改成常规饮食4周；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加复方蛋氨酸胆碱(10mg/kg)；(4)甲基异茜草素治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，常规饮食时在饮水中添加甲基异茜草素(10mg/kg)；(5)甲基异茜草素A环糖基化衍生物(实施例1制备得到)低剂量治疗组(2mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，常规饮食时在饮水中添加甲基异茜草素A环糖基化衍生物(2mg/kg)；(6)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组(10mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加甲基异茜草素A环糖基化衍生物(10mg/kg)；(7)甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组(50mg/kg)：高脂饮食8周后，改成常规饮食4周，并在饮水中添加甲基异茜草素A环糖基化衍生物(50mg/kg)。
第12周末将大鼠用2％戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔注射，麻醉后下腔静脉取血，将血标本离心后用于血清学指标检测；取肝左叶，用10％中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋切片，作肝组织病理学观察；取肝右叶，提取蛋白进行WesternBlot检测；取肝右叶，冰冻处理，进行免疫荧光检测。
3、实验内容：
3.1 大鼠一般情况：观察大鼠活动度、饮食情况、皮毛光泽、睡眠状况。
3.2 体重、肝指数：天平称量体重，麻醉处死后，取肝脏称重。肝指数(％)＝肝脏重量(g)/体重(g)×100％。
3.3 血清TG、TC、HDL-C含量：大鼠股动脉取血，肝素抗凝管收集血样，30分钟内于4℃温度下1500r/min离心8分钟，离心后取上层血清于-80℃冷冻保存。
预留组织按照1:9质量比加入生理盐水，电子匀浆器匀浆10分钟，4℃温度下1500r/min，离心8分钟，离心后取上清液-80℃冷冻保存。将4℃保存的Elisa试剂盒在室温下平衡30分钟，从铝箔袋中取出所需Elisa反应板，剩余反应板用自封袋密封后4℃保存。用标记笔设置空白孔、标准品孔、样本孔，其中空白孔空置，样本孔和标准品孔各加入不同待测样本和不同浓度的标准品50μL。样本孔和标准品孔中分别加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100μL，用封板膜密封Elisa反应板上的各个反应孔后放入37℃水浴锅中孵育60分钟。弃去反应孔中液体，在吸水纸上拍干反应孔中残留水份。各反应孔中加入蒸馏水与洗涤缓冲液按照1:20体积比配制的洗涤液350μL，室温下静置1分钟，甩去洗涤液，在吸水纸上拍干反应孔中残留水份，重复5次。取底物A、B各50μL分别加入各反应孔中，37℃温箱中避光孵育15分钟。取终止液50μL分别加入各反应孔中，15分钟内在酶标仪设定450nm波长处测定各孔OD值。以所测标准品浓度值为纵坐标、OD值为横坐标，软件绘制标准曲线并得到直线回归方程。将检测样本的OD值代入上述直线回归方程中即可计算出检测样本的浓度。
3.4 血清ALT、AST含量：方法同3.3。
3.5 血清SOD、MDA含量：方法同3.3。
3.6 HE染色：将石蜡切片置于烘箱中60℃烤1～2小时；石蜡切片常规二甲苯、乙醇脱蜡至水；苏木素染10分钟；流水冲洗，去余色；0.7％盐酸乙醇分化数秒钟；流水冲洗，切片变蓝约15分钟；7.95％乙醇30秒钟；酒精性伊红染30秒；I 95％乙醇30秒钟；II 95％乙醇30秒钟；I 100％乙醇30秒钟；II100％乙醇30秒钟；石碳酸二甲苯30秒钟；I二甲苯30秒钟；II二甲苯30秒钟；中性树胶封片。
3.7 免疫组化：石蜡切片脱蜡至水；3％H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水冲洗，PBS浸泡2次，每次5分钟；5～10％正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1小时或4℃过夜；PBS冲洗，3次，每次5分钟；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育10～30分钟；PBS冲洗，3次，每次5分钟；滴加适量的辣根酶或碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育10分钟；PBS冲洗，3次，每次5分钟；显色剂显色15分钟(DAB或NBT/BCIP)，自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
3.8 WesternBlot：在组织匀浆液中加入PMSF(1:100)和Cocktail(1:1000)，电动匀浆器调整为30次/mim，然后顺时针匀浆50次，逆时针匀浆50次。将组织悬液吸取到5mL离心管内并加入1/3体积的Buffer缓冲液，震荡混合均匀。然后放置于试管架上并进行水浴煮沸10分钟，然后用20k赫兹超声震荡20次后离心，4℃/12000g/5分钟后取上清液于离心管后-80℃保存。
BSA梯度溶液配制，首先配制10μg/μL的BSA缓冲溶液，依次用双蒸水进行梯度稀释为标准蛋白，稀释浓度依次为0μg/μL、0.2μg/μL、0.4μg/μL、0.6μg/μL、0.8μg/μL、1.0μg/μL。将蛋白上清离心管从-80℃冰箱中取出置于冰上，缓慢溶解后吸取2μl蛋白样品并加入18μL双蒸水，并且混合震荡混匀。首先96孔板上设置3个平行孔，然后以5μL/孔的容量加入上述混合震荡混匀蛋白样品和BSA梯度缓冲溶液。取试剂盒中A液50份，B液1份，混合均匀后配制成工作液并迅速在96孔板各孔中加入95μL，96孔板置于培养箱中，37℃温度下孵育30分钟。分光光度计设定在562nm光波波段波，测定吸光度值并绘制标准蛋白曲线，计算得出样品蛋白浓度值。
取1份溴酚蓝和3份β-巯基乙醇，并且混合震荡混匀。混合液用双蒸水稀释10倍，在水浴锅中煮沸10分钟，振荡混匀。胶板加入10％分离胶室温静置，待胶凝固后倾去水层，用滤纸吸干。之后加入5％浓缩胶室温静置，凝固后待用。将胶板置于电泳槽中固定，沿着电泳槽缓慢加入电泳液，然后将样本充分混匀，用微量加样器在电泳槽泳道中加入蛋白样品，用80V恒定电压电泳30分钟直至样本跑至分离胶后，用120V恒定电压电泳分离，电泳时间的制定根据目的蛋白的分子量确定。记号笔标记硝酸纤维素膜后浸于预先处理好的转膜工作液中，剥下分离胶并根据目的蛋白的分子量范围横向切胶，从负极到正极方向依次放置纤维海绵垫→3层滤纸→胶板→硝酸纤维素膜→3层滤纸→纤维海绵垫。上述材料堆积呈梯形后放入预先置于0℃孵育的转膜槽中，在252mA恒定电流转膜，转膜时间根据目的蛋白的分子量确定，控制在1～3h。转膜结束后将硝酸纤维素膜从转膜槽中取出，用PBS冲洗2次，每次冲洗5分钟。然后用2％～10％羊血清或2％～5％牛血清白蛋白100μL，室温下浸泡10～30分钟，用PBS冲洗3次，每次冲洗5分钟。选用适当比例稀释浓缩液后1cm2滴加40μL一抗。37℃孵育1h或4℃过夜，洗涤缓冲液清洗3次，每次清洗10分钟→次日取出硝酸纤维素膜并回收一抗，TBS缓冲液加入0.02％吐温20，漂洗3次，每次5分钟，保鲜袋封闭处理，选用适当比例稀释浓缩液后1cm2滴加40μL生物素化二抗，37℃孵育1h或4℃过夜后PBS冲洗5分钟并重复3次。取出硝酸纤维素膜并回收二抗，TBS缓冲液加入0.02％吐温20，漂洗3次，每次5分钟。漂洗完毕后，用TBS缓冲液漂洗3次，每次5分钟。分别在700nm光波波段处对硝酸纤维素膜扫描。
3.9 免疫荧光：冰冻切片抗体孵育，PBS清洗3次，每次5分钟；按相应比例稀释一抗，每孔滴加一抗50μL，4℃孵育过夜，回收一抗，PBS清洗，5分钟×3次；滴加相应种属的荧光二抗，室温避光孵育1小时，去除二抗，PBS清洗3次，每次5分钟；滴加稀释的第二种一抗，50μL/孔，4℃孵育过夜；回收一抗，PBS清洗3次，每次5分钟；滴加相应种属的荧光二抗，室温避光孵育1小时，去除二抗，PBS清洗3次，每次5分钟，滴加少量PBS，覆盖细胞即可。PBS缓冲液加入0.1％的TritonX-100，96孔培养板清洗3次，每次5分钟，加入含1:500倍Hoechst稀释的PBS避光静置10分钟。PBS缓冲液加入0.1％的TritonX-100，96孔培养板清洗3次，每次清洗3分钟，在载玻片上滴加100μL抗荧光淬灭封片液并用盖玻片封片，室温静置1分钟后保持水平位置放置于4℃冰箱并注意避光保存。24小时后可在荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察细胞形态及染色情况。
4、统计学方法：所有数据以均数±标准差(±s)表示。组间差异比较用ANOVA及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS 13.0统计软件完成，双侧P＜0.05认为差异有显著性。
5、结果
5.1 一般情况：(1)正常对照组大鼠精力充沛，灵活好动，饮食正常，皮毛整洁，体重缓慢增加；(2)非酒精性脂肪肝疾病模型组饮食量大，嗜睡，毛色偏黄，个体较大，体重增长较正常组较快，有不同程度的精神萎靡，活动减少，皮毛凌乱；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组、甲基异茜草素治疗组上述症状轻微改善或者改善不明显；(4)甲基异茜草素A环糖基化衍生物低剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组上述症状改善明显，且随着剂量的增加，改善程度逐渐增强。
5.2 体重、肝指数：结果见表1、图3、图4和图5，图3为不同实验分组对初体(原始Sprague-Dawley(SD)大鼠，未经试验分组处理)质量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图4为不同实验分组对末体(经过不同试验分组处理后的大鼠)质量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图5为不同实验分组对对肝指数的影响，与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。由表1、图3、图4和图5可知，(1)与正常对照组相比，其余各组大鼠初体质量无明显差异(P＞0.01)；(2)与非酒精性脂肪肝疾病模型组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠末体质量、肝指数均明显下降(P<0.01)；(3)与甲基异茜草素治疗组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠末体质量、肝指数均明显下降(P<0.01)。
表1大鼠体重、肝指数(n＝8，
Figure BDA0002641707100000141
)/>
Figure BDA0002641707100000142
注：与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，dP<0.01。
5.3 血清TG、TC、HDL-C含量：结果见表2、图6、图7和图8，图6为不同实验分组对血清TG含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，bP<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图7为不同实验分组对血清TC含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图8为不同实验分组对血清HDL-C含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。由表2、图6、图7和图8可知，(1)与非酒精性脂肪肝疾病模型组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠TG、TC均明显下降，HDL-C明显升高(P<0.01)；(2)与甲基异茜草素治疗组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠TG、TC均明显下降，HDL-C明显升高(P<0.01)。
表2血清TG、TC、HDL-C含量(n＝8，
Figure BDA0002641707100000151
)/>
Figure BDA0002641707100000152
注：与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，dP<0.01。
5.4 血清ALT、AST含量：结果见表3、图9和图10，图9为不同实验分组对血清ALT含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图10为不同实验分组对血清AST含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。由表3、图9和图10可知，(1)与非酒精性脂肪肝疾病模型组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物低剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠ALT、AST均明显下降(P<0.01)；(2)与甲基异茜草素治疗组相比，甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠ALT、AST均明显下降(P<0.01)。
表3血清ALT、AST含量(n＝8，
Figure BDA0002641707100000161
)
Figure BDA0002641707100000162
注：与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，cP<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，dP<0.01。
5.5 血清SOD、MDA含量：结果见表4、图11和图12，图11为不同实验分组对血清SOD含量的影响，其中与正常对照组比较，a P<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。图12为不同实验分组对血清MDA含量的影响，其中与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，d P<0.01。由表4、图11和图12可知，(1)与非酒精性脂肪肝疾病模型组相比，甲基异茜草素治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物低剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠SOD明显升高、MDA明显降低(P<0.01)；(2)与甲基异茜草素治疗组相比，SOD、MDA在甲基异茜草素A环糖基化衍生物各剂量组之间没有差异(P＞0.01)。重点说明：甲基异茜草素虽然具有较好的抗氧化作用，但是对非酒精性脂肪肝却没有较好的干预作用；甲基异茜草素A环糖基化衍生物具有较好的抗氧化作用，但是对非酒精性脂肪肝却有较好的干预作用。说明，甲基异茜草素A环糖基化衍生物对非酒精性脂肪肝的干预作用不是通过抗氧化作用完成的。
表4血清SOD、MDA含量(n＝8，
Figure BDA0002641707100000171
)
Figure BDA0002641707100000172
注：与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，cP<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，dP<0.01。
5.6 HE染色：结果见图13，图13为不同实验分组对肝脏镜下结构影响(400放大倍率)，由图13可知，(1)非酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞出现较为明显的气球样变，脂肪变性面积明显高于正常对照组；(2)甲基异茜草素治疗组对肝细胞的气球样变并没有明显的抑制作用，脂肪变性面积并没有明显缩小；(3)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组大鼠肝细胞出现较为明显的气球样变，脂肪变性面积明显低于非酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠。
5.7 免疫组化：结果见图14，图14为不同实验分组对肝脏VEGFR1表达免疫组化的影响(400放大倍率)，由图14可知，(1)非酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞黄棕色染色颗粒明显减少，VEGFR1表达明显低于正常对照组；(2)甲基异茜草素治疗组没有抑制肝细胞黄棕色染色颗粒减少，VEGFR1表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞黄棕色染色颗粒减少，VEGFR1表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。
5.8 WesternBlot：结果见图15和图16，图15为不同实验分组对肝脏VEGFR1表达WesternBlot的影响(400放大倍率)，其中(1)正常对照组；(2)非酒精性脂肪肝疾病模型组；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组；(4)甲基异茜草素治疗组；(5)甲基异茜草素A环糖基化衍生物低剂量治疗组；(6)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组；(7)甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组。图16为对肝脏VEGFR1表达WesternBlot的影响统计图，其中与正常对照组比较，aP<0.01；与非酒精性脂肪肝疾病模型组比较，b P<0.01；与复方蛋氨酸胆碱治疗组比较，c P<0.01；与甲基异茜草素治疗组比较，dP<0.01。由图15和16可知，(1)非酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞灰度明显减少，VEGFR1表达明显低于正常对照组；(2)甲基异茜草素治疗组没有抑制肝细胞灰度减少，VEGFR1表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞灰度减少，VEGFR1表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。
5.9 免疫荧光：结果见图17，图17为对肝脏Hey1和p38免疫荧光的影响(400放大倍率)，其中(1)正常对照组；(2)非酒精性脂肪肝疾病模型组；(3)复方蛋氨酸胆碱治疗组；(4)甲基异茜草素治疗组；(5)甲基异茜草素A环糖基化衍生物低剂量治疗组；(6)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组；(7)甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组。由图17可知，(1)非酒精性脂肪肝疾病模型组大鼠肝细胞Hey1荧光减弱，p38荧光增强；(2)甲基异茜草素治疗组没有抑制Hey1荧光减弱和p38荧光增强，表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组没有明显差异；(3)甲基异茜草素A环糖基化衍生物中剂量治疗组、甲基异茜草素A环糖基化衍生物高剂量治疗组明显抑制肝细胞抑制Hey1荧光减弱和p38荧光增强，表达与非酒精性脂肪肝疾病模型组有明显差异。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种甲基异茜草素A环糖基化衍生物，具有式I所示的结构：
Figure FDA0004055785010000011
2.权利要求1所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将甲基异茜草素、3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物、NaH和CH3CN混合进行取代反应，得到具有式II所示结构的化合物；
Figure FDA0004055785010000012
所述式II中Tol为对甲苯甲酰基；
将所述具有式II所示结构的化合物、NaOMe和CH3OH混合进行水解反应，得到式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述甲基异茜草素与3,5-二-O-(对甲苯甲酰基)-2-脱氧-D-呋喃核糖氯化物的摩尔比为1：1～1.1。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，所述取代反应的时间为10～30min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述水解反应的时间为1～3h。
6.根据权利要求2或5所述的制备方法，其特征在于，所述具有式II所示结构的化合物与NaOMe的摩尔比为1：6。
7.权利要求1所述的甲基异茜草素A环糖基化衍生物或权利要求2～6任一项所述制备方法制得的甲基异茜草素A环糖基化衍生物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗非酒精性脂肪肝药物包含大于10mg/kg具有式I所示结构的甲基异茜草素A环糖基化衍生物或其可药用盐，以及药学上可接受的载体、辅料、赋形剂和稀释剂。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述治疗非酒精性脂肪肝药物的剂型具体为片剂、注射剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、缓释制剂、控释制剂或药学上可接受的纳米制剂剂型。
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