CN111909902A - 一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒 - Google Patents

一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒。所述杂交瘤细胞株于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：19944。所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株获得。所述应用包括将所述单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。采用上述单克隆抗体制备致敏胶乳原液的方法，所述方法包括：将胶乳微球加入所述单克隆抗体中进行偶联，所述单克隆抗体的浓度为6.2～7.4mg/mL，得到所述致敏胶乳原液。本发明实施例提供的杂交瘤细胞株能够分泌GPC3单克隆抗体，且分泌GPC3单克隆抗体能够作为治疗肝癌的药物并具有较高的效价。

Description

一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致 敏胶乳原液的方法以及试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒。
背景技术
与正常肝相比，肝癌患者中Glypican-3(磷脂酰肌醇硫酸类肝素蛋白聚糖-3，GPC3)呈显著高水平表达。因此，GPC3具有作为早期诊断肝细胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)的新型肿瘤标志物的潜力。另外，GPC3对于肝癌而言不仅仅可以用于诊断，在肝癌的治疗方面也有所帮助。由于GPC3在肝癌中高度特异性的表达，因而可以将其作为一种肝癌免疫治疗的靶点，选择一种对GPC3有高度亲和力的载体，通过该载体将能杀伤肝癌细胞的物质如化疗药、放射性核素和毒蛋白等物质运送到肿瘤靶细胞处，从而对该肿瘤靶细胞进行选择性的杀伤。然而，目前市场上销售的商品化的GPC3单克隆抗体效价较低，直接影响到实验研究的深入开展及GPC3单克隆抗体在肝癌治疗中的应用。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒，该单克隆抗体具有较高的效价。
一方面，本发明实施例提供一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：19944。另一方面，本发明实施例提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由上述杂交瘤细胞株获得。
又一方面，本发明实施例提供一种上述单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括：
从磷脂酰肌醇硫酸类肝素蛋白聚糖-3的氨基酸序列上间断选择8段氨基酸序列；
将所述8段氨基酸序列分别合成多肽；
采用所述多肽免疫动物；
提取所述动物的脾细胞；
将所述脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到含有所述杂交瘤细胞株的混合物；
将所述混合物进行选择性培养，得到所述杂交瘤细胞株；
将所述杂交瘤细胞株进行细胞培养，得到所述单克隆抗体。
进一步地，所述融合的方法包括：将所述脾细胞与骨髓瘤细胞混合，再加入第一培养液培养后，进行离心，得到第一沉淀；
将所述第一沉淀与聚乙二醇混合，再加入第二培养液培养后，得到含有杂交瘤细胞株的混合液；
将所述混合液进行离心，得到第二沉淀；
将所述第二沉淀加入选择性培养液中进行选择性培养，培养时间为10～14天，选取OD值高的沉淀细胞通过有限稀释法进行克隆化培养，得到所述单克隆抗体。
更进一步地，将所述第一沉淀于37℃水浴中放置5min再与37℃的聚乙二醇混合，所述聚乙二醇的浓度为30％～50％，再滴加37℃的完全培养液，最后加入RPMI-1640培养液进行培养，得到含有所述杂交瘤细胞株的混合物。
更进一步地，所述8段氨基酸序列包括GPC3蛋白序列的第311～322位氨基酸、324～334位氨基酸、357～367位氨基酸、398～408位氨基酸、422～432位氨基酸、521～530位氨基酸、546～555位氨基酸和569～578位氨基酸。
再一方面，本发明实施例提供了一种上述单克隆抗体的应用，所述应用包括将所述单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。
又一方面，本发明实施例提供了一种采用上述单克隆抗体制备致敏胶乳原液的方法，所述方法包括：
将胶乳微球加入所述单克隆抗体中进行偶联，所述单克隆抗体的浓度为6.2～7.4mg/mL，得到所述致敏胶乳原液。
进一步地，所述胶乳微球的包括数量比为1:1的直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球。
再一方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述单克隆抗体。
本发明实施例提供的杂交瘤细胞株能够分泌GPC3单克隆抗体，且分泌GPC3单克隆抗体能够作为治疗肝癌的药物并具有较高的效价。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所特别指出的结构来实现和获得。
本发明提供的杂交瘤细胞株(分类命名为杂交瘤细胞株)于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO：19944。
附图说明
附图用来提供对本发明技术方案的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本申请的实施例一起用于解释本发明的技术方案，并不构成对本发明技术方案的限制。
图1是本发明实施例二提供的小鼠融合前血清ELISA检测结果曲线图，其中1为1号鼠，2为2号鼠；横坐标为效价，纵坐标为OD450值。
图2是本发明实施三提供的编号为3的单克隆抗体的细胞株腹水在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图3是本发明实施三提供的编号为5的单克隆抗体的细胞株腹水在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图4是本发明实施三提供的编号为6的单克隆抗体的细胞株腹水在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图5是本发明实施三提供的编号为3的单克隆抗体的细胞株腹水经过Dapi染色后在肝癌细胞系HepG2细胞核于100×油镜下照片。
图6是本发明实施三提供的编号为5的单克隆抗体的细胞株腹水经过Dapi染色后在肝癌细胞系HepG2细胞核于100×油镜下照片。
图7是本发明实施三提供的编号为6的单克隆抗体的细胞株腹水经过Dapi染色后在肝癌细胞系HepG2细胞核于100×油镜下照片。
图8是本发明实施三提供的编号为3的单克隆抗体的细胞株腹水经过Merge染色后在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图9是本发明实施三提供的编号为5的单克隆抗体的细胞株腹水经过Merge染色后在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图10是本发明实施三提供的编号为6的单克隆抗体的细胞株腹水经过Merge染色后在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
图11是本发明实施三提供的蛋白质印迹法验证显示编号为3、5和6的单克隆抗体分别在肝癌细胞系HepG2中表达。
图12是本发明实施例五提供的ROC曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一方面，本发明实施例提供一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：19944。
本发明实施例提供的杂交瘤细胞株能够分泌GPC3单克隆抗体，且分泌GPC3单克隆抗体的效价较高，这有助于研究GPC3单克隆抗体在肝癌治疗中的应用。
实施例二
本发明实施例提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体由本发明实施例一提供的杂交瘤细胞株获得。
下面介绍一下该单克隆抗体的制备方法，制备方法包括：
从磷脂酰肌醇硫酸类肝素蛋白聚糖-3的氨基酸序列上间断选择8段氨基酸序列；
将8段氨基酸序列分别合成多肽；多肽的合成由天津金虹生物科技开发有限公司完成；合成的多肽的分子量30KD，纯度>90％。
采用多肽免疫动物；
提取动物的脾细胞；
将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到含有杂交瘤细胞株的混合物；
将混合物进行选择性培养，得到杂交瘤细胞株；
将杂交瘤细胞株进行细胞培养，得到单克隆抗体。
进一步地，融合的方法包括：将脾细胞与骨髓瘤细胞混合，再加入第一培养液培养后，进行离心，得到第一沉淀；
将第一沉淀与聚乙二醇混合，再加入第二培养液培养后，得到含有杂交瘤细胞株的混合液；
将混合液进行离心，得到第二沉淀；
将第二沉淀加入选择性培养液中进行选择性培养，培养时间为10～14天，选取OD值高的沉淀细胞通过有限稀释法进行克隆化培养，得到单克隆抗体。
更进一步地，8段氨基酸序列包括GPC3蛋白序列的第311～322位氨基酸、324～334位氨基酸、357～367位氨基酸、398～408位氨基酸、422～432位氨基酸、521～530位氨基酸、546～555位氨基酸和569～578位氨基酸。
更进一步地，将第一沉淀于37℃水浴中放置5min再与37℃的聚乙二醇混合，聚乙二醇的浓度为30％～50％，再滴加37℃的完全培养液，最后加入RPMI-1640培养液进行培养，得到含有杂交瘤细胞株的混合物。
更进一步地，第一培养液培养为RPMI-1640培养液。
更进一步地，选择性培养液为HAT(Hypoxanthine Aminopterin Thymidine，次黄嘌呤氨基蝶呤胸腺嘧啶核苷)培养液。
具体地，在本实施例中，动物为2只实验用雌性白变种实验室健康小鼠(BALB/C)，且鼠龄为8～12周。
采取小鼠快速免疫方式，选择免疫反应最好的小鼠的脾脏进行融合，融合前血清ELISA检测数据如表1所示，其中阴性对照为磷酸盐缓冲液，阳性对照为GPC3抗体。
表1为小鼠融合前血清ELISA检测数据表
10万 20万 40万 80万 160万 阴性对照 阳性对照
OD<sub>450</sub>值 2.227 0.945 0.726 0.348 0.205 0.154 3.031
根据表1绘制小鼠融合前血清ELISA检测结果曲线图，具体如图1所示。
提取1号鼠的脾细胞，将该脾细胞于预先培养好的骨髓瘤细胞(SP2/0)以细胞个数比10:1比例进行混合，在本实施例中，脾细胞的个数为106个，骨髓瘤细胞的个数为107个，再加入20mL RPMI-1640培养液，于1000r/min离心10min后弃去上清，得到第一沉淀。将第一沉淀置37℃水浴中放置5min，再加入1mL 37℃预温的浓度为30％的聚乙二醇，再滴加37℃的完全培养液1mL，完全培养液需要在1min内滴加完，最后加入RPMI-1640培养液将总体积补至50mL，得到含有本发明实施例一提供的杂交瘤细胞株的混合物。将混合物于800r/min离心10min后弃去上清，得到第二沉淀，向第二沉淀中加入8mLHAT培养液轻轻悬浮沉淀细胞，并分置于96孔培养板中进行选择性培养，培养10天进行ELISA检测，根据ELISA检测结果，挑选OD值高的培养板的孔中的沉淀细胞通过有限稀释法进行克隆化培养；具体方法为：将有限稀释的沉淀细胞培养至96孔培养板中，待克沉淀细胞生长到全孔容积的1/6时，标记单克隆及多克隆，对单克隆进行ELISA检测。ELISA检测后将OD值最高的单克隆再有限稀释接入96孔培养板中，如上所述再次亚克隆，此过程重复数次，直至阳性孔比率为100％则为阳性单克隆抗体，同时认为建株成功。将筛选得到的阳性单克隆抗体扩大培养，细胞数按(1～2)×106/管进行冻存。
同时收集细胞安排腹水制备。
腹水制备：阳性单克隆抗体的细胞株采用小鼠腹腔接种法制备腹水，10～14天收集腹水，采用ELISA检测腹水效价，选取6株单克隆抗体的细胞株制备的腹水效价如表2所示，其中，阴性对照为磷酸盐缓冲液，阳性对照为细胞上清。
表2为6株单克隆抗体的细胞株制备的腹水效价验证数据表
Figure BDA0002556283210000071
注：判断标准为大于阴性对照OD4502.1倍对应的最大稀释度值即为该腹水的效价。
由表2可知，单克隆抗体的细胞株的腹水效价最高可达1:800万。
由此可见，本发明实施例一提供的杂交瘤细胞株分泌的GPC3单克隆抗体具有较高的效价。
本发明实施例提供的单克隆抗体间断选择8段氨基酸序列进行多肽合成，这使得表达的抗原含多个抗原表位，从而制备的抗体具有较高的特异性，纯化的GPC3单克隆抗原主要以可溶性蛋白的形式存在，且纯度高，富含免疫原性强的芳香族氨基酸，能刺激小鼠成熟的B细胞转变成浆细胞后产生高效价抗体，使腹水效价可达1:800万。
实施例三
本发明实施例提供了一种单克隆抗体的应用，该应用包括将本发明实施例二获得的单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。
具体地，本发明采用实施例二中编号为3、5和6的单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。
优选地，本发明采用实施例二中编号为3的单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。
抗体纯化：采用蛋白G亲和柱纯化编号为3、5和6的单克隆抗体的细胞株提供的腹水。
抗体验证：将纯化后的编号为3、5和6的单克隆抗体的细胞株腹水分别进行小鼠免疫荧光试验，具体实验过程：
1)将浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS(Phosphate Buffer Saline，磷酸缓冲盐溶液)滴加于肝癌细胞系HepG2细胞标本片(该标本片来源为天津市第三中心医院)上，10min后弃去PBS，并使标本片保持一定湿度。
2)以浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS适当稀释编号为3、5和6的单克隆抗体的细胞株腹水，将稀释后的细胞株腹水分别覆盖肝癌细胞系HepG2细胞标本片。将该肝癌细胞系HepG2细胞标本片置于有盖搪瓷盒内，于37℃保温30min。
3)取出肝癌细胞系HepG2细胞标本片并置于玻片架上，先用浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序经过浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
4)取出肝癌细胞系HepG2细胞标本片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，滴加一滴荧光标记的抗人球蛋白抗体。
5)将肝癌细胞系HepG2细胞标本片平放在有盖搪瓷盒内，于37℃保温30min。
6)取出肝癌细胞系HepG2细胞标本片并置于玻片架上，先用浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS冲洗1～2次，然后按顺序经过浓度为0.01mol/L且pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min，不时振荡。
7)取出肝癌细胞系HepG2细胞标本片，用滤纸吸去多余水分，滴加一滴缓冲甘油，再覆以盖玻片。
8)荧光显微镜高倍视野下观察。
其结果分别如图2至图10所示，由图2至图10所示，编号为3、5和6的单克隆抗体均可在肝癌细胞系HepG2细胞表面表达。
将纯化后的编号为3、5和6的单克隆抗体的细胞株腹水分别将经过小鼠Westernblotting(蛋白质印迹法)验证，验证时以β-actin作为阳性对照，其验证结果图11所示，由图11可知，编号为3、5和6的单克隆抗体均可在肝癌细胞系HepG2中表达，且单克隆抗体的分子量为80KD。
由此可见，本发明实施例二提供的单克隆抗体能够作为治疗肝癌的药物。
实施例四
本发明实施例提供了一种采用本发明实施例二提供的单克隆抗体制备致敏胶乳原液的方法，该方法包括：
将胶乳微球加入单克隆抗体中进行偶联，单克隆抗体的浓度为6.2～7.4mg/mL，得到致敏胶乳原液。
具体实验过程：
采用BCA法测定蛋白浓度(96孔板)。
1)配制适量BCA工作液：A:B＝50:1，充分混匀。
2)将蛋白标准品按0μL、1μL、2μL、4μL、6μL、8μL和10μL分别加到96孔板中，加纯化水补充至10μL，取10μL单克隆抗体溶液(2μL单克隆抗体原液+8μL纯化水)加入96孔板，每个测定样本做双孔。具体地，该单克隆抗体为本发明实施例二提供的编号为3的单克隆抗体。
3)每孔加入200μL BCA工作液。
4)37℃温育30min，冷却至室温。
5)在酶标仪中测量562nm时的吸光值。
6)绘制标准曲线，再用标准曲线计算出样品的蛋白浓度。
结果如表3所示：
表3为蛋白浓度
Figure BDA0002556283210000101
由表3可知，单克隆抗体的浓度分别为：6.2mg/mL、5.9mg/mL和7.4mg/mL。
对比例：将单克隆抗体加入胶乳微球中进行偶联，单克隆抗体的浓度为6.2～7.4mg/mL，得到对比例提供的致敏胶乳原液。
实施例四与对比例的参数比较如表4所示。
表4为实施例四与对比例的参数比较
Figure BDA0002556283210000111
由表4可知，相比于对比例提供的致敏胶乳原液，本发明实施例四提供的致敏胶乳原液具有较高的偶联率。
进一步地，胶乳微球的包括数量比为1:1的直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球。
具体实验过程：
试剂盒包括缓冲液R1、胶乳悬浮液R2、GPC3校准品S0、GPC3校准品S1、GPC3校准品S2、GPC3校准品S3和GPC3校准品S4。
缓冲液R1制备方法为：
1)配制0.02M PBS(100mL)：氯化钠0.8502g、十二水合磷酸氢二钠0.5801g、二水合磷酸二氢钠0.05928g，用纯化水定容至100mL。
2)配制2.5％PEG6000的试剂1(缓冲液R1)(100mL)包括：PEG60002.5g、Proclin300100μL和0.02M PBS。
胶乳悬浮液R2制备方法为：
1)配制0.02M PBS缓冲液，pH7.0～7.4；
2)配制胶乳溶液:取100毫克胶乳，13000rpm离心10分钟，取沉淀，溶于20毫升0.02M PBS缓冲液，配制成5毫克/毫升(0.5％)的溶液；其中，胶乳包括：直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球。
3)配制EDAC/NHS溶液:浓度为1毫克/毫升，取10毫克EDAC和10毫克NHS，溶于20毫升0.02M PBS缓冲液；
4)取20毫升胶乳溶液，加入等体积EDAC/NHS溶液，在振荡器中，于室温下反应1小时，再于13000rpm离心10分钟，弃上清取沉淀，将沉淀用20毫升0.02M PBS重悬，同样条件再离心一次，弃上清取沉淀，将再次离心得到的沉淀用0.02M PBS重悬；移除未结合的化合物和蛋白。
5)包被：加入到5毫升单克隆抗体溶液(浓度为2毫克/毫升，缓冲液为0.02M PBS)里，在振荡器中于室温下反应3小时。于13000rpm离心10分钟，弃上清取沉淀，用20毫升0.02M PBS重悬，同样条件再离心一次，弃上清取沉淀，用0.02M PBS重悬沉淀，得到重悬液。
6)封闭：向重悬液中加20毫升浓度为2.5％的BSA溶液(缓冲液为0.02M PBS)，可以用来封阻任何空余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集，混匀后于2～8℃过夜。于13000rpm离心10分钟，弃上清取沉淀，将沉淀用20毫升0.02M PBS重悬，同样条件再离心一次，弃上清取沉淀，将再次离心得到的沉淀用20毫升MIB贮存液重悬，得到胶乳溶液，且胶乳浓度为5毫克/毫升。
7)超声分散：将胶乳溶液放置于冰浴中，进行超声，300W 4秒，间歇8秒，超声10分钟。在处理后的胶乳溶液中加入80毫升MIB贮存液，得到终浓度为1毫克/毫升的致敏胶乳原液，于2～8℃保存。
8)制备稀释液：
配制0.02M PBS(1000mL)包括：氯化钠8.502g、十二水合磷酸氢二钠5.8010g和二水合磷酸二氢钠0.5930g，用纯化水定容至1000mL。
配制稀释液(500mL)：牛血清白蛋白5.5005g、甘油25mL和Proclin300500μL，用0.02M PBS定容至500mL，得到稀释液。
步骤7得到的致敏胶乳原液用稀释液稀释为0.2mg/mL，得到胶乳悬浮液R2。
检测方法：先加试剂R1，加液量150μL，再加样本，加样量2μL，37℃温育5分钟，最后加试剂R2，加液量75μL，测吸光度A1波长：670nm，37℃温育5分钟后，测吸光度A2，计算ΔA＝A2-A1，在全自动生化分析仪上，采用非线性拟合模式建立校准曲线，计算时根据样本的ΔA值在校准曲线上求得相应的浓度。全自动生化仪校准品拟合方式选择log-log 4P模式。结果见表5。
表5为不同数量比的直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球制备的致敏胶乳原液
Figure BDA0002556283210000131
由表5对比可知，数量比为1:1的直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球制备的致敏胶乳原液的敏感度较高。
本发明实施例提供的致敏胶乳原液是将胶乳加入单克隆抗体中进行偶联，在偶联时，能够减少单克隆抗体在高离子强度下与其他微球接触的机会，从而使偶联的结构更稳定，从而提高了偶联率。
实施例五
本发明实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒包括本发明实施例二提供的单克隆抗体。
具体地，该试剂盒包括本发明实施例二中编号为3、5和6的单克隆抗体。
优选地，该试剂盒包括本发明实施例二中编号为3的单克隆抗体。
此外，该试剂盒还可以包括：缓冲液R1、胶乳悬浮液R2、GPC3校准品S0、GPC3校准品S1、GPC3校准品S2、GPC3校准品S3和GPC3校准品S4。
用上述试剂盒对100例肝癌患者血清及198例健康体检人血清进行试验验证，其中，肝癌的诊断符合2011年中国卫生部医政司发布的《原发性肝细胞癌诊疗规范2011版》中的肝细胞癌的三大临床诊断标准，三大临床诊断标准包括慢性肝病背景、影像学检查结果以及血清AFP水平，验证结果分别如表6和表7所示。
表6为肝癌患者血清检测结果
Figure BDA0002556283210000141
Figure BDA0002556283210000151
表7为健康体检人血清检测结果
Figure BDA0002556283210000152
Figure BDA0002556283210000161
结合表6和表7，采用SPSS 17.0统计软件绘制如图12所示的ROC曲线，且AUC＝0.937。当cut off为32μg/mL时，其灵敏度为91％，特异度为95％。
下面简单介绍一下该试剂盒的使用方法，具体如下：
先加缓冲液R1 150μL，再加待测样本2μL，于37℃温育(可以为水浴)5min，最后加胶乳悬浮液R2 75μL，测得吸光度为A1，于37℃温育5min后，测得吸光度为A2，在全自动生化分析仪上，采用非线性拟合模式建立校准曲线，计算时根据样本的ΔA值(ΔA＝A2-A1)在校准曲线上求得相应的浓度。
本发明实施例提供的试剂盒，采用胶乳增强技术制备胶乳悬浮液R2，从而将抗体连接在微小的胶乳颗粒上，当抗原抗体结合形成抗原-抗体-胶乳颗粒复合物，增加了免疫复合物的直径，提高了检测敏感性，也减少了受到其他非特异性反应的影响，最终使得本发明实施例提供的试剂盒的敏感性和特异度分别为91％和95％，即具有高灵敏性和高特异度。同时，该试剂盒样品用量少，操作简单，可全自动完成，反应时间短，稳定性好。
虽然本发明所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本发明而采用的实施方式，并非用以限定本发明。任何本发明所属领域内的技术人员，在不脱离本发明所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本发明的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。

Claims (10)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：19944。
2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株获得。
3.一种如权利要求2所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
从磷脂酰肌醇硫酸类肝素蛋白聚糖-3的氨基酸序列上间断选择8段氨基酸序列；
将所述8段氨基酸序列分别合成多肽；
采用所述多肽免疫动物；
提取所述动物的脾细胞；
将所述脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到含有所述杂交瘤细胞株的混合物；
将所述混合物进行选择性培养，得到所述杂交瘤细胞株；
将所述杂交瘤细胞株进行细胞培养，得到所述单克隆抗体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述融合的方法包括：将所述脾细胞与骨髓瘤细胞混合，再加入第一培养液培养后，进行离心，得到第一沉淀；
将所述第一沉淀与聚乙二醇混合，再加入第二培养液培养后，得到含有杂交瘤细胞株的混合液；
将所述混合液进行离心，得到第二沉淀；
将所述第二沉淀加入选择性培养液中进行选择性培养，培养时间为10～14天，选取OD值高的沉淀细胞通过有限稀释法进行克隆化培养，得到所述单克隆抗体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将所述第一沉淀于37℃水浴中放置5min再与37℃的聚乙二醇混合，所述聚乙二醇的浓度为30％～50％，再滴加37℃的完全培养液，最后加入RPMI-1640培养液进行培养，得到含有所述杂交瘤细胞株的混合物。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述8段氨基酸序列包括GPC3蛋白序列的第311～322位氨基酸、324～334位氨基酸、357～367位氨基酸、398～408位氨基酸、422～432位氨基酸、521～530位氨基酸、546～555位氨基酸和569～578位氨基酸。
7.一种如权利要求2所述的单克隆抗体的应用，其特征在于，所述应用包括将所述单克隆抗体作为治疗肝癌的药物。
8.一种采用如权利要求2所述的单克隆抗体制备致敏胶乳原液的方法，其特征在于，所述方法包括：
将胶乳微球加入所述单克隆抗体中进行偶联，所述单克隆抗体的浓度为6.2～7.4mg/mL，得到所述致敏胶乳原液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述胶乳微球的包括数量比为1:1的直径为0.080μm和直径为0.333μm的胶乳微球。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求2所述的单克隆抗体。
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