CN111886030A - 骨移植替代物及其制造方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制备包含三维多孔结构的合成的生物可降解骨移植物的方法，用于所述方法的组分的配方，通过所述方法产生的合成的生物可降解骨移植物；以及包括使用所述骨移植物的手术方法。
Description
技术领域
本发明涉及制备包含三维多孔结构的合成的生物可降解骨移植物的方法，用于所述方法的组分的配方，通过所述方法产生的合成的生物可降解骨移植物，以及包括使用所述骨移植物的治疗/手术方法。
背景技术
由骨肿瘤、疾病和创伤引起的骨缺损对整形外科和材料科学家来说是巨大的挑战。这类骨缺损导致骨结构中的空隙。骨通常可以完全再生，但是除非缺损空间很小，否则在生长过程中需要某些形式的支架来支撑它。因此，骨缺损的修复需要一种必须能够支持缺损部位的骨再生的空隙填充材料。骨组织再生需要生物活性支架或骨移植替代物来引导沉积新的骨基质以形成骨的功能性成骨细胞。支架的多孔结构模仿骨结构，对骨再生的成功至关重要。
用于骨移植的最合适的材料是从患者自身收集的骨组织。这称为自体(autologous)或自生(autogenous)骨移植物。然而，从患者收集自体骨移植物存在重大挑战。首先，患者的可用来收获自体骨移植物的可用供体部位是受限的。另外，自体骨移植物的收获需要额外的手术。已经表明，这种手术可以在供体部位引起发病。
同种异体骨移植物代表了替代选项，它们可以存储在骨库中，供以后使用，但不幸的是，同种异体骨移植物的可用性不仅受到限制，而且还具有通过病毒或细菌传播疾病的潜在风险。
已知通常在称为异种骨移植的过程中使用生物来源的材料来产生骨移植替代物，作为自体骨移植物的替代选项。可以使用诸如牛多孔脱矿质骨或脱矿质骨基质(demineralized bone matrix,DBM)等基质。但是，这些材料在植入患者体内时也存在疾病转移的风险以及免疫应答。已经采用去质子化和脱脂来降低抗原反应，但是已经证明这是以材料的骨诱导能力为代价的。
目前，可合成的钙基骨移植替代物(bone graft substitutes,BGS)，例如生物活性玻璃陶瓷、磷酸钙陶瓷(羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(TCP)或双相磷酸钙)可用于临床。这些材料具有生物相容性和骨传导性。在使用中，尽管尚未实现这些材料在再生方面的全部成功率，但已证明该材料可将再生性骨组织从缺损的周围引导向移植中心以填充并再生缺损。部分原因是连接孔和多孔结构对于有效的骨形成必不可少，但是陶瓷通常很脆，因此这些材料在不损害其机械性能的情况下不适合提供多孔结构。而且，有问题的是，这些材料有许多不是生物可降解的。例如，羟基磷灰石陶瓷不是生物可降解的：在临床试验中植入后的3-4年，β-磷酸三钙(β-TCP)几乎没有表现出吸收。由于移植物与宿主骨组织之间机械性能的差异，生物不可降解或生物降解缓慢的骨移植物可能会有产生应力的风险，并可能导致骨折。此外，在感染的情况下，体内残留的生物不可降解骨移植物可能是细菌生物膜形成的来源。
使用珊瑚作为骨移植替代物是众所周知的。坚硬的珊瑚由无数个被其分泌的碳酸钙“骨架”黏合在一起的珊瑚虫形成。珊瑚的结构类似于松质骨的结构。珊瑚还具有生物相容性，并且具有骨传导性和可吸收性，还可以使骨结构完全再生。然而，在世界许多地方，商业上可获得的珊瑚受到限制，其供应有限，它的生长非常缓慢，因此非常昂贵。美国专利8,936,638使用了在特殊环境中养殖珊瑚的技术，该环境中添加了硅、硅酸钙、镁和磷酸盐等营养物质，一旦珊瑚得以收获和加工，就可以增强骨形成。但是，在养殖的珊瑚准备好使用之前，这是一个漫长的过程。
因此，显而易见的是，由于以下因素之一或全部，当前的骨移植替代物不能完全令人满意：(1)资源有限；(2)过敏或疾病传播；(3)最佳孔径和连接性多孔结构；(4)合适的机械性能和/或(5)可控制的生物降解性能。因此，用于骨损伤修复和重建的骨移植替代物的需求并未得到满足，该替代物可以随着时间的推移而生物降解，仅将再生的骨留在其位置。材料可以生物降解而不在患者体内留下任何有毒残留物也很重要。同时，材料的结构必须在适当长的时期内保持存活以使骨完全再生。因此，除了生物可降解性本身之外，生物降解的时期也很重要。
因此，我们在本文中公开了改进的骨移植替代物和使用三维打印工艺制备该替代物的方法，该替代物解决了上述问题，和/或总体上提供了改进。我们出乎意料地发现，使用具有给定黏度的无机和有机组合物的混合物，我们可以形成模仿珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙的生物可降解骨替代物。我们还发现，该支架对于诸如人间充质干细胞(hMSC)等填充细胞(populating cell)无毒，与组织具有生物相容性，并可以通过传导性骨发生修复骨缺损。此外，通过改变组成，除了其机械性能之外，还可以小心地控制骨支架的生物降解。最后，通过制造方法-打印工艺-可以小心地控制和限定孔径。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了制备合成的生物可降解骨移植替代物的方法，该方法包括：
(a)以任何顺序混合碳酸钙、黏合材料和润湿剂和/或胶凝剂以制造水泥或浆料，其中黏合材料至少包含在至少所述润湿剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分；和
(b)使(a)部分的水泥或浆料渗出(exude)成或压缩成适合起到骨移植物作用的形状。
在本发明的优选方法中，以指定的顺序执行以下步骤：
(a)将碳酸钙与黏合材料混合以提供粉末状混合物，其中黏合材料至少包含在润湿剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分；
(b)将(a)部分的粉末状混合物与湿润剂和/或胶凝剂混合以制备水泥或浆料；
(c)使用三维打印机将来自(b)部分的水泥或浆料的三维骨移植替代物(3D-BGS)打印到平台上。
本文中提到的3D打印，也称为增材制造(additive manufacturing,AM)和快速原型制作(Rapid Prototyping)，包括诸如生物打印、选择性激光烧结和熔融沉积建模(fuseddeposition modelling,FDM)等技术。这些技术能够基于3D计算机辅助设计(ComputerAided Design,CAD)模型产生复杂的实心或空心结构组件。3D打印方法可快速产生组件，而无需使用工具。
在优选的实施方案中，三维打印机优选是生物打印机。生物打印机包括注射器，该注射器在受控条件下将混合物推过喷嘴，以建立三维结构。生物打印通过从喷嘴注入糊剂(paste)、凝胶、水泥或浆料，然后它们硬化以形成3D结构，来使用诸如3D生物绘图仪之类的设备。3D生物打印机可以用于打印具有选定的机械性能的多孔支架。3D生物打印机可用于打印具有选定机械性能的多孔支架。有利的是，与其他打印方法相比，已经发现，当使用生物打印时，不需要烧结或熔融，并且该方法能够仔细地控制结构中的连接孔和所需的孔径。还令人惊讶地发现，使用生物打印实现了机械强度的提高。
如本领域技术人员应当理解的，碳酸钙可以从许多来源获得，并且可以用于本发明的方法中。在优选的实施方案中，碳酸钙可以是天然存在的或合成制造的。最理想的是，所述碳酸钙从天然来源获得，例如但不限于墨鱼骨。墨鱼骨的使用提供了便宜而又无穷尽的基质材料源，当与黏合材料组合使用时，其提供了类似于骨和珊瑚的化学和结构特性。
在又一个优选的实施方案中，所述碳酸钙以粉末形式提供。
已经发现，碳酸钙的相对量对于确定骨移植替代物的生物降解特征是重要的，并且发现作为最终产品的一部分，碳酸钙的量越高，生物降解越快。此外，且重要的是，碳酸钙的相对量对于所得骨移植替代物的机械强度是必不可少的，量不足会导致产品崩解。相反，当存在的碳酸钙的量过多时，则水泥无法得以打印或导致缺陷的移植物形成。因此，在又一个优选的实施方案中，所提供的碳酸钙的量按重量计为水泥的10-60％，包括其间的每个0.1％。已经发现，在该范围内，水泥可以容易地得以打印，并且导致机械稳定的所得骨移植替代物。更理想的是，所提供的碳酸钙的量按重量计为水泥的20-50％，包括其间的每个0.1％。
在又一个优选的实施方案中，碳酸钙可以是微粒或纳米颗粒的形式。如本领域技术人员应当理解的，本文中提及微粒或纳米颗粒分别指直径小于1000微米或小于1微米的碳酸钙颗粒。在优选的实施方案中，所述微粒在1-30μm的范围内，包括其间的每个1μm整数。优选地，使用纳米颗粒。已经发现，纳米颗粒的使用增加了3D-BGS的机械强度。更优选地，纳米颗粒的直径为约1-999nm，还更优选10-999nm，包括其间的每个1nm整数。仍更优选地，所述纳米颗粒在约10-500nm的范围内，包括其间的每个1nm整数。最理想的是，所述纳米颗粒在约50-250nm的范围内，包括其间的每个1nm整数。
本文中提及的黏合材料是指具有在溶液/水存在的情况下一起发生反应的至少第一组分或化学化合物和至少第二组分或化学化合物，且使碳酸钙颗粒彼此黏合、固化并形成多孔3D-BGS的材料。
有利的是，已经发现，在这种布置中，黏合材料能够黏合碳酸钙并提供机械强度改善的3D-BGS。这对于骨移植替代物特别有利，因为在保持生物降解性的有益特性的同时，显著降低了脆性。因此，大大降低了损坏身体内部或外部结构的风险。
在优选的实施方案中，所述第一组分包含第一磷酸钙，且第二组分包含第二磷酸钙，其中第一组分的所述第一磷酸钙的钙与磷酸盐之比(Ca/P比)比第二组分的磷酸钙高。以此方式，第一组分和第二组分发生反应，产生羟基磷灰石(HA)或磷酸钙水泥(calciumphosphate cement,CPC)。
在优选的实施方案中，所述第一磷酸钙和第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
更理想的是，所述第一磷酸钙和第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)，条件是当所述第一磷酸钙为TCP时，所述第二磷酸钙不是DCP，反之亦然。
更理想的是，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，且所述第二磷酸钙选自：
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
最理想的是，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，且所述第二磷酸钙选自：
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
有利的是，根据该优选实施方案，例如，根据以下反应式，TTCP可以与一种或多种磷酸钙(具有较低的Ca/P比)发生反应，以形成羟基磷灰石，而没有形成作为反应副产物的酸或碱：
7Ca4(PO4)2O+2Ca(H2PO4)2·H2O→6Ca5(PO4)3OH+3H2O
2Ca4(PO4)2O+Ca(H2PO4)2·H2O→Ca9(HPO4)(PO4)5OH+2H2O
Ca4(PO4)2O+CaHPO4→Ca5(PO4)3OH+2H2O
3Ca4(PO4)2O+6CaHPO4·H2O→2Ca9(PO4)(PO4)OH+13H2O
3Ca4(PO4)2O+6CaHPO4→2Ca9(HPO4)(PO4)5OH+H2O
3Ca4(PO4)2O+Ca8H2(PO4)6·5H2O→4Ca5(PO4)3OH+4H2O
3Ca4(PO4)2O+3Ca8H2(PO4)6·5H2O→4Ca9(HPO4)(PO4)5OH+14H2O
Ca4(PO4)2O+2Ca3(PO4)2+H2O→Ca5(PO4)3OH
在优选的实施方案中，所提供的包含第一组分和第二组分的黏合材料按重量计为水泥的10-50％，包括其间的每个0.1％。最理想的是，所提供的碳酸钙的量按重量计为水泥的25-40％，包括其间的每个0.1％。
在又一个优选的实施方案中，第一和第二组分以固体形式提供，并以相对量混合并研磨在一起，其中第一组分与第二组分之比为约0.5-5.5，更优选约1-1.5。已经发现，第一和第二组分的相对比例对于骨移植替代物的机械强度和结构完整性是重要的，考虑到所需强度根据骨移植物的预期目的而变化，机械强度和结构完整性是可变的。
为了能够从生物打印机中渗出或注入，混合物必须能够流动。因此，在优选的实施方案中，产品为糊剂或浆料的形式。该混合物也可以称为胶体，因为它表现出介于固体和液体之间的性质。
另外，上述(a)部分还可以包括混合添加剂，其中所述添加剂是影响黏度从而确保混合产品具有合适流动性以流动但不至于使该混合产品在渗出或受压时不能保持形状的任何化合物。这也会影响机械强度和凝固时间，因此必须牢记控制黏度。在优选的实施方案中，所述添加剂选自明胶、胶原、纤维素、自组装肽或生物墨水。最理想的是，所述添加剂是明胶，因此还满足作为胶凝剂的要求。
在又一个优选的实施方案中，将所述添加剂提供于溶液或溶剂中，最理想的是提供于水中。
进一步发现，添加剂的相对比例对于产品的流动性是重要的。因此，在又一个优选的实施方案中，所提供的所述添加剂按重量计为水泥的10-50％，包括其间的每个0.1％。更理想的是，所提供的添加剂的量按重量计为水泥的25-50％，包括其间的每个0.1％。最理想的是，所提供的添加剂的量按重量计为水泥的25-40％，包括其间的每个0.1％。
在又一个优选的实施方案中，步骤(a)和优选的步骤(b)中与润湿剂或胶凝剂的混合优选在10℃至60℃的温度下进行，包括其间的每个0.1℃整数。这样的温度范围有利于保持混合物的期望黏度，同时还确保在温度变得过高时不会无意地使黏合材料凝固。更优选地，使用20-60℃的温度，包括其间的每个0.1℃整数。仍更优选地，使用25-40℃的温度，包括其间的每个0.1℃整数。甚至更优选地，温度范围为30-37℃，包括其间的每个0.1℃整数。这确保了混合物处于优化的热窗口中，以确保黏度，同时还确保一旦沉积就迅速发生凝固，从而保持渗出、压缩或打印的结构的所需形状。
在又一个优选实施方案中，该方法包括提供平台，3D-BGS被渗出、压缩或打印在该平台上，其中选择平台的温度，使得第一组分和第二组分的反应速度降低，同时还确保明胶冷却以促进为结构提供优化和优选的形状。平台的合适温度范围为1℃-40℃，更优选2.5℃-10℃，包括其间的每个0.1℃整数。
在又一个优选的实施方案中，步骤(c)的打印包括逐层沉积步骤(b)的混合物以产生3D-BGS，其中理想的是，相对于前一层以一定角度沉积每一层以生成多孔结构，最理想的是，每层之间的所述角度为约90°。形成的所得的3D-BGS具有多孔结构，其中孔的3D矩阵彼此互连。这些孔形成相互连接的隧道，从而产生像松质骨一样的结构。
最理想的是，控制步骤(c)的打印，以在3D-BGS产品中产生期望的孔径，其中根据预期用途选择所述孔径。在优选的实施方案中，步骤(c)产生的孔径为1-1000μm，包括其间的每个1μm整数。最优选地，孔径为200-750μm，包括其间的每个1μm整数。
在又一个优选的实施方案中，步骤(c)还包括打印于包含支撑材料的基材上，其中以使得所述支撑材料部分或全部掺入3D-BGS中的方式沉积所述水泥。如本领域技术人员应当理解的，所述支撑材料可以进一步增强3D-BGS的机械性能，例如进一步提高的机械强度，这在骨移植物用于经受高机械应力的身体组织或骨的情况下可以是合适的。这种支撑材料的实例包括但不限于碳纳米管、天然或合成聚合物微纤维，例如聚-L-丙交酯(PLA)或丝心蛋白。
在某些应用中，可能期望产生释放活性剂的骨移植替代物，使得当掺入到体内时，活性剂被释放到周围组织中。此类活性剂的实例包括药物制剂和药物，尤其是小分子药物以及生物大分子、包括生长因子/成熟因子在内的生物制剂以及已知可促进骨和软骨生成、降低或消除感染风险或防止异常细胞生长的试剂，例如但不限于生长因子(例如骨形态发生蛋白、BMP、PDGF、FGF、EGF等)、抗生素(例如用于骨髓炎的庆大霉素和万古霉素)、抗炎剂/抗骨吸收剂(例如双膦酸盐)、甾体药物、抗癌治疗剂(例如地诺单抗(Denosumab)、顺铂和紫杉醇)。如本领域技术人员应当认识到的，取决于要包括的活性剂的性质，可以在渗出、压缩或打印步骤之前，例如通过将活性剂掺入步骤(a)的混合物中，将活性剂掺入到水泥、浆料或产品中。有利的是，由于该方法不需要极端温度或固化剂，因此在制造过程中不会损害活性剂的活性。或者，在某些情况下，可在步骤(b)或(c)期间或之后将活性剂掺入水泥、浆料或产品中。
已经发现碳酸钙支架具有相对快速的生物降解速率，其不最佳适合于骨移植产品。因此，在另一个优选的实施方案中，该方法还包括最终步骤(c或d)，其中将碳酸钙转化为磷酸钙，或用磷酸钙涂覆，最优选转化为羟基磷灰石(HA)或用其涂覆，羟基磷灰石(HA)是天然骨矿物组合物，并且其生物降解速率要慢得多。可以在渗出、压缩或打印步骤之后进行碳酸钙向HA的转化。
在一个实施方案中，可以使用水热转化将碳酸钙转化为HA，在一个实施方案中，其遵循以下反应式：
10CaCO3+6(NH4)2HPO4+2H2O→Ca10(PO4)6(OH)2+6(NH4)2CO3+4H2CO3
在水热转化过程中，将3D-BGS浸入反应器内的0.6mol/ml磷酸二氢铵溶剂中，然后在120℃下反应2-16小时，包括其间每个1小时的整数。该化学反应后，用去离子水洗涤支架，并彻底除去任何未反应的二氢铵，然后在烤箱中于低于37-60℃温度下干燥，包括其间的每个0.1℃整数。在高压灭菌过程中发生的化学反应将碳酸钙转化为HA形式的磷酸钙。选择高压灭菌的时间长度，以改变转化程度。优选地，选择高压灭菌时间，以实现部分转化，其中，部分但不是全部碳酸钙转化为HA。已经发现HA具有陶瓷结构，结果HA的生物降解速率不合需要地缓慢，因此不希望支架完全转化为HA。相反，优选碳酸钙部分转化为磷酸钙，同时控制转化程度以实现所需的3D-BGS生物降解速率。
作为选择，可以在形成后用HA涂覆3D-BGS。可以使用模拟体液(simulated bodyfluid,SBF)来制造HA，模拟体液是离子浓度接近人体血浆离子浓度的溶液。将3D-BGS浸入温度为约37℃的SBF溶剂中。SBF溶剂的离子浓度为Na+ 142.0，K+ 5.0，Ca2+ 2.5，Mg2+ 1.5，Cl- 147.8，HCO3-4.2，HPO4 2- 1.0，SO4 2- 0.5(以mM为单位)。用缓冲液例如三羟甲基氨基甲烷(Tris,50mM)和比例为1M-HCl 40ml/L和(CH2OH)3CNH2 6.057g/L的盐酸将SBF缓冲在pH7.4。3D-BGS在SBF中保持浸入的时间为1天到14天。具体而言，可以在1-7天之间(包括其间的每个0.5天)改变浸入时间，以控制HA转化程度。
根据本发明的第二方面，提供了用于制备三维骨移植支架的混合物，其包含碳酸钙和黏合材料，其中黏合材料包含在湿润剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应，以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分。
在优选的实施方案中，所述混合物所包含的碳酸钙的量按重量计为水泥的10-60％，包括其间的每个0.1％。已经发现，在这种量时，水泥可以容易地得以打印，并导致机械稳定的所得骨移植替代物。更理想的是，所提供的碳酸钙的量按重量计为水泥的20-50％，包括其间的每个0.1％。
在优选的实施方案中，所述第一磷酸钙和第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
更理想的是，所述第一磷酸钙和第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)，条件是，当所述第一磷酸钙为TCP时，所述第二磷酸钙不是DCP，反之亦然。
更理想的是，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，且所述第二磷酸钙选自：
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
最理想的是，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，且所述第二磷酸钙选自：
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)，
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
根据本发明的第三方面，提供了包含碳酸钙和多孔支架的三维骨移植替代物(3D-BGS)，所述多孔支架的结构为松质状，并且部分或完全涂覆有羟基磷灰石(HA)。
在优选的三维骨移植替代物(3D-BGS)中，所提供的所述碳酸钙的量按重量计为10-60％，包括其间的每个0.1％。已经发现，在这种量时，水泥可以容易地打印，并导致机械稳定的所得骨移植替代物。更理想的是，所提供的碳酸钙的量按重量计为20-50％，包括其间的每个0.1％。
根据本发明的第四方面，提供了治疗骨缺失的方法，包括将本发明的3D-BGS插入骨中或附着于骨上。
本发明的每个方面的优选特征可以如结合任何其他方面所描述的。
在本公开内容的整个说明书和权利要求书中，词语“包含/括(comprise)”和“含有(contain)”以及该词的变体例如“包含/括(comprising)”和“包含/括(comprises)”是指“包括但不限于”，并且不排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。在本公开内容的整个说明书和权利要求书中，单数涵盖复数，除非上下文另外要求。特别是，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则应将本公开内容理解为考虑了复数以及单数。
本公开内容中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请，均通过引用并入本文。不承认任何参考文献构成了现有技术。此外，不承认任何现有技术构成了本领域公知常识的一部分。
根据以下实施例，本发明的其他特征会变得显而易见。一般而言，本发明扩展到本公开内容(包括伴随的权利要求和附图)中公开的特征的任何新颖特征或新颖的组合。因此，结合本发明的具体方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特征、化合物或化学部分应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。
此外，除非另有说明，否则本文公开的任何特征可以由用于相同或相似目的的替代特征替代。
现参考以下实施例和下述附图，仅以举例的方式描述本发明，其中：
图1示出了用于产生本发明的说明性实施方案的结构的生物打印机的示意图；
图2示出了随温度变化的明胶黏度的图形；
图3示出了(a)用于3D打印的生物绘图仪，和(b)由生物绘图仪制备的3D-BGS的实例；
图4示出了3D-BGS(红色)和标准羟基磷灰石(HA；黑色)的傅立叶变换红外(FTIR)光谱；
图5示出了3D-BGS的FTIR光谱，其含有50％的粉末状且在水中浸湿了48小时的CaCO3(黑色)、标准HA(红色)、TTCP(绿色)和CaHPO4(蓝色)；
图6示出了针对3D-BGS统计分析的Alamarblue检测，按重量计其含有35％、42％、28％的碳酸钙；
图7示出了人间充质干细胞(hMSC)在用Live/Dead染料染色的3D-BGS支架上的生长。蓝色荧光表示所有细胞，绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞。(A)hMSC在含有38％重量百分比的CaCO3的支架上生长。(B)hMSC在含有46％重量百分比的CaCO3的支架上生长。(C)hMSC在含有30％重量百分比的CaCO3的支架上生长；
图8.电子扫描显微照片(SEM)显示了3D-BGS的多孔结构(A、C)，支撑hMSC附着和生长(D)的表面上的纳米HA晶体(B)；它可与(E,G)的多孔结构、表面上的纳米HA晶体(F)以及在珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙(CHACC)上的hMSC附着和生长(H)相媲美；
图9.植入胫骨和胫骨前肌之间的软组织的3D-BGS和胶原海绵的组织学显微照片。通过光学显微术，它表明明胶海绵植入(对照)导致胫骨和胫骨前肌之间的纤维组织(A)。3D-BGS植入3周后，该材料主要被成纤维细胞、巨噬细胞覆盖；有趣的是，有骨样组织小块形成(B)。TEM观察证实了光学显微镜术的发现，如在对照明胶海绵植入中一样，观察到供组织再生的巨噬细胞反应和纤维细胞浸润(C)；而在小块骨样组织中，观察到具有小管样结构和钙化陷窝(lacunae)的典型骨细胞样细胞(D)；
图10.MicroCT(显微CT)图像显示了在1个月(A和B)、2个月(C和D)和3个月(E和F)时，与明胶海绵植入相比，3D-BGS对大鼠股骨骨缺损的成骨能力和生物降解能力。值得注意的是，明胶海绵植入中的不愈合骨缺损(A、C和E)，以及围绕3D-BGS的愈伤组织形成(B)，骨髓腔中3D-BGS与小梁骨形成的整合(D)，以及3D-BS和愈伤组织的生物降解和重塑(F)。
图11.羟基磷灰石(HA)、珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙(CHACC)、3D-BGS和碳酸钙的X射线衍射分析(XRD)。在3D-BGS的XRD图案中，3D-BGS中碳酸钙的衍射峰仍然可见。更重要的是，羟基磷灰石(HA)的衍射峰出现在29.1°、32.9°、34.1°、39.6°以及49.5°的2θ值处，分别对应于(002)、(211)、(300)、(130)以及(213)平面。这些衍射峰与纯HA(JCPDS PDF#09-0432)的衍射标准数据非常一致；
图12.HA、CHACC、3D-BGS和碳酸钙的FTIR光谱比较。FTIR光谱的参考样品显示，在v1—963cm-1、v3—1036和1095cm-1、v4—568和600cm-1处的吸收是由于PO3 -4离子引起的，OH-基位于630cm-1处。FTIR光谱的参考样品在1453.7cm-1的ν3峰、853.8cm-1的ν2峰、1083.8cm-1的ν1峰以及699.2和712.2cm-1的ν4峰处的吸收对应于CO3 2-。与TTCP(Ca4(PO4)2O)的FTIR光谱相比，TTCP没有实现1036和1417cm-1处的强峰，并且3D-BGS的FTIR揭露了位于640cm-1处的OH-基团，这表明TTCP和DCDA的混合物已转化为HA。HA存在的另一个有力证据是，该峰出现在约961cm-1处。3D-BGS中显示出CO3 2-的ν4吸收峰，这意味着在所有过程之后碳酸钙仍然保留在3D-BGS中。将峰均从参考峰中移位，但以合理的值进行。
图13.针对3D-BGS、CHACC和细胞的统计分析进行的Alamarblue分析仅证明，3D-BGS是无毒的人间充质干细胞。
图14.在用Live/Dead染料染色的3D-BGS支架上生长的人间充质干细胞(hMSC)。蓝色荧光表示所有细胞，绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞。
图15.3D-BGS对大鼠股骨髁间骨缺损模型影响的总体观察。对照组在三个月内显示出骨缺损部位纤维组织形成，而在3D-BGS植入组中，在三个月内在植入物周围形成骨，并发生了生物降解。箭头指示支架。
图16.植入后3个月，光学显微术和后向散射SEM显微术说明了新骨和3D-BGS材料的整合。[A]深色区域表示植入的3D-BGS，浅灰色区域是新的小梁骨形成，蓝色区域是骨髓(含有脂质滴)、血管和骨组织中甲苯胺蓝染色细胞。3D-BGS植入物已完全整合，并牢固地黏合到新的小梁骨组织。大多数3D-BGS降解并被新的骨形成代替。[A]的高倍放大[B]显示了新形成的小梁骨组织内的生物降解的3D-BGS的大颗粒。分散的甲苯胺蓝染色的小点是骨细胞，而大的甲苯胺蓝区域是骨髓(含有脂质滴)和新血管。[B]中标记区域的高倍放大[C]。带有小管的甲苯胺蓝染色的点是骨细胞，而大的甲苯胺蓝区域是新血管。[D]后向散射显示的高电子密度晶体证明了3D-BGS颗粒的位置。白色箭头表示骨细胞陷窝。骨细胞与3D-BGS紧密整合。
图17.植入后1、2和3个月，3D-BGS横截面的SEM后向散射微观图示、能量弥散X射线谱(EDS)图和元素分析。高结晶区域是3D-BGS植入物，其中该区域在三个月内减小(A，B和C)。EDS作图显示了植入物和骨组织的钙(A1、B1和C1)和磷酸盐(A2、B2和C2)组成。
图18.X射线摄影显示，在植入后第1天、第1个月、第3个月和第6个月时，在Bama小型猪的Φ5mm骨缺损中植入的5种骨移植材料的比较。在1天至3个月之间，存在明胶海绵(1)植入的不愈合，并且在6个月时在缺损中形成骨。2种3D-BGS配方植入物(2和3)在3个月内愈合，并出现明显的生物降解迹象(密度与没有间隙的骨相似)，并在6个月时缺损修复。纯无孔羟基磷灰石(4)是愈合的，但不降解。猪同种异体移植物(5)是愈合的，但骨缺损区域在3个月内仍存在间隙，但在6个月时完全修复。
表1.用于打印的基于实验室的生物绘图仪的参数；
表2.在室温下每个测试中明胶和CaCO3的比例，明胶溶剂占水泥的35％(重量百分比)；
表3.在32℃下每个测试中明胶和CaCO3的比例，明胶溶剂占水泥的42％(重量百分比)；
表4.在37℃下每个测试中明胶和CaCO3的比例，明胶溶剂占水泥的35％(重量百分比)；
表5.具有固定粉末组分(0.388g CaHPO4、0.612g TTCP和1g CaCO3)的不同重量百分比的明胶溶剂(浓度为15％)的可行性测试；
表6.实例3D-BGS中每种组分的重量百分比
表7.后向散射图像中剩余的高结晶植入物的比例
材料和方法
材料
来自牛皮肤的明胶由Sigma-Aldrich(西格玛奥德里奇)提供；明胶粉由Merk KGaAGermany(德国默克公司)提供；hMSC在南威尔士研究伦理委员会(South-Wales ResearchEthic Committee)批准(REC参考：12/WA/0029)和知情同意下从患者的骨分离；Alamarblue和LIVE/
Viability/Cytotoxicity Kit由Thermal Fisher-Life Technology提供；TTCP(磷酸四钙)由上海瑞邦生物材料有限公司(Shanghai Rebone Biomaterials Co.,Ltd)提供；磷酸氢钙由上海瑞邦生物材料有限公司提供；碳酸钙(99％)由Sigma-Aldrich提供。
可行性研究
按照以下反应式，将不同比例的碳酸钙、TTCP和磷酸氢钙混合在一起：
并研磨20分钟。通过混合明胶粉和双蒸馏水制备不同浓度的明胶溶剂，并将其放置在37℃的烤箱中过夜。将混合的粉末和明胶溶剂在37℃的环境中手动充分混合。将水泥(粉末和溶剂的混合物)转移到注射器中，并按压水泥以检查其是否可以出来和站立以保持结构。还通过将TTCP、磷酸氢钙和双蒸馏水混合在一起来测试水泥凝结时间，使混合物处于4％和37℃的状态。每两分钟检查混合物是否结块。
黏度测试
取出明胶溶剂并将其装载在rotonetic 2驱动器的平台(Bohlin Gemini HR)上。使用20mm夹钳测试黏度和凝胶传输温度(gel transmission temperature)，测试温度为25-37℃。
3D打印方法
将碳酸钙、TTCP和磷酸氢钙混合在一起并研磨20分钟。通过将粉末和去离子水混合制备明胶溶剂，并将其放置在37℃的烤箱中过夜。将混合的粉末和明胶溶剂在37℃的环境中手动充分混合。将糊剂(粉末和溶剂的混合物)转移到注射器中。加载直径为2.5mm的金属喷嘴。由生物绘图仪制造商系列(EnvisionTec)构建支架，参数如表1所示。
FTIR
通过光谱分辨率为4cm-1的FT-IR光谱仪(PerkinElmer UATR Two),测试碳酸钙、TTCP、磷酸氢钙、明胶、纯羟基磷灰石和3D打印支架。
细胞毒性(hMSC)
将从患者的骨分离的hMSC接种到T75烧瓶中，并将其保持在培养箱中，直到约75％的烧瓶被细胞覆盖，并将细胞培养至下一代。每三天更换培养基。10天后，将细胞接种在已经用PBS洗涤两次的支架上，并浸入αMEM中过夜，以进行Alamarblue检测和Live/Dead染色。
Alamarblue检测
将具有支架和细胞的孔用PBS洗涤两次，并在培养箱内在用5％Alamarblue和95％培养基配制的Alamarblue溶剂中浸泡2小时。2小时后将Alamarblue溶剂转移到黑色96孔板中，通过酶标仪(BMH LABTECH,系列号：415-1387)显示结果。
Live/Dead染色
将具有支架和细胞的孔在PBS中洗涤两次，并在培养箱内在Live/Dead染料中浸泡15分钟，该Live/Dead染料是按照PBS 2ml、钙黄绿素AM 1μL、EthD-1 2μL和Hechst 33324 5μL的比例配制的。染色后,将细胞用PBS洗涤两次。结果显示在共聚焦显微镜(ZEISS LSM710)中。
扫描电子显微术(SEM)观察
通过SEM观察了在掺入hMSC 2周前后珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙(CHACC)和3D BGS的表面结构。简而言之，将hMSC在CHACC和3D BGS上培养2周后，将材料固定在0.1M PBS中的4％戊二醛中，在一系列乙醇中脱水，将乙醇替换为50％和100％六甲基二硅氮烷(hexamethlydisilizane)、风干、溅射镀金并通过SEM观察。
大鼠胫骨与胫骨前肌之间的并置植入(Juxtapositional implantation)
给成年Waster大鼠(6-8周)腹腔内注射400mg/kg的水合氯醛，进行麻醉；仰卧放置。剃光前腿，小心地在胫骨和胫骨前肌之间产生5-7mm的切口，但不损伤胫骨上的骨膜。切开皮下筋膜以暴露胫骨和胫骨前肌，并在胫骨和胫骨前肌之间并置植入2mm×2mm×2mm(1)临床应用的明胶海绵；(2)3D BGS；和(3)含有10％生物玻璃的3D BGS。皮下缝合伤口，然后缝合整层皮肤，并用聚维酮碘清洗以避免感染。镇痛剂使用了两天。该程序获得华中科技大学同济医学院(Tongji Medical School,Huazhong University of Science andTechnology)地方伦理委员会的批准。
手术后三周，按计划1的程序对大鼠实施安乐死，并收获尸检，并立即固定在0.1MPBS中的4％戊二醛中。然后将材料在乙醇中连续脱水，包埋在树脂中。制作脱钙的半薄切片用于甲苯胺蓝染色，并制作超薄切片用于透射电子显微术。
大鼠股骨缺损模型的骨再生
给成年Waster大鼠(6-8周)腹腔内注射400mg/kg的水合氯醛，进行麻醉；仰卧放置。剃光左前腿，小心地沿侧面髌腱产生10mm的切口，但损伤股骨上的骨膜。使膝盖骨脱臼以暴露股骨。用牙钻创制了5mm×φ3.5mm的髁间骨缺损，将5mm×φ3.5mm(1)临床应用的明胶海绵组；(2)3D BGS组植入缺损处。重新放置膝盖骨，缝合膝盖骨韧带和皮下韧带，然后缝合全层皮肤。用聚维酮碘清洗伤口以避免感染。镇痛剂使用了两天。该程序获得了华中科技大学同济医学院地方伦理委员会的批准。在手术后1、2和3个月，按照计划1的程序对大鼠实施安乐死，并收获含有植入物的左股骨远端，并立即固定在中性10％福尔马林中。尸检用MicroCT扫描，以说明骨缺损再生，然后在乙醇中连续脱水，包埋在树脂中。制作脱钙的半薄切片，用于甲苯胺蓝染色，并制作超薄切片，用于透射电子显微术。
MicroCT
用MicroCT(Scanco VivaCT40)扫描骨缺损。使用70kV电压，21μm层厚和200ms扫描速度收集数据集。
总体观察
从锯开的样品获得总图像。
切片和甲苯胺蓝染色
用钨刀在Leica RM2155电动切片机上切割10mm厚的切片，然后通过将其放在一滴异丙醇上、贴上保鲜膜并用圆柱形钢棍滚动，使其变平。
对于光学显微术，将切片用50mM Tris缓冲液(pH 7.3)中的1％甲苯胺蓝染色。用Olympus BX51研究光学显微镜(Olympus Optical Co.(U.K.)Ltd,London,U.K)检查切片，并用Zeiss Axiocam和Axiovision软件(Carl Zeiss Vision GmbH,Hallbergmoos,德国)捕获电子显微照片。
TEM
对于TEM，将选定的区块锯开，重新包埋于LR White树脂中，用玻璃刀在UltracutE超薄切片机上切割100nm切片，并收集到300目镍网上。用乙酸铀酰和柠檬酸铅对所有切片进行染色。对于TEM，在Philips CM12 TEM(FEI U.K.Ltd.UK)中于80kV下检查切片，并使用Megaview III照相机和AnalySIS软件(Soft Imaging System GmbH,德国)捕获图像。
结果
3D-BGS的制造
对于生物绘图仪制备的3D-BGS，最重要的因素之一是水泥是否可以容易地从喷嘴流出。在室温(27℃)、32℃和37℃下测试了可行性。在室温下，明胶浓度为10％-14％的水泥混合物呈液体状；明胶浓度为15-19％的水泥更黏，且在前4分钟内运行良好；含有20-25％明胶的水泥呈凝胶状，无法通过喷嘴。在32℃时，明胶浓度为10-14％的水泥为流体；明胶浓度为15-19％的水泥更黏，在前10分钟内运行良好；含有20-25％明胶的水泥呈凝胶状，无法通过喷嘴。在37℃时，明胶浓度为10％-14％的水泥为流体；明胶浓度为15-19％的水泥更黏，并在整个持续时间内运行良好；含有20-25％明胶的水泥具有足够的流动性，但发现其使用持续时间有限，仅前2分钟。结果示于表2、3和4。
测试了明胶重量百分比相对温度的水泥可行性测试。33％-36％的明胶重量百分比在所有温度下均运行良好。结果列于表5中。在37℃时水泥凝固时间为40分钟，在室温时为1小时，在4℃时为2小时。
黏度测试
当温度高于30℃时，明胶溶剂为流体，因此评估20℃至30℃的黏度。如图2所示，黏度在大约22℃时发生变化，因此在此温度下，浓度为15％的明胶从流体变为凝胶(图2)。
3D打印方法
按照表6所示的参数，将水泥混合并利用生物绘图仪打印。测试模型如图3所示。
XRD
在图11中，仍然可以看到3D-BGS的XRD图案、3D-BGS中碳酸钙的衍射峰。更重要的是，羟基磷灰石(HA)的衍射峰出现在29.1°、32.9°、34.1°、39.6°以及49.5°的2θ值处，分别对应于(002)、(211)、(300)、(130)以及(213)平面。这些衍射峰与纯HA(JCPDS PDF#09-0432)的衍射标准数据非常一致。
FTIR
1mol TTCP和1mol CaHPO4应该在水中反应，并形成羟基磷灰石。移植物的FTIR分析如图4和5所示。红线表示3D-BGS的光谱，黑线表示标准HA样品的光谱。在图5中，黑线表示3D-BGS，其含有50％的在水中浸泡了48小时的粉末状体系中的CaCO3，而红线表示标准HA，绿线表示TTCP，蓝线表示CaHPO4。FTIR光谱的参考样品显示，在v1—963cm-1、v3—1036和1095cm-1、v4—568和600cm-1处的吸收是由于PO3 -4离子所致，OH-基团位于630cm-1处。在1061cm-1、1217cm-1和1137cm-1处的吸收是由于P＝O所致，在1722cm-1处的吸收是由于HPO4 -所致。
在图12中，FTIR光谱的参考样品显示，在v1—963cm-1、v3—1036和1095cm-1、v4—568和600cm-1处的吸收是由于PO3 -4离子所致，OH-基团位于630cm-1。FTIR光谱的参考样品显示，在1453.7cm-1的ν3峰、853.8cm-1的ν2峰、1083.8cm-1的ν1峰以及699.2和712.2cm-1的ν4峰处的吸收对应于CO3 2-。
与TTCP(Ca4(PO4)2O)的FTIR光谱相比，TTCP没有实现在1036和1417cm-1处的强峰，并且3D-BGS的FTIR揭露了位于640cm-1处的OH-基团，这表明TTCP和DCDA的混合物已转化为HA。HA存在的另一个有力证据是，该峰出现在约961cm-1处。3D-BGS中显示出CO3 2-的ν4吸收峰，这意味着在所有过程之后碳酸钙仍然保留在3D-BGS中。将峰均从参考峰中移位，但以合理的值进行。
细胞毒性和Live/Dead染色
图6显示了在Alamarblue检测中的相对荧光单位的结果以及在7天和14天时在含有以重量计35％、42％和28％的CaCO3的支架上接种的hMSC的统计分析。在第7天，3组之间没有太大差异，但在第14天，35％和42％组之间存在差异。与第7天相比，第14天时获得的相对荧光单位增加。图13显示了Alamarblue分析中的相对荧光单位和接种在3D-BGS、CHACC和组织培养板上的hMSC的统计分析。图13中显示的Live/Dead染色表明细胞活力约为92.7±2.8％，这表明3D-BGS对BMSC细胞(ISO 10993-5)是无毒的。
用Live/Dead染料染色的hMSC的共聚焦显微镜学如图7和14所示。蓝色荧光表示所有细胞，绿色荧光表示活细胞，红色荧光表示死细胞。
SEM显微照片显示3D-BGS(图8A和C)和CHACC(图8E和G)的相似多孔结构、表面上可媲美的纳米HA晶体(图B和F)以及相同的hMSC附着和生长形态(图8D和H)。
大鼠胫骨与胫骨前肌并置植入
与明胶海绵相比，将3D-BGS支架并置植入大鼠胫骨和胫骨前肌之间以观察3D-BGS上的软组织反应。明胶是3D-BGS中的添加剂材料之一。
通过光学显微术，它表明，明胶海绵植入导致植入3周后胫骨和胫骨前肌之间的纤维组织形成(图9A)。相比之下，同时植入的3D-BGS被含有血管、成纤维细胞和一些巨噬细胞的主要结缔组织所覆盖；有趣的是，有骨样组织小块形成(图9B)。TEM观察结果证实了光学显微术的发现，如在对照明胶海绵植入中一样，观察到供组织再生的巨噬细胞反应和成纤维细胞浸润(图9C)；而在3D-BGS组的骨样组织块中，观察到具有钙化陷窝和小管样结构的典型骨细胞样细胞(图9D)。
大鼠股骨缺损模型的骨再生
明胶海绵和3D-BGS植入后第1、2和3个月的MicroCT扫描结果如图10所示。明胶海绵植入组中的
骨缺损保持不愈合(图10A、C和E)。即使在术后1个月(图10A)在骨髓腔中形成了反应性愈伤组织，但在第2个月(图10C)和第3个月(图10E)愈伤组织进行了重塑。尽管在材料/骨界面处存在一些缝隙，但在3D-BGS周围有大量的愈伤组织形成，以使在植入后1个月治愈的骨缺损重新愈合(图10B)。植入后2个月，3D-BGS与宿主的致密骨组织完全整合，而小梁骨在3D-BGS的多孔结构内形成(图10D)。植入后3个月，骨髓腔内的大部分3D-BGS通过愈伤组织重塑而降解，剩余的3D-BGS加入了股骨的致密骨(图10F)。
图15显示了3D-BGS对大鼠股骨踝间骨缺损模型影响的总体观察结果。在3个月内，对照组显示了在骨缺损部位处的纤维组织形成，而在3D-BGS植入组中，在3个月内，植入物周围存在骨形成和生物降解。箭头表示支架。
图16显示了植入后3个月，通过光学显微术和后向散射SEM显微术阐明的新骨和3D-BGS材料的整合。[A]深色区域表示植入的3D-BGS，浅灰色区域表示新的小梁骨形成，蓝色区域是骨髓(含有脂质滴)、血管和骨组织中甲苯胺蓝染色的细胞。3D-BGS植入物完全整合，并牢固地黏合到新的小梁骨组织上。大多数3D-BGS降解并被新的骨形成替代。[A]的[B]高倍放大显示了新形成的小梁骨组织内生物降解的3D-BGS的大颗粒。分散的甲苯胺蓝染色的小点是骨细胞；而大的甲苯胺蓝区域是骨髓(含有脂质滴)和新血管。[B]中标记区域的[C]高倍放大。带有尾巴的甲苯胺蓝染色的点是骨细胞；而大的甲苯胺蓝区域是新血管。[D]后向散射显示的高电子密度晶体证明了3D-BGS颗粒的位置。白色箭头表示骨细胞陷窝。骨细胞与3D-BGS紧密整合。
图17显示了植入后1、2和3个月，3D-BGS横截面的SEM后向散射微观图解、能量弥散X射线谱(EDS)图和元素分析。高结晶区为3D-BGS植入物，其中该区域在三个月内(A，B和C)减小。EDS作图显示了植入物和骨组织的钙(A1、B1和C1)和磷酸盐(A2，B2和C2)组成。
X射线摄影显示，在植入后第1天、第1个月、第3个月和第6个月，在Bama小型猪的Φ5mm骨缺损中植入的5种骨移植材料的比较如图18所示。在1天至3个月之间，存在明胶海绵(1)植入不愈合，在6个月时在骨缺损中形成骨。2种3D-BGS配方植入物(2和3)在3个月内愈合，并具有明显的生物降解迹象(密度与没有间隙的骨相似)。纯无孔羟基磷灰石(4)是愈合的，但不降解。猪同种异体移植物(5)是愈合的，但骨缺损区域在3个月内仍存在缝隙，但在6个月时完全修复。
总结
因此，我们设计了自凝型磷酸钙/碳酸钙组合物，以形成具有确定的孔径、生物相容性和可控制的生物降解特性的3D打印的骨移植替代物(3D-BGS)。在这项研究中，通过测试不同的组合物配方来产生和优化3D-BGS，以确保净化的糊剂具有适当的黏度，并且在打印后可以保留结构完整性。调节打印机的参数并制造出具有各种孔径的仿生3D-BGS。通过FTIR光谱测试产品以表征组成。通过使用人间充质干细胞(hMSC)测试3D-BGS的细胞毒性，并将其进一步植入大鼠组织和骨缺损中，以测试体内生物相容性、成骨能力和潜在的生物降解。FTIR光谱结果表明，该技术产生的3D-BGS是羟基磷灰石(HA)和碳酸钙(CC)的混合物。细胞毒性试验表明该支架无毒，细胞可以在该材料上附着并生长。与临床应用的明胶海绵相比，在3D-BGS植入后未观察到感染或不良组织反应。有趣的是，在胫骨和胫骨前肌之间并置3D-BGS植入后，形成了骨样组织块。植入后1个月，通过microCT扫描在3D-BGS组中观察到愈伤组织的形成，然后在2个月时与宿主小梁骨和皮质骨完全整合，并在3个月时，在骨重塑过程中在骨髓腔中发生生物降解。然而，植入明胶海绵的相同骨缺损直到3个月仍未愈合。
这些结果支持了3D-BGS强大的骨传导潜力。来自宿主的新形成的骨组织在骨缺损部位牢固地整合到植入物中，其中，在植入后2个月和3个月时没有可见的缺损。
证实了3D-BGS的生物降解，并且明显减少了骨缺损中植入物的表面积。值得注意的是，植入物参与了骨重塑过程，其中，显然在愈伤组织重塑过程中，新骨形成后立即进行了植入物的吸收，从而在大面积的新骨形成中留下了植入物的小岛，尤其是在鼠模型中植入后的3个月时。
广泛的血管形成也证明了通过3D打印技术形成的多孔结构的优势，借此，新血管渗入孔中以帮助骨形成和吸收。图18清楚地显示了优于无孔HA植入物的结果，而3D-BGS植入的骨缺损已完全治愈，并且植入物降解，而无孔HA植入物在植入后6个月后几乎保持不变。
表1.
| 温度 | 压力 | 速度 | 平台温度 |
| 37℃ | 3MPa | 50mm/s | 5℃ |
表2.
表3.
表4.
表5.
表6.
| 组分 | CaCO<sub>3</sub> | CaHPO<sub>4</sub> | TTCP | 明胶溶剂(15％) |
| 重量百分比 | 28 | 16.3 | 25.7 | 30 |
表7.
缩写:
3D-BGS 3D-打印骨移植替代物
CC 碳酸钙
CDHP 磷酸二氢钙
CHACC 珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙
CPC 磷酸钙水泥
DCP 二水磷酸二钙(CaHPO4·2H2O)
EPS 能量弥散X射线谱
FTIR 傅里叶变换红外光谱
HA 羟基磷灰石
hMSCs 人间充质干细胞
OCP 磷酸八钙
SBF 模拟体液
SLS 选择性激光烧结
TCP 磷酸三钙
TTCP 磷酸四钙磷酸钙
Claims (43)
1.制备合成的生物可降解骨移植替代物的方法，其包括：
(a)以任何顺序混合碳酸钙、黏合材料和润湿剂和/或胶凝剂，以制备水泥或浆料，其中所述黏合材料至少包含在至少所述润湿剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分；和
(b)使(a)部分的所述水泥或浆料渗出成或压缩成适合起到骨移植物作用的形状。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，以指定的顺序执行下述步骤：
(a)将碳酸钙与黏合材料混合，以提供粉末状混合物，其中所述黏合材料至少包含在润湿剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分；
(b)将(a)部分的所述粉末状混合物与湿润剂和/或胶凝剂混合，以制备水泥或浆料；
(c)使用三维打印机将来自(b)部分的所述水泥或浆料的三维骨移植替代物(3D-BGS)打印到平台上。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述三维打印机是生物打印机。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述碳酸钙是天然存在的或合成制造的。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述碳酸钙以粉末形式提供。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所提供的碳酸钙按重量计为所述水泥的10-60％，包括其间的每个0.1％。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所提供的碳酸钙按重量计为所述水泥的20-50％，包括其间的每个0.1％。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所提供的碳酸钙的量按重量计为所述水泥的25-50％，包括其间的每个0.1％。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述碳酸钙可以是纳米颗粒或微粒的形式。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述纳米颗粒的直径为约10-999nm，包括其间的每个1nm整数；而所述微粒为1-30μm，包括其间的每个1μm整数。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述第一组分包含第一磷酸钙，且所述第二组分包含第二磷酸钙，其中所述第一组分的所述第一磷酸钙的钙与磷酸盐之比(Ca/P比)比所述第二成分的所述第二磷酸钙高。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述第一磷酸钙和/或第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述第一磷酸钙和/或第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)，条件是当所述第一磷酸钙是TCP时，所述第二磷酸钙不是DCP，反之亦然。
14.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其中，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，并且所述第二磷酸钙选自：
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，并且所述第二磷酸钙选自：
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述黏合材料包含所述第一组分和第二组分，所提供的所述第一组分和第二组分按重量计为所述水泥的10-50％，包括其间的每个0.1％。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第一组分和第二组分以固体形式提供，并以相对量一起混合和研磨，其中，所述第一组分与所述第二组分之比为约0.5-5.5。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述第一组分与所述第二组分之比为约1-1.5。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，(a)部分还包括混合添加剂，其中所述添加剂是影响黏度从而确保混合产品具有合适的流动性以流动但不至于使所述混合产品在渗出或压缩时不能保持形状的任何化合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述将添加剂提供于溶液或溶剂中。
21.根据权利要求19或20中任一项所述的方法，其中，所述添加剂或所述胶凝剂选自明胶、胶原、纤维素、自组装肽或生物墨水。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中，所述添加剂按重量计以水泥的10-50％的浓度提供。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在10℃至60℃的温度范围内，包括其间的每个0.1℃整数，进行步骤(a)和优选的步骤(b)中与所述润湿剂或胶凝剂的混合。
24.根据前述权利要求中的任一项所述的方法，其中，所述方法包括提供平台，所述3D-BGS被渗出、压缩或打印到所述平台上，其中，在1-40℃之间，包括其间的每个0.1℃，选择所述平台的温度。
25.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求3-24中任一项所述的方法，其中，步骤(c)的所述打印包括逐层沉积步骤(c)的所述混合物，以产生3D-BGS，其中理想的是，相对于前一层以一定角度沉积每一层，以产生多孔结构。
26.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求3-25中任一项所述的方法，控制步骤(c)的所述打印，以在所述3D-BGS产品中产生所需的孔径，其中，根据预期用途选择所述孔径。
27.根据权利要求26所述的方法，其中，所述孔径为200-750μm。
28.根据权利要求2或从属于权利要求2的权利要求3-27中任一项所述的方法，其中，步骤(c)还包括打印到包含支撑材料的基底上，其中以使得所述支撑材料部分或全部掺入到所述3D-BGS中的方式沉积所述水泥。
29.根据前述权利要求中任一项所述的方法，还包括在所述渗出、压缩或打印步骤之前或之后将活性剂掺入到所述水泥、浆料或产品中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，所述活性剂是药物制剂、生长因子、抗生素、抗炎剂/抗骨吸收剂或抗癌治疗剂。
31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括最终步骤(c或d)，其中，将所述碳酸钙转化为磷酸钙或用磷酸钙涂覆。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述方法还包括最终步骤(c或d)，其中，将所述碳酸钙转化为羟基磷灰石。
33.根据权利要求31或32中任一项所述的方法，其中，通过将所述3D-BGS浸入模拟体液(SBF)中来转化或涂覆所述碳酸钙。
34.根据权利要求33所述的方法，其中，将所述3D-BGS浸入SBF中1天至14天。
35.用于制造三维骨移植支架的混合物，其包含碳酸钙和黏合材料，其中，所述黏合材料包含在润湿剂和/或胶凝剂存在的情况下发生反应以提供水泥或浆料的第一组分和第二组分。
36.根据权利要求35所述的混合物，其中，所述第一磷酸钙和/或第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
37.根据权利要求36所述的混合物，其中，所述第一磷酸钙和/或第二磷酸钙选自：
磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)；
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)，条件是当所述第一磷酸钙是TCP时，所述第二磷酸钙不是DCP，反之亦然。
38.根据权利要求35-36所述的混合物，其中，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，并且所述第二磷酸钙选自：
磷酸三钙(2Ca3(PO4)2；TCP)；
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
39.根据权利要求38所述的混合物，其中，所述第一磷酸钙是磷酸四钙(Ca4(PO4)2O；TTCP)，并且所述第二磷酸钙选自：
磷酸氢钙(CaHPO4)；
磷酸二氢钙(Ca(H2PO4)2；CDHP)；
二水磷酸二钙(CaHPO4.2H2O；DCP)，或
磷酸八钙(Ca8H2(PO4)6.5H2O；OCP)。
40.根据权利要求35-39中任一项所述的混合物，其中，所述混合物所包含的碳酸钙的量按重量计为10-60％，包括其间的每个0.1％。
41.三维骨移植替代物(3D-BGS)，其包含碳酸钙和多孔支架，所述多孔支架的结构为松质状，并且部分或全部涂覆有羟基磷灰石(HA)。
42.根据权利要求41所述的三维骨移植替代物(3D-BGS)，其中，所述三维骨移植替代物(3D-BGS)包含的碳酸钙的量按重量计为10-60％，包括期间的每个0.1％。
43.治疗骨缺失的方法，其包括将根据权利要求41-42所述的3D-BGS或根据权利要求1-34中任一项所述的方法产生的3D-BGS插入骨中或附着于骨上。
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