KR20180133172A - 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 - Google Patents

골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 Download PDF

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김창환
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Abstract

본 발명은, 골 조직의 결손부의 복원을 위하여 체내에 충진되는 골 이식재 또는 차폐막을 고정시키기 위한 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 관한 것으로, 생체 친화성이 우수한 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)과 골 조직과 무기 성분이 유사한 인산칼슘 화합물을 포함하여 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 제조함으로써 탈세포화 세포 외 기질은 콜라겐 등과 같은 단백질 성분으로 인해 체온과 유사한 온도에서 겔화 반응을 일으켜 체내에 삽입시 물리적인 섬유화를 통해 골이식재 및 차폐막을 고정시킬 수 있을 뿐만 아니라, 일정 기간이 경과 후 체내에 이물반응 없이 완전히 분해 및 흡수되어 2차 제거 시술이 필요하지 않다. 또한, 접착성을 가지는 재료로 탈세포화 세포 외 기질을 사용함으로써, 이종유래 세포가 완전히 제거되어 시술자에게 면역 거부반응이 현저히 저하될 뿐만 아니라, 탈세포화 세포 외 기질 내 콜라겐, 당단백질, BMP-2, ALP 등과 같이 골형성에 도움을 줄 수 있는 골유래 단백질이 포함되어 있어 우수한 골전도 및 골유도성을 가진다.

Description

골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물{Method of producing injectable adhesive composition for fixing bone grafting materials and a injectable adhesive composition for fixing bone grafting materials produced thereby}
본 발명은, 골 조직의 결손부의 복원을 위하여 체내에 충진되는 골 이식재 또는 차폐막을 고정시키기 위한 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 관한 것이다.
골 조직은 인체의 골격을 유지시키는 경조직으로, 외상, 종양, 기형 혹은 생리학적 현상으로 골 조직이 손상된 경우에 손상된 골 조직 부분에 골 이식재(bone grafting substitue) 및 연조직 차단용 멤브레인(이하, 차단막, guided tissue regeneration 또는 guided bone regeneration)을 삽입시켜 신생골을 형성시킬 수 있다.
일반적으로 골 이식재는 손실된 골 부분을 대체하기 위한 것으로, 단순히 손실된 부분을 보충하는 것이 아니라 체내에서 골이 손실된 부분에 새로운 골이 형성될 수 있도록 도움을 줄 수 있어야 하며, 이러한 골 이식재는 정형외과에서 사지 및 척추의 골절 또는 골절 탈구, 불유합 또는 지연 유합, 종양이나 골수염 등을 제거한 후 남은 골 결손부 또는 치과에서 치조골이 결손된 부분에 골의 형성 촉진과 골 조직의 결손 치환을 위해 사용될 수 있다.
이러한 골 이식재는 손상된 골 결손부의 회복을 위하여 체내의 골 결손부에 이식될 수 있는데, 골 이식재의 이식 방법은 골 이식재의 종류에 따라서 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취하여 이식하는 자가골 이식방법, 다른 사람의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 동종골 이식방법, 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종골 이식방법이 있다.
이중 가장 좋은 이식방법은 자신의 골을 이식하는 자가골 이식방법인데, 자가골을 사용함으로써 골형성 혹은 골유도 가능성이 높고, 이식될 골의 치유와 생활골로의 빠른 전환, 자가골로 인한 면역반응(생체 거부반응)이 없다는 장점이 있으나, 이차적인 수술이 필요하고, 필요한 만큼의 양을 얻기가 힘들며, 일반 개인의원에서 시행하기가 어렵다는 단점이 있다.
다른 이식방법인 동종골과 이종골 이식방법은 이차적인 수술부가 필요 없어, 빠른 수술시간과 회복기간, 합성골 이식재에 비하여 저렴한 비용 등의 장점이 있으나, 자가골에 비하여 약 2배 정도의 골유도기를 갖고, 형성될 골의 골질이 저하될 가능성이 있으며, 면역 반응이 일어날 수 있고, 확률은 낮지만 AIDS나 간염과 같은 바이러스가 환자 내로 도입될 수 있다는 위험이 존재한다.
체내의 손상된 골 결손부에 골 이식재를 이식한 후, 신생골이 형성되는 동안 골 결손부 공간 내 충분한 신생골이 형성될 수 있도록, 주변 연조직이 골 결손부의 공간으로 침투되지 않도록 차단막을 형성할 수 있어야 하고, 골 결손부에 이식된 골 이식재와 차단막은 신생골의 형성기간 동안 체내에서 동요되지 않고 안정적으로 고정되어야 한다.
일반적으로 골 이식재 및 차폐막을 고정시키기 위하여 피브린 글루(fibrin glue) 또는 실란트(sealant)를 이용하거나, 차폐막의 직접적인 고정을 위해 금속재질로 된 뼈 나사(bone screw)를 이용하여 고정하고 있다.
그러나, 피브린 글루 또는 실란트의 경우에는, 골 이식재 및 차폐막 사이를 고정할 수는 있으나 체내에서 약 4주 후 분해되고, 신생골 형성에 도움을 줄 수 없어 골 결손부가 완전히 신생골로 형성되지 못하는 문제가 있다. 또한, 금속재질로 된 뼈 나사를 사용하여 차폐막을 고정하는 경우에는, 골 형성이 완료된 후 이를 제거하는 2차 수술이 추가로 필요하다는 문제가 있다.
공개특허 제2016-0093520호(2016.08.08.)
본 발명에서는, 골 조직의 결손부의 복원을 위하여 체내에 충진되는 골 이식재 또는 차폐막이 외부의 충격에 의해 동요되지 않고 안정적으로 고정되어, 신생골이 원활하게 형성될 수 있는 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 제공하고자 한다.
상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시 형태는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법에 관한 것으로서, 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 준비하는 단계; 인산칼슘 화합물을 분쇄하는 분쇄단계; 분쇄된 인산칼슘 화합물과 물을 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 1차 혼합단계; 및 상기 1차 혼합물과 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 2차 혼합단계;를 포함하여 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 제조할 수 있다.
상기 2차 혼합단계 후에, 2차 혼합물을 2 ~ 8 ℃ 온도로 냉각시키는 냉각단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.
구체적으로 상기 분쇄단계는, 인산칼슘 화합물을 10 ~ 2,000 ㎛ 입자크기로 분쇄할 수 있다.
또한, 상기 1차 혼합단계는, 분쇄된 인산칼슘 화합물 80 ~ 90 wt% 및 물 10 ~ 20 wt% 비율로 혼합할 수 있으며, 상기 2차 혼합단계는, 1차 혼합물 50 ~ 80 wt% 및 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt% 비율로 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 2차 혼합단계는, 1차 혼합물에 상기 탈세포화 세포 외 기질과 추가로 천연 고분자 물질을 더 포함하여 혼합하고, 상기 천연 고분자 물질은, 카르복실메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose), 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 덱스트란(dextran) 및 알지네이트(alginate)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
또한, 상기 2차 혼합단계는, 1차 혼합물에 상기 탈세포화 세포 외 기질과 추가로 기능성 물질을 더 포함하여 혼합하고, 상기 기능성 물질은, 뼈형성 단백질(BMP), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 전환성장인자(TGF-β), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 티오레독신(TRX), 줄기세포인자(SCF), 간세포 증식인자(HGF), 인간 성장 호르몬(hGH) 및 엔지오제닌(Angiogenin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 다른 실시 형태는, 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물이다.
구체적으로, 상기 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물은 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM), 인산칼슘 화합물, 천연 고분자 물질, 기능성 물질 및 물을 포함하고, 바람직하게는 상기 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt%, 인산 칼슘 화합물 40 ~ 72 wt%을 포함하되, 상기 탈세포화 세포 외 기질, 인산 칼슘 화합물, 천연 고분자 물질, 기능성 물질 및 물의 합이 100 wt%를 넘지 않는다.
상세하게는 상기 인산 칼슘 화합물은, 10 ~ 2,000 ㎛ 입자크기이며, 상기 천연 고분자 물질은, 카르복실메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose), 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 덱스트란(dextran) 및 알지네이트(alginate)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상이고, 상기 기능성 물질은, 뼈형성 단백질(BMP), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 전환성장인자(TGF-β), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 티오레독신(TRX), 줄기세포인자(SCF), 간세포 증식인자(HGF), 인간 성장 호르몬(hGH) 및 엔지오제닌(Angiogenin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물은, 생체 친화성이 우수한 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)과 골 조직과 무기 성분이 유사한 인산칼슘 화합물을 포함하므로, 탈세포화 세포 외 기질이 콜라겐 등과 같은 단백질 성분으로 인해 체온과 유사한 온도에서 겔화 반응을 일으키게 되고, 체내에 삽입 시 물리적인 섬유화를 통해 골이식재 및 차폐막을 고정시킬 수 있을 뿐만 아니라, 일정 기간이 경과 후 체내에 이물반응 없이 완전히 분해 및 흡수되어 2차 제거 시술이 필요하지 않는 장점을 갖는다.
또한, 접착성을 가지는 재료로 탈세포화 세포 외 기질을 사용함으로써 이종유래 세포가 완전히 제거되므로, 피시술자에게 면역 거부반응이 현저히 저하될 뿐만 아니라, 탈세포화 세포 외 기질 내 콜라겐, 당단백질, BMP-2, ALP 등과 같이 골형성에 도움을 줄 수 있는 골유래 단백질이 포함되어 있어 우수한 골전도 및 골유도성을 갖는 효과가 있다.
한편, 인산칼슘 화합물과 탈세포화 세포 외 기질의 혼합과정에서 각각 따로 용매에 용해시킨 후 혼합함으로써 인산칼슘 화합물이 뭉쳐지지 않고 균질하게 분산될 수 있도록 하여 골 결손부 내 신생골이 균일하게 형성될 수 있다.
도 1은 본 발명의 제조예를 통해 제조된 탈세포화 세포 외 기질을 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 제조예를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 수화 상태 유지력을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
도 4는 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 접착력 측정 실험결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 고정성능을 측정하기 위한 실험방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 고정성 측정 실험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 탈세포화 세포 외 기질의 함량 변화에 따른 접착제 조성물의 압축강도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 골전도 및 골유도능을 확인하기 위한 실험방법을 순차적으로 나타낸 사진이다.
도 9는 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 사용시 골전도 및 골유도능의 유효성을 측정한 결과를 나타낸 사진이다.
이하 본 발명의 바람직한 실시 예를 통해 상세히 설명하기에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니 되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 함을 밝혀둔다.
본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
"제1 ", "제2 " 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.
본 명세서 내에서 "세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)"은 조직 내 또는 세포 외의 공간을 채우고 있는 생체고분자의 복잡한 집합체로서, 섬유성 단백질, 프로테오글리칸과 같은 복합단백질, 피브로넥틴, 라미닌 등의 세포 부착성 단백질 등 세포에 의해 합성되고 세포 외에 분비 축적된 다양한 종류의 분자로 구성된 것을 의미한다. 또한 "탈세포화(decellularization)"는 세포 또는 조직으로부터 세포 외 기질을 제외한 다른 세포 성분, 예를 들면 핵, 세포막, 핵산 등을 제거하는 것을 의미한다. 그리고, "탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)"은 조직 또는 세포로부터 핵, 세포막, 핵산과 같은 세포 성분이 제거되고 남은 세포 외 기질을 의미한다.
이하에서는 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법 및 이를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 관하여 보다 상세히 설명하고자 한다.
먼저, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법은, 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 준비하는 단계; 인산칼슘 화합물을 분쇄하는 분쇄단계; 분쇄된 인산칼슘 화합물과 물을 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 1차 혼합단계; 및 상기 1차 혼합물과 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 2차 혼합단계;를 포함할 수 있다.
상기 탈세포화 세포 외 기질을 준비하는 단계는, 인간, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 수득된 조직(예를 들어, 심장조직, 연골조직, 골조직, 지방조직, 근육조직, 피부조직, 점막상피조직, 양막조직, 각막 조직 등)에서 통상의 기술자에게 공지된 방법 또는 이의 적절한 변형을 통해 탈세포화하여 탈세포화 세포 외 기질을 준비할 수 있다.
그러나, 바람직하게는 세포 외 기질의 구성성분은 원재료인 세포의 유형 또는 세포의 분화 정도에 따라 상이하므로, 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 사용되는 탈세포화 세포 외 기질은 향상된 골전도 및 골유도능을 가지기 위하여 골조직 바람직하게는 돼지뼈, 소뼈, 말뼈로부터 수득된 이종골 또는 인간의 뼈로부터 수득된 동종골에서 탈세포화 방법을 거쳐 수득된 골조직 유래의 탈세포화 세포 외 기질을 준비할 수 있다.
상기 탈세포화 방법은 조직의 세포 내 세포 외 기질을 제외한 나머지 세포 성분을 제거하는 방법으로, 물리적인 방법, 화학적인 방법 또는 이를 혼합한 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 화학적인 방법을 사용할 수 있다.
일 예로, 화학적인 방법을 사용하여 탈세포화 세포 외 기질을 준비할 경우, 이종골 또는 동종골을 살균한 다음, 탈세포화 용액에 배양된 세포를 소정의 시간 동안 침지시킨 후, 이를 방치하여 탈세포화, 탈지 과정을 순차적으로 거쳐 탈세포화 세포 외 기질을 준비할 수 있다.
이때 사용되는 탈세포화 용액은 산성용액, 염기성 용액, 비이온성 세척제(non-ionic detergent) 또는 이온성 세척제 모두 가능하나, 바람직하게는 비이온성 세척제를 사용할 수 있다. 예를 들어 비이온성 세척제인 Triton X-100을 사용시, 탈세포화하고자 하는 세포를 Triton X-100에 침지시켜 세포의 세포막을 깨뜨려서 세포 내 성분을 제거하거나, DNase와 RNase를 사용하여 세포핵 성분을 제거할 수 있으나, 바람직하게는 트립신을 이용하여 35 ~ 39 ℃, pH 7.5 ~ 8.5 조건에서 EDTA와 함께 사용하여 골 조직의 세포를 깨고 세포 안의 내용물을 제거하여, 탈세포화시킬 수 있다.
본 발명의 탈세포화 세포 외 기질을 준비하는 단계는, 바람직하게는 이종골 또는 동종골 등 골조직으로부터 세포의 핵, 세포막 등만을 제거하여 탈세포화 세포 외 기질을 준비함으로써, 정상골 대비 상기 탈세포화 세포 외 기질 내 포함된 DNA 함량이 현저하게 낮아(＜ 50 ng/mg) 체내에 인입시 면역거부 반응을 현저히 저하시킬 수 있을 뿐만 아니라, 골조직 세포의 세포 외 기질 성분인 골유래 단백질인 콜라겐, 당단백질(Glycosaminoglycans, GAGs), BMP-2(Bone Morphogenetic Protein-2), ALP(Alkaline Phosphatase) 등을 활용할 수 있어, 결손된 골조직 부분에 충전시 우수한 골전도 및 골유도능을 가질 수 있다.
또한, 상기 탈세포화 세포 외 기질의 경우 체내에 인입시, 상기 탈세포화 세포 외 기질 내 포함된 콜라겐 및 단백질 성분으로 인하여 체온과 유사한 온도에서 겔화(gelation)됨으로써, 골 이식재와 골이식재 간의 결합, 골 이식재와 차단막 간의 결합, 차단막과 주변 세포조직 사이를 고정시킬 수 있고, 또한 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 내 포함되는 인산칼슘 화합물 및 기타 다른 물질 들을 응집시킬 수 있다.
상기 분쇄단계는 인산칼슘 화합물을 분쇄하는 단계로, 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 골 전도능, 골 유도능 특징을 가지는 인산칼슘 화합물을 포함시키기 위해 소정의 입도로 인산칼슘 화합물을 분쇄시킬 수 있다. 상기 인산칼슘 화합물의 입도가 미세해질수록 우수한 골전도 및 골유도능을 가질 수 있다. 그러나, 인산칼슘 화합물의 입도가 너무 미세해지면 미분 형태로 인산칼슘 화합물이 비산되어 사용이 어렵기 때문에 바람직한 입도로 분쇄시켜 사용하는 것이 바람직하다.
상기 인산칼슘 화합물은 인산과 칼슘이 화학적 결합을 통해 이루어지는 화합물로, 천연 골과 무기 성분이 유사한 것으로서 골이 전도되어 성장할 수 있도록 도움을 줄 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고 사용 가능하며, 일 예로 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HAp), 탄산아파타이트(Carbonated apatite), 인산삼칼슘(Tricalcium Phosphate, TCP), 인산수소칼슘(Calcium Hydrogen Phosphate), 제1인산칼슘(Monocalcium phosphate), 제2인산칼슘(Dicalcium phosphate), 2수소인산칼슘(Calcium dihydrogen phosphate), 제3인산칼슘(Tricalcium phosphate), 제10인산칼슘(Octacalcium phosphate), 및 피로인산칼슘(Calcium pyrophosphate)으로로 이루어진 군 중에서 선택된 적어도 하나 이상을 사용할 수 있다. 바람직하게는 β-인산삼칼슘(β-Tricalcium phosphate, β-TCP) 또는 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite, HAp)를 사용할 수 있다.
구체적으로, 상기 분쇄단계에서는 인산칼슘 화합물을 10 ~ 2,000 ㎛ 입자크기로 분쇄할 수 있는데, 인산칼슘의 화합물의 입자 크기가 10 ㎛ 미만일 경우 입자를 미세하게 분쇄하는데 비용 및 시간이 소요되는 것에 비하여 이익이 없어 경제성이 저하될 수 있고, 입자 크기가 2,000 ㎛을 초과 하게 되면, 입자 크기가 너무 커 상기 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 내 균질하게 분산되기 어려울 뿐만 아니라, 이를 체내에 인입시 조성물의 응집이 어려워 고정력이 저하될 수 있다. 상기 인산칼슘 화합물의 입자 크기가 낮을수록 골 전도능 및 골 유도능 특성이 향상되므로, 바람직하게는 상기 분쇄단계에서 인산칼슘 화합물의 입자 크기는 20 ~ 200 ㎛ 입자 크기로 분쇄할 수 있다.
상기 분쇄단계에서 인산칼슘 화합물을 분쇄하는 방법은 습식 분쇄, 건식 분쇄 등 얻고자 하는 소정의 입도로 화합물을 분쇄하는 방법이면 특별히 한정되지 않고 사용 가능하나, 바람직하게는 유발을 사용한 유발 분쇄 또는 거름체를 이용하여 원하는 입자 크기를 가지는 인산칼슘 화합물로 분쇄할 수 있다.
분쇄된 인산칼슘 화합물은 물과 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 1차 혼합단계 후, 상기 1차 혼합물과 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 2차 혼합단계를 거칠 수 있다. 이는 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 내 포함되는 인산칼슘 화합물과 탈세포화 세포 외 기질이 균일하게 분산, 혼합될 수 있도록 하기 위함이다.
상세하게는 상기 1차 혼합단계는, 분쇄된 인산칼슘 화합물 80 ~ 90 wt% 및 물 10 ~ 20 wt% 비율로 혼합하여 1차 혼합물을 제조할 수 있는데, 이때 인산칼슘 화합물과 물의 혼합비율이 앞서 언급된 범위를 벗어나게 되는 경우 2차 혼합단계에서 탈세포화 세포 외 기질과 인산칼슘 화합물이 균일하게 혼합되지 못하거나, 수분 함량이 너무 높아 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 주사기에 충진시켜 체내로 주입하여 사용시 완전히 접착될 때까지 많은 시간이 소요되어 시술의 편의성이 저하되거나, 접착력이 저하되어 골 이식재와 골 이식재 사이, 골 이식재와 차폐막 사이, 차폐막과 주변 조직 사이의 결착력이 저하되어 체내에서 골 이식재와 차폐막의 동요가 발생될 수 있다.
상기 1차 혼합단계를 거쳐 제조된 1차 혼합물에 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 2차 혼합단계를 거쳐 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 제조할 수 있다.
구체적으로, 상기 2차 혼합단계는, 1차 혼합물과 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 단계로서, 1차 혼합물 50 ~ 80 wt% 및 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt% 비율로 혼합하되, 상기 탈세포화 세포 외 기질 내 포함된 단백질이 변성되지 않도록 혼합 온도를 제어하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 탈세포화 세포 외 기질 내 포함된 콜라겐 및 기타 단백질은 체온과 유사한 온도에서 젤화(gelation)되기 때문에 혼합 온도가 37 ℃를 초과하지 않도록 적절히 온도를 제어하면서 혼합하여야 한다.
또한, 적어도 1 ℃를 초과하는 온도 범위에서 수행되는 것이 바람직한데, 이는 1 ℃ 이하가 되면 제형 내에 존재하는 수분의 응결이 발생하여 제형화가 불가능하기 때문이다.
이는, 상기 2차 혼합단계에서, 1차 혼합물과 탈세포화 세포 외 기질을 혼합시 균질한 혼합물을 제조하기 위하여 교반기를 사용하여 교반하게 되는데, 이 때 혼합되는 재료들이 잘 분산될 수 있도록 교반 속도를 증가시키게 되면, 증가된 교반 속도와 비례하여 혼합물의 온도가 상승하게 된다.
본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물에 포함되는 탈세포화 세포 외 기질은 단백질 성분이 포함되어 있어 열에 취약하며, 특히 콜라겐 등과 같은 단백질 성분은 체온(대략 35 ~ 39 ℃)정도의 온도에서 변형되거나 응집, 섬유화 반응이 진행되어 제형이 변성되는 문제로 인하여, 2차 혼합단계는 1 ℃ 초과 37 ℃ 이하의 온도범위가 유지되도록 적절히 온도를 제어하면서 혼합되는 것이 바람직하며, 제2 혼합단계 후에 제조된 2차 혼합물의 온도를 2 ~ 8 ℃ 온도로 냉각시키는 냉각단계를 통해 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 보관하는 것이 바람직하다.
상기 2차 혼합단계에서 1차 혼합물 50 ~ 80 wt% 및 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt% 비율이 바람직하다. 이는 제조된 2차 혼합물 내 포함된 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 증가할수록 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 체내에 인입시 섬유화, 물리적 가교가 진행되어 분자 간 결합력이 상승되고 이를 통해 점도가 향상되어 골 이식재 및 차폐막의 고정력이 향상되는 효과가 있으나, 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 과도할 경우 상대적으로 1차 혼합물 내 포함된 인산칼슘 화합물의 함량이 낮아 골 결손부에 인입시 겔화 후 충분한 골 형성 효과를 기대하기 어려울 뿐만 아니라, 겔화된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 인장강도가 현저히 낮아져 외부의 물리적 충격에 의해 파손될 우려가 있기 때문이다.
상기 2차 혼합단계에서 본 발명의 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 내 접착력을 향상시켜 골 이식재 및 차폐막의 고정력을 증가시키기고, 골 결손부의 골 전도능, 골 유도능, 골 형성능을 향상시키기 위하여 천연 고분자 물질 또는 기능성 물질을 더 포함할 수 있다.
상기 천연 고분자 물질 또는 기능성 물질 또한 열에 취약해 제1 혼합단계보다는, 제2 혼합단계에서 추가 투입하는 것이 바람직하다.
상기 천연 고분자 물질은, 카르복실메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose), 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 덱스트란(dextran) 및 알지네이트(alginate)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있으며, 상기 기능성 물질은 뼈형성 단백질(BMP), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 전환성장인자(TGF-β), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 티오레독신(TRX), 줄기세포인자(SCF), 간세포 증식인자(HGF), 인간 성장 호르몬(hGH) 및 엔지오제닌(Angiogenin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다.
상기 천연 고분자 물질과 기능성 물질은 각각, 1차 혼합물과 탈세포화 세포 외 기질이 혼합된 2차 혼합물 100 중량부를 기준으로 0.02 내지 2 중량부의 범위로 사용되는 것이 바람직한데, 이들 각각이 0.02 중량부 미만인 경우에는 천연고분자 물질 혹은 기능성 물질인 성장인자들의 효과가 발휘될 수 없고, 2 중량부를 넘어설 경우에는 오히려 골유래 탈세포화 세포 외 기질의 응집을 저해하여 제형화가 불가능해지기 때문이다.
한편, 본 발명의 다른 실시 형태로, 앞서 언급한 제조방법으로 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 들 수 있는데, 본 발명에 따른 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물은, 탈세포화 세포 외 기질에 포함된 콜라겐 및 기타 단백질 성분으로 인해 대략 체온 정도의 온도 분위기 하에서 겔화(gelation)되는 성질이 있어, 상기 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 주사기를 통해 체내에 주입시 체온에 의하여 물리적 섬유화(fibrillogenesis)가 발생되며, 이로 인하여 골 이식재와 골이식재 간의 결합, 골 이식재와 차단막 간의 결합, 차단막과 주변 세포조직 사이의 고정력이 향상되어 신생골의 형성기간 동안 체내에서 골이식재, 차단막이 동요되지 않고 고정되어 안정적으로 신생골이 형성될 수 있다.
또한, 일반적으로 골이식재, 차단막 등을 고정시키기 위하여 사용되는 별도의 고정장치, 예를 들어 골 나사(bone screw)가 필요치 않으며, 골 이식 수술 후, 골 나사를 제거하는 2차 수술이 필요치 않아 수술 예후가 향상될 수 있다.
뿐만 아니라, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물 내 포함된 골 조직으로부터 추출된 탈세포화 세포 외 기질이 포함되어 있어 골 유래 단백질 등 신생골 형성에 도움을 줄 수 있는 각종 성분이 포함되어 있어 우수한 골전도 및 골유도능을 가질 수 있다. 또한, 천연 골과 무기 성분이 유사한 인산칼슘 화합물을 포함함으로써, 신생골의 형성에 도움을 줄 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 실시 예를 살펴본다. 그러나 본 발명의 범주가 이하의 바람직한 실시 예에 한정되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 권리범위 내에서 본 명세서에 기재된 내용의 여러 가지 변형된 형태를 실시할 수 있다.
[제조예]
골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조
먼저, 12 ~ 24 개월 된 송아지에서 경골(tibiae)으로부터 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 준비하였다.
상세하게는 상기 경골을 조각으로 나누고 해면질(cancellous) 부분과 피질(cortical) 부분으로 분리한 뒤, 분리된 해면질 부분의 이물질, 미세한 조직을 제거하기 위하여 0.1%(w/v) 젠타마이신(centamicin, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 함유한 PBS(Phosphate-buffered ssaline)을 사용하여 세척하였다. 그 후 상기 해면질 부분을 액체 질소에 얼리고 4×4×4 mm 이하의 절편으로 절단한 다음, 절단된 절편을 증류수로 한번 더 세척하였다. 세척된 절편을 액체 질소에 침지시킨 후 커피 밀(coffee mill, Kordia Co., Daegu, Gyeongbuk, Korea)을 사용하여 빻아다. 빻아 분말 상태인 해면질을 0.5 N HCl(25 ㎖/ 분말 g)을 사용하여 용해시킨 후, 상온에서 24시간 동안 교반(300 rpm)하여 분말 상태의 해면질을 탈미네랄화시켰다. 탈미네랄화 후, 이를 진공상태로 필터 여과한 후 증류수로 헹구었다. 그 후 클로로포름(Chloroform, Fisher Scientific, Loughborough, UK) 및 메탄올(Methanol, Fisher Scientific)을 1:1 부피비로 혼합된 혼합용매를 사용하여 탈미네랄화된 분말에서 1시간 동안 지질을 추출한 후, 순차적으로 메탄올, 증류수를 사용하여 세척하였다. 세척 후, 순간 동결(snap frozen)시킨 다음 충분한 시간 동안 감압 분위기 하에서 동결 건조시킨 후 - 20 ℃에서 저장하였다. 저장된 동결 건조된 분말을 증류수로 세척한 후, 이를 0.05 % 트립신(Trypsin, Sigma-Aldrich) 및 0.02 % EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid, Sigma-Aldrich)이 포함된 혼합용매에 용해시켜 37 ℃, 5 % CO2 분위기 하에서 24시간동안 교반하여 탈세포화 시켰다. 탈세포화 후, 잔존된 세포 물질을 제거하기 위하여 1 %(w/v) 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 PBS(Phosphate-buffered ssaline)로 4 ℃에서 24시간동안 교반하여 세척하였다. 세척 후 순간 동결시키고, 충분한 시간 동안 감압 분위기 하에서 동결 건조시킨 후 - 20 ℃에서 저장하여 탈세포화 세포 외 기질을 제조하였으며, 제조된 탈세포화 세포 외 기질은 도 1과 같다.
β-TCP(β-tricalcium phosphate)을 유발을 사용하여 분쇄하여 분말화시킨 후, 거름체를 사용하여 평균 입도가 75 ㎛인 분쇄된 인산칼슘 화합물을 준비하였다. 상기 분쇄된 인산칼슘 화합물 85 g과 정제수 15 g를 혼합하여 페이스트 믹서(paste mixer)를 사용하여 10 분간 혼합하여 1차 혼합물을 수득하였다.
수득된 1차 혼합물과 상기 제조된 탈세포화 세포 외 기질과 기능성 물질을 하기 표 1과 같은 비율로 혼합한 후, 페이스트 믹서(paste mixer)를 사용하여 15 분간 2차 혼합하여 2차 혼합물을 제조하였다. 2차 혼합시 온도는 37 ℃를 초과하지 않도록 주의하였다. 혼합 후, 2차 혼합물을 5 ℃로 냉각시킨 다음, 냉각된 2차 혼합물을 주사기에 충진하여 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 제조하였다.
비교예 1 비교예 2 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 비교예 3 비교예 4
접착성

물질		 탈세포화 세포 외 기질 - 10 20 30 40 50 30 30 70 30
카르복시 메틸 셀룰로오스 30 - - - - - - - - -
인산칼슘 화합물
(β-TCP)		 70 90 80 70 60 50 70 70 30 70
기능성
물질
(뼈형성 단백질)		 - - - - - - 0.02 2 - 3
합 계 100 100 100 100 100 100 100.2 102 100 103
(단위 : g)
[실험예 1]
접착제의 수화 상태 유지력 측정실험
상기 제조예를 통해 제조된 접착제의 유지력을 측정하기 위하여 주사기에 상기 비교예 1 및 실시예 2를 각각 충진한 후, 물이 담겨진 코니칼 튜브 속으로 5 g씩 주입한 후, 37 ℃, 60 rpm 조건에서 12주 동안 관찰하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.
구체적으로 도 3을 살펴보면, 비교예 1의 경우 물이 담겨진 코니칼 튜브 속으로 접착제를 주입과 동시에 그 형태가 무너져 가라앉는 것을 확인할 수 있었으며, 실시예 2의 경우 12주 경과 후에도 여전히 주사기를 통해 주입된 형태 그대로 유지됨을 확인할 수 있었다. 이는 탈세포화 세포 외 기질과 인산칼슘을 포함한 골이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 경우 골 결손부에서 골 이식재 및 차폐막을 서로 접착시켜 고정 및 형태를 유지하는데 도움을 줄 수 있을 것으로 기대되었다.
[실험예 2]
접착력 측정 실험
시간이 경과됨에 따라 상기 제조예에서 제조된 접착제의 접착력을 확인하기 위하여 37 ℃ 에서 5 분 간격으로 40 분간 브룩필드점도계 (Brookfield RVDV-3, Brookfield, US)를 이용하여 비교예 1 및 실시예 1 내지 4의 점도를 측정하였으며, 그 결과는 도 4와 같다.
도 4의 결과를 살펴보면, 탈세포화 세포 외 기질 대신에 카르복시 메틸 셀룰로오스를 포함하는 비교예 1의 경우 시간이 경과되어도 점도에 변화가 없이 대략 1,200 cps 점도를 나타내었으나, 탈세포화 세포 외 기질이 포함된 실시예 1 내지 4는 시간이 점차 경과됨에 따라 점도가 점진적으로 증가됨을 확인할 수 있었다.
특히, 실시예 1 내지 4의 경우 15분이 경과된 시점에서 초기 대비(0 min) 약 12배 정도의 점도 증가를 확인할 수 있었으며 가장 높은 점도 증가율을 보인 실시예 4의 경우에는 초기 대비 약 16배의 점도 증가를 확인할 수 있었다.
이는 탈세포화 세포 외 기질이 체온과 유사한 온도 즉 37 ℃ 에서 섬유화, 즉 물리적 가교 반응으로 인하여 분자 사이의 결합력이 증가되어 점도가 향상됨을 알 수 있었다. 또한, 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 점차 증가함에 따라 점도 증가율이 향상됨을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 제조예에서 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물인 실시예 1 내지 4는 골 이식재 및 차폐막 사이를 접착 또는 고정에 필요한 충분한 점도를 가짐을 알 수 있었다.
[실험예 3]
접착제의 고정능 측정 실험
앞선 제조예를 통해 제조된 비교예 1 및 실시예 1 내지 4의 골 이식재 또는 차폐막의 고정능을 확인하기 위하여 도 5와 같이 골 이식재(10)(In'Oss, Biomatlante Biologics Solutions, FRN), 차폐막(30)(Collagen Membrane, Genoss, KOR) 사이에 접착제(100)인 비교예 1 및 실시예 1 내지 4를 각각 위치시키고, 봉합사((ETHILON Nylon Suture 4-0, Ethicon, US)를 Instron (3343/B10948, UK)에 연결 후 suture pull out test를 실시하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6의 결과를 살펴보면, 비교예 1에 비하여 실시예 1 내지 4의 접착제를 사용할 경우 약 10 배 이상의 고정력을 확인할 수 있었다. 특히, 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 높은 실시예 4의 경우에는 높은 고정력을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 제조예에서 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물인 실시예 1 내지 4는 골 이식재 및 차폐막 사이가 체내에서 동요되지 않도록 충분히 고정시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
[실험예 4]
접착제의 압축강도 측정실험
상기 제조예에서 제조된 접착제 내 포함된 탈세포화 세포 외 기질의 함량 변화에 따른 압축강도를 확인하기 위하여, 국제규격인 ASTM D 790을 기준으로 압축강도 기기 (Instron)을 이용하여 압축강도를 측정하였다. 측정 지그 위에 시료를 놓고 하방으로 10mm/min으로 일정하게 힘을 가하여 강도를 측정하였으며, 그 결과는 도 7과 같다.
도 7의 결과를 살펴보면, 인산칼슘 화합물에 비하여 탈세포화 세포 외 기질을 함량이 낮은 비교예 2 또는 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 과다한 비교예 3의 경우 압축강도가 실시예 2 또는 4에 비하여 현저히 낮음을 확인할 수 있었다.
구체적으로, 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 낮은 비교예 2의 경우에는 낮은 단백질 함량으로 인하여 겔화(gelation)효과가 미미하여 체내에 인입시 충분한 접착력을 발휘하지 못할 뿐만 아니라, 접착제 조성물 내 포함된 인산칼슘 화합물을 응집시키지 못하여 제형화가 되지 않는 문제가 있었다.
반면, 탈세포화 세포 외 기질의 함량이 과량으로 포함된 비교예 3의 경우 인산칼슘 화합물의 함량이 상대적으로 적어 충분한 골 형성을 기대하기 어렵고, 강도가 저하되어 외부의 물리적 충격에 의해 손상될 우려가 있다.
한편, 접착제 내 기능성 물질인 뼈 형성 단백질이 더 포함된 실시예 5, 6의 경우에는 기능성 물질이 더 포함되더라도 접착제의 강도 저하가 미미하지만, 기능성 물질이 과량 첨가된 비교예 4의 경우에는 탈세포화 세포 외 기질의 응집을 저해하여 제형화가 되지 않음을 확인할 수 있었다.
[실험예 5]
접착제의 유효성 검증 실험
앞서 제조예를 통해 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물을 골 결손부에 적용시 우수한 골전도 및 골유도능을 확인하기 위하여 동물 실험을 통해 골 형성 정도를 확인하였다.
먼저, 도 8과 같이 쥐의 두개골에 Trephine bur를 이용하여 지름 8mm의 두개골 결손부를 형성한 후(도 8a), 상기 골 결손부에 골이식재 (In'Oss, Biomatlante Biologics Solutions, FRN) 0.2cc 를 적용하였다(도 8b). 골 이식재가 충진된 곳에 상기 제조예에서 제조된 비교예 1과 실시예 2를 각각 도포한 후(도 8c), 차폐막 (Collagen Membrane, Genoss, KOR)을 10mm × 10mm 로 재단하여 주사형 접착제에 밀착시켰다(도 8d). 이 후 골막과 연조직을 봉합하고 6주 시점에 개체를 희생하여 골형성 정도를 관찰하였다.
골 형성 정도를 관찰하기 위하여 비교예 1과 실시예 2를 각기 적용한 시험체를 조직염색하여 골 형성도를 확인하였으며, 그 결과는 도 9와 같다.
도 9의 결과를 살펴보면, 비교예 1을 적용한 두개골에 비하여 실시예 2를 사용하여 접착한 두개골이 높은 밀도의 골 형성을 확인할 수 있었으며, 특히 실시예 2를 사용하여 접착한 경우 골 이식재가 흩어지지 않고 이식된 자리에 그대로 고정되어 있음을 확인할 수 있었다.
특히, 골 이식재 및 차폐막이 동요되지 않고 안정성 있게 고정되어 있고, 실시예 2에 포함된 탈세포화 세포 외 기질이 가지고 있는 우수한 골전도 및 골유도능을 가지고 있어 정상골 주변부로부터 신생골이 잘 형성되었음을 확인할 수 있었다.

Claims (9)

  1. 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)을 준비하는 단계;
    인산칼슘 화합물을 분쇄하는 분쇄단계;
    분쇄된 인산칼슘 화합물과 물을 혼합하여 1차 혼합물을 제조하는 1차 혼합단계; 및
    상기 1차 혼합물과 상기 탈세포화 세포 외 기질을 혼합하여 2차 혼합물을 제조하는 2차 혼합단계;를 포함하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 2차 혼합단계 후에,
    2차 혼합물을 2 ~ 8 ℃ 온도로 냉각시키는 냉각단계;를 더 포함하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분쇄단계는,
    인산칼슘 화합물을 10 ~ 2,000 ㎛ 입자크기로 분쇄하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 1차 혼합단계는,
    분쇄된 인산칼슘 화합물 80 ~ 90 wt% 및 물 10 ~ 20 wt% 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 2차 혼합단계는,
    1차 혼합물 50 ~ 80 wt% 및 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt% 비율로 혼합하는 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 2차 혼합단계는,
    1차 혼합물에 상기 탈세포화 세포 외 기질과 추가로 천연 고분자 물질을 더 포함하여 혼합하고,
    상기 천연 고분자 물질은, 카르복실메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose), 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 덱스트란(dextran) 및 알지네이트(alginate)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 2차 혼합단계는,
    1차 혼합물에 상기 탈세포화 세포 외 기질과 추가로 기능성 물질을 더 포함하여 혼합하고,
    상기 기능성 물질은, 뼈형성 단백질(BMP), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 전환성장인자(TGF-β), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 티오레독신(TRX), 줄기세포인자(SCF), 간세포 증식인자(HGF), 인간 성장 호르몬(hGH) 및 엔지오제닌(Angiogenin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물의 제조방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물.
  9. 탈세포화 세포 외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM), 인산칼슘 화합물, 천연 고분자 물질, 기능성 물질 및 물을 포함하고,
    상기 탈세포화 세포 외 기질 20 ~ 50 wt%, 인산 칼슘 화합물 40 ~ 72 wt%을 포함하되, 상기 탈세포화 세포 외 기질, 인산 칼슘 화합물, 천연 고분자 물질, 기능성 물질 및 물의 합이 100 wt%를 넘지 않고,
    상기 인산 칼슘 화합물은, 10 ~ 2,000 ㎛ 입자크기이며,
    상기 천연 고분자 물질은,
    카르복실메틸 셀룰로오스(carboxyl methyl cellulose), 헤파란황산(heparan sulfate), 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen), 덱스트란(dextran) 및 알지네이트(alginate)로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상이고,
    상기 기능성 물질은,
    뼈형성 단백질(BMP), 상피세포 성장인자(EGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 전환성장인자(TGF-β), 혈소판 유래 증식인자(PDGF), 인슐린 유사 성장인자(IGF-1), 티오레독신(TRX), 줄기세포인자(SCF), 간세포 증식인자(HGF), 인간 성장 호르몬(hGH) 및 엔지오제닌(Angiogenin)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 골 이식재 고정용 주사형 접착제 조성물.
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110279892B (zh) * 2019-06-10 2022-09-30 杭州华迈医疗科技有限公司 一种骨修复材料及其制备方法和应用
CN114984327B (zh) * 2022-06-18 2023-04-25 广州医科大学 一种复合骨缺损填补剂及其制备方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050013870A1 (en) * 2003-07-17 2005-01-20 Toby Freyman Decellularized extracellular matrix of conditioned body tissues and uses thereof
CA2737542C (en) * 2008-09-18 2019-01-29 The Curators Of The University Of Missouri Bionanocomposite for tissue regeneration and soft tissue repair
US9861662B2 (en) * 2013-07-03 2018-01-09 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Bone-derived extra cellular matrix gel
EP3041483B1 (en) * 2013-09-02 2021-05-26 Muffin Incorporated Products comprising an extracellular matrix tissue material and osteogenic protein
KR20160020298A (ko) * 2014-08-13 2016-02-23 고려대학교 산학협력단 골 형성 유도인자가 탑재된 이중 기공구조를 갖는 인산칼슘 입자/지지체의 제조방법

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2021159198A1 (pt) 2020-02-14 2021-08-19 Kheiros Pater Inovação S.A Método de produção de biomaterial descelularizado, biomaterial descelularizado e uso do mesmo

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