CN111870731B - 一种复合海绵及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合海绵及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医用生物材料技术领域。本发明提供了一种复合海绵的制备方法，将壳聚糖原料顺次进行缩合和还原反应，得到烷基化壳聚糖，提升了凝血性能；然后用烷基化壳聚糖和凹凸棒进行混合，经过干燥后即得复合海绵。本发明提供的制备方法简易，工艺要求低，能快速高效的制备得到目标产品。本发明还提供了所述制备方法得到的复合海绵，提高了凹凸棒和壳聚糖的止血能力，达到快速止血的效果。本发明还提供了复合海绵在作为止血材料中的应用，不仅止血性能好，经过壳聚糖和凹凸棒的结合整体性发挥作用，同时最小化不良反应，进行止血。

Description

一种复合海绵及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，尤其涉及一种复合海绵及其制备方法和应用。
背景技术
目前市场具有很多止血产品，但很多都具有一些不足，比如价格昂贵，使用过程中出现放热反应，灼伤皮肤，造成皮肤组织敏感等。因此急需一种止血迅速，便于人员操作，对皮肤组织无害且具有良好生物相容性的止血材料。
壳聚糖一直是优质止血材料的好选择，但对以往壳聚糖的止血研究已到达了瓶颈期，其他高分子止血剂如HemCon、Celox和Celox-D等主要成分皆为壳聚糖，优点是黏附性强和生物相容性好，但其主要缺点是不能应用于严重出血创伤。
凹凸棒(attapulgite)是一种宝贵的天然矿物质，在自然界中分布广泛，藏量丰富。凹凸棒呈粉末状，是由硅酸盐矿物在地球表面风化和地质的作用而形成的，并具有一定的可塑性和粘结力，具有介于链状结构和层状结构之间的中间结构。但凹凸棒以颗粒粉末状存在，如使用凹凸棒直接单独止血，颗粒很容易残留脉管，阻塞血管末梢形成血栓甚至使肺部产生血栓。
目前国内使所用的止血产品现在还是止血带、绷带等传统产品，还未有一种快速止血剂能同时拥有止血效率高、黏附性能强、生物安全性高的能力。因此，急需研发一种止血迅速、生物安全度高、便于使用的快速止血材料。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的问题，提供一种复合海绵及其制备方法和应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种复合海绵的制备方法，包含下列步骤：
(1)将壳聚糖、脂肪醛和溶液混合后进行缩合反应，得到亚胺化壳聚糖；
(2)在酸性条件下，将亚胺化壳聚糖和还原剂进行还原反应，得到烷基化壳聚糖；
(3)将烷基化壳聚糖、凹凸棒和溶液混合得到混合体系，将混合体系干燥后即得所述复合海绵。
作为优选，所述步骤(1)中壳聚糖的粘度为1000～2000cps，所述脂肪醛为辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、月桂醛、十三醛和肉豆蔻醛中的一种或几种，所述溶液为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量浓度为0.5～2％。
作为优选，所述步骤(1)中壳聚糖和脂肪醛的摩尔比为1：0.1～3，所述壳聚糖和溶液的用量比为1g：(80～120)mL；所述缩合反应的时间为5～9h。
作为优选，所述步骤(2)中还原剂为氢化铝锂、二异丁基氢化铝或硼氢化钠，所述还原剂与脂肪醛的质量比为1：0.8～1.2。
作为优选，所述步骤(2)中酸性条件的pH为4～6，所述还原反应的时间为1.5～2.5h。
作为优选，所述步骤(3)中溶液为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量浓度为0.1～0.4％，所述混合体系中烷基化壳聚糖的质量浓度为0.1～0.4％，所述烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比为1：0.25～1。
作为优选，所述步骤(3)中干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的冷陷温度为﹣60～﹣50℃，所述冷冻干燥的真空度为0.8～1.2Pa，所述冷冻干燥的时间为36～48h。
本发明还提供了所述制备方法得到的复合海绵。
本发明还提供了所述的复合海绵作为止血材料的应用。
本发明提供了一种复合海绵的制备方法，将壳聚糖原料顺次进行缩合和还原反应，得到烷基化壳聚糖，提升了凝血性能；然后用烷基化壳聚糖和凹凸棒进行混合，经过干燥后即得复合海绵。本发明提供的制备方法简易，工艺要求低，能快速高效的制备得到目标产品。
本发明还提供了所述制备方法得到的复合海绵，本发明提供的复合海绵将带有正电荷的烷基化壳聚糖和带有负电荷的凹凸棒进行结合，通过正负电荷互相吸附提高两者的结合度，最小化残留伤口的材料量，保证材料安全性；同时又提高了凹凸棒和壳聚糖的止血能力，达到快速止血的效果。
本发明还提供了复合海绵在作为止血材料中的应用，不仅止血性能好，经过壳聚糖和凹凸棒的结合整体性发挥作用，同时最小化不良反应，达到了快速止血的目的。
附图说明
图1为实施例1中不同比例壳聚糖和脂肪醛制备出的烷基化壳聚糖体外全血凝固时间(空白组与其他组别进行统计学分析，*表示p<0.05，具有统计学差异；**表示p<0.01，具有显著的统计学差异)；
图2为实施例2凹凸棒活化部分凝血酶时间(APTT)和凝血酶原时间(PT)相对于空白对照组的比率；
图3为实施例2测得凹凸棒的比表面积；
图4为实施例3制备的复合海绵实物图；
图5为实施例3按照烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：0制备出的复合海绵的电镜图；
图6为实施例3按照烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：0.3制备出的复合海绵的电镜图；
图7为实施例3按照烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：0.5制备出的复合海绵的电镜图；
图8为实施例3按照烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：1制备出的复合海绵的电镜图；
图9为实施例3不同烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比的复合海绵的单位重量吸水量(烷基化壳聚糖：凹凸棒的质量比为1：0的组别与其他组别进行统计学分析，**表示p<0.01，具有显著的统计学差异)；
图10为实施例3不同烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比的复合海绵的体外凝血时间(空白组与其他组别进行统计学分析，**表示p<0.01，具有显著的统计学差异；***表示p<0.001，具有极其显著的统计学差异)；
图11为实施例4不同样品的全血吸收量图；
图12为实施例4制备的复合海绵的全血黏附扫描电镜图；
图13为实施例4制备的AC样品的全血黏附扫描电镜图；
图14为实施例4制备的医用纱布的全血黏附扫描电镜图；
图15为实施例5的体外动态全血凝固试验分析(复合海绵组与其他组进行统计学分析，*表示p<0.05，具有统计学差异；**表示p<0.01，具有显著的统计学差异；***表示p<0.001，具有极其显著的统计学差异；ns表示无显著性差异)；
图16为实施例7不同样品溶血率(凹凸棒与复合海绵和AC进行统计学分析，**表示p<0.01，具有显著的统计学差异；***表示p<0.001，具有极其显著的统计学差异；复合海绵与AC进行统计学分析，ns表示无显著性差异)。
具体实施方式
本发明提供了一种复合海绵的制备方法，包含下列步骤：
(1)将壳聚糖、脂肪醛和溶液混合后进行缩合反应，得到亚胺化壳聚糖；
(2)在酸性条件下，将亚胺化壳聚糖和还原剂进行还原反应，得到烷基化壳聚糖；
(3)将烷基化壳聚糖、凹凸棒和溶液混合得到混合体系，将混合体系干燥后即得所述复合海绵。
在本发明中，所述步骤(1)中壳聚糖的粘度优选为1000～2000cps，进一步优选为1200～1800cps，更优选为1400～1600cps；所述脂肪醛优选为辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、月桂醛、十三醛和肉豆蔻醛中的一种或几种，进一步优选为十一醛、月桂醛和十三醛中的一种或几种，更优选为月桂醛；所述溶液优选为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量浓度优选为0.5～2％，进一步优选为0.8～1.7％，更优选为1～1.5％。
在本发明中，所述步骤(1)中壳聚糖和脂肪醛的摩尔比优选为1：0.1～3，进一步优选为1：0.3～1.5，更优选为1：0.5～1；所述壳聚糖和溶液的用量比优选为1g：(80～120)mL，进一步优选为1g：(90～110)mL，更优选为1g：(95～105)mL；所述缩合反应的时间优选为5～9h，进一步优选为6～8h，更优选为6.5～7.5h；所述缩合反应优选在搅拌条件下进行，所述搅拌的转速优选为1000～1400rpm，进一步优选为1100～1300rpm，更优选为1150～1250rpm；所述缩合反应的温度优选为室温。
在本发明中，所述步骤(1)中优选将壳聚糖和溶液混合溶解后再加入脂肪醛进行缩合反应。所述缩合反应为脂肪醛中的醛基和壳聚糖中的氨基进行反应，脱水得到了含有亚胺结构的壳聚糖。
在本发明中，所述步骤(2)中还原剂优选为氢化铝锂、二异丁基氢化铝或硼氢化钠，更优选为硼氢化钠；所述还原剂与脂肪醛的质量比优选为1：0.8～1.2，进一步优选为1：0.9～1.1，更优选为1：0.95～1.05。
在本发明中，所述步骤(2)中酸性条件的pH优选为4～6，更优选为4.5～5.5；所述调节酸碱度的试剂优选为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为5～15％，更优选为8～12％；所述还原反应的时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为1.7～2.3h，更优选为1.9～2.1h；所述还原反应优选在搅拌状态下进行，所述搅拌的转速优选为1000～1400rpm，进一步优选为1100～1300rpm，更优选为1150～1250rpm。
在本发明中，亚胺化壳聚糖和还原剂发生还原反应，将碳氮双键烷基化，完成了对壳聚糖的改性。
在本发明中，所述步骤(2)中的还原反应结束后优选进行调节酸碱度，所述酸碱度的pH优选为9～11，更优选为9.5～10.5；所述调节酸碱度的试剂优选为氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的质量浓度优选为5～15％，更优选为8～12％；调节酸碱度至目标pH值后即可得到沉淀产物，对沉淀产物过滤并进行洗涤；所述洗涤的试剂优选为蒸馏水，所述沉淀产物经洗涤后的酸碱度优选为中性；所述沉淀产物洗涤结束后优选进行后处理。
在本发明中，所述后处理优选顺次进行提取和干燥；所述提取优选为索氏提取，所述索氏提取的温度优选为80～100℃，更优选为85～95℃；所述索氏提取的试剂优选为乙醇，所述索氏提取的时间优选为10～14h，进一步优选为11～13h，更优选为11.5～12.5h；所述干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度优选为﹣60～﹣50℃，更优选为﹣58～﹣52℃；所述冷冻干燥的真空度优选为0.8～1.2Pa，更优选为0.9～1.1Pa；所述冷冻干燥的时间优选为36～48h，进一步优选为38～46h，更优选为40～44h。后处理结束后即可得到烷基化壳聚糖。
在本发明中，所述步骤(3)中溶液优选为醋酸溶液，所述醋酸溶液的质量浓度优选为0.1～0.4％，进一步优选为0.2～0.3％，更优选为0.23～0.27％；所述混合体系中烷基化壳聚糖的质量浓度优选为0.1～0.4％，进一步优选为0.2～0.3％，更优选为0.23～0.27％；所述烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比优选为1：0.25～1，进一步优选为1：0.28～0.8，更优选为1：0.3～0.6。
在本发明中，所述步骤(3)中的混合优选为超声混合，所述超声混合的时间优选为3～7min，更优选为4～6min；所述超声混合的频率优选为20～25KHz，更优选为20.5～21.5KHz。
在本发明中，所述步骤(3)中干燥优选为冷冻干燥，所述冷冻干燥的冷陷温度优选为﹣60～﹣50℃，更优选为﹣58～﹣53℃；所述冷冻干燥的真空度优选为0.8～1.2Pa，更优选为0.9～1.1Pa；所述冷冻干燥的时间优选为36～48h，进一步优选为38～46h，更优选为40～44h。
本发明还提供了所述制备方法得到的复合海绵。
本发明还提供了所述的复合海绵作为止血材料的应用。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
取2g粘度为1500cps的壳聚糖粉末溶于200mL的1％醋酸溶液中，按照壳聚糖和月桂醛分别为1：0.1、1：0.3、1：0.5、1：1、1：1.5和1：3的摩尔比添加月桂醛，在室温下以1200rpm的转速搅拌7h后得到亚胺化壳聚糖，然后使用10％的氢氧化钠溶液调节pH为5，加入与月桂醛相同质量的硼氢化钠，在1200rpm下搅拌2小时后得到烷基化壳聚糖；还原反应结束后使用10％氢氧化钠溶液调节pH为10，得到沉淀，将沉淀使用蒸馏水洗涤至中性，设置索氏提取器的温度为90℃，以乙醇为萃取剂提取12h后，置于冷冻干燥机中，设置温度为﹣54.3℃，真空度为1.0Pa，冻干42h，得到干燥后的烷基化壳聚糖。
对使用不同比例壳聚糖和月桂醛制备出的烷基化壳聚糖进行体外全血凝固时间(CBT)测定：取15mg不同的烷基化壳聚糖加入5mL的离心管中，同时设置空白对照组：不加任何的烷基化壳聚糖和只添加未改性的壳聚糖；将上述的离心管在37℃恒温水浴中孵育5min后分别加入1mL抗凝全血，在37℃水浴中继续孵育3min，然后分别加入500uL浓度为0.025mol/L的氯化钙溶液，继续在37℃水浴中孵育，每隔15s取出试管并倾斜，观察血液是否流动，直至试管倾斜达90°未出现血液为止，各组血液凝固时间记录在图1中。
结论：从图1中可以看出，壳聚糖粉末与月桂醛的质量比为1：0.1时效果最佳，其体外凝血时间最短，达到了75s。
实施例2
对凹凸棒进行内源性凝血通路(APTT)和外源性凝血通路(PT)的影响实验：将抗凝全血以3500rpm离心15min，取上清，将3mg的凹凸棒与200ul血浆均匀混合，在37℃下孵育15min作为待测血浆；
APTT检测：取0.1mL待测血浆，加入37℃预温APTT试剂0.1mL，在37℃恒温水浴中孵育5min；加入37℃预温的0.025mol/LCaCl2溶液0.1mL，采用同样的方法进行空白实验，将凝固时间记录在图2中。
PT检测：取0.1mL待测血浆，37℃孵育3min，加入37℃预温PT试剂0.2mL，采用同样的方法进行空白实验，将凝固时间记录在图2中。
结论：凹凸棒能够有效的降低PT值，说明凹凸棒可以激活其外源性凝血通路；而APTT值相对于对照组无显著变化，说明凹凸棒对内源性凝血通路无影响。
凹凸棒的比表面积是其优良止血性能的因素之一，对凹凸棒表面积进行测定：将凹凸棒样品(凹凸棒颗粒大小：22.3±5.4μm)放置于烘箱中，在150℃烘干4h；将样品放置在对应的样品玻璃管中，称量样品加入前后玻璃管的重量差以计算出样品质量；将玻璃管放置到全自动比表面积分析仪上，检测设备，确保处于不漏气密闭状态，温度设置为350℃，利用BET法测定样品的比表面积，检测结果如图3所示。
结论：经测定，本研究中所使用的凹凸棒(颗粒大小：22.3±5.4μm)的比表面积约为126.7201m2/g。
实施例3
经过实施例1验证可知，壳聚糖与月桂醛的质量比为1：0.1时，效果最佳，本实施例采用上述比例进行复合海绵的制备。
将经过冷冻干燥后的烷基化壳聚糖溶于质量浓度为0.25％的醋酸溶液中，得到烷基化壳聚糖为0.25％的烷基化壳聚糖溶液，带烷基化壳聚糖完全溶解后，按照烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比分别为1：0.25，1：0.3，1：0.5，1：1的比例投加凹凸棒，并同时设置不添加凹凸棒的对照组和空白对照组，将上述混合溶液分别进行超声混合，设置超声频率参数为开3秒-关2秒(占空比40％)，功率比30％，即195W，超声混合5min，混合均匀后在-54.3℃，真空度1.0Pa下冷冻干燥40h，得到复合海绵。
图4为本实施例制备出的复合海绵实物图。
在扫描电镜下分别观察烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：0，1：0.3，1：0.5和1：1制备出的复合海绵，分别如图5、图6、图7和图8所示。
从电镜图中可以看出，当烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比为1：0时，复合海绵表面很光滑，而其他烷基化壳聚糖和凹凸棒不同比例制备的复合海绵中，可以观察到凹凸棒已经成功结合在海绵上。
对本实施例制备的复合海绵进行单位重量吸水量(mg/mg)测定：取冷冻干燥后的海绵在60℃下烘干3min，称取干态海绵样品的质量为W0，将其浸入水中10s，后用镊子夹起控水10s，称量吸水后重量W1，单位重量吸水量情况如图9所示。
对本实施例制备的复合海绵进行体外全血凝固时间测定：取15mg不同的复合海绵加入5mL的离心管中，同时设置空白对照组和只含有烷基化改性壳聚糖的实验组；将上述的离心管在37℃恒温水浴中孵育5min后分别加入1mL抗凝全血，在37℃水浴中继续孵育3min，然后分别加入500uL浓度为0.025mol/L的氯化钙溶液，继续在37℃水浴中孵育，每隔15s取出试管并倾斜，观察血液是否流动，直至试管倾斜达90°未出现血液为止，各组血液凝固时间记录在图10中。
结论：从图9和图10可以得出：确定复合海绵最佳比例为烷基化壳聚糖：凹凸棒的质量比为1：0.3时，与空白组相比，凝血时间明显缩短，且效果最佳。
实施例4
通过实施例3的结果可知，当烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比为1：0.3时，止血效果最好；确定完比例后本实施例通过样品在全血中孵育不同时间的吸血量来评价样品对血液的吸收情况，继而通过测定血红蛋白含量的实验来判断样品对血液凝血的情况。
体外抗凝全血不同时间血液吸收量检测：
取抗凝全血20mL待用，分别取医用纱布、烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1:0的海绵(AC)和烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1:0.3的复合海绵，样品经60℃干燥4h后除去多余水分，每组样品准备6块样品，(吸血前重量W0)，相继放置与37℃孵育的全血上，并分别保持吸血5，10，20，30，40，60s后迅速拿出每个样品，置于滤纸上吸取多余的血液并保持30s。置于天平称重(吸血后重量W1)。计算单位重量吸血量，结果如图11所示。
结论：通过对不同样品不同时间吸血量检测可得，在最初的10s内，制备的复合海绵与市面上传统的医用纱布吸血量相似，后随着在全血中孵育时间的增加，可以看到复合海绵的吸血量是远远超于医用纱布，同样添加了凹凸棒后的复合海绵，吸血量远超未添加凹凸棒的烷基化壳聚糖海绵(AC)。
检测全血在样品上的黏附情况：
将上述大小样品浸没于全血15min后，用0.01M的PBS溶液洗涤，加入足量的4％戊二醛PBS溶液固定，置于4℃保存过夜。次日用30％，50％，70％，90％和100％的乙醇溶液梯度脱水，自然晾干后，于扫描电镜下观察全血黏附情况，复合海绵、AC样品和医用纱布的扫描电镜图分别如图12、图13和图14所示。
结论：通过扫描电镜观察，样品与全血孵育15min后，在相同放大倍数的电镜下可以清楚地看到复合海绵(1:0.3)上的血细胞数量明显多于其他两组，而普通医疗纱布上黏附的血细胞数量最少，经细胞计数分析，复合海绵黏附细胞数目约为2745个/mm2；AC海绵黏附细胞数目约为1140个/mm2；医用纱布黏附细胞数目约为1485个/mm2，因此复合海绵(1:0.3)的凝血效果较其他突出。
实施例5
通过实施例3的结果可知，当烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比为1：0.3时，止血效果最好；本实施例采用上述比例进行血红蛋白含量检测实验。
从SD大鼠(220-260g，6-8周，雄性)中取血，贮存在抗凝血采血管中，然后吸取10uL新鲜全血，分别滴在24孔细胞培养板中的复合海绵(1cm*1cm)样品上，将同样量的新鲜全血直接滴在24孔细胞培养板上，作为空白组，每组材料和血液共培养不同时间(15，30，60和90s)，然后，分别将2mL去离子水加入各组的细胞培养板中以溶解有游离的血红细胞。并用酶标仪测量在545nm的吸光度，测量10uL新鲜全血在2mL去离子水的吸光度作为参照值，每组测量三次。根据Atest/Aref*100计算血红蛋白含量(％)，其中Atest和Aref分别是样品和参比组的吸光度值，检测结果如图15所示。
结论：根据测定样品组和空白组的血红蛋白含量数据表明，空白对照组在孵育90s时，血红蛋白含量仍然高于85％，说明血液在自然状态下很凝固，凝固速率很慢。实验组复合海绵在15s时血红蛋白含量在20％以下，表明复合海绵与空白组相比具有较快的凝血速率。
实施例6
以烷基化壳聚糖和凹凸棒质量比为1：0.3的比例进行体内止血效果实验。
大鼠断尾出血试验：
选定SD大鼠(220-260g，6-8周，雄性)，分为三个组，即分为空白对照组，复合海绵实验组和医用纱布阳性对照组，大鼠用4％水合氯醛(1mL/100g)进行腹部注射麻醉，将大鼠在台上固定后，距离尾尖减去2cm，让其自由出血20s，后用上述止血材料(1cm*1cm)进行止血按压，每隔30s观察血液流出情况，使用滤纸判断是否还有血液流出，以30s内不再出血为结束。分别记录动物的止血时间与出血量，结果记录在表1中。
表1
Figure BDA0002640938130000101
Figure BDA0002640938130000111
结论：止血材料对大鼠断尾止血效果显示，复合海绵实验组整体效果明显好于空白对照组和医用纱布阳性对照组，血液凝固时间大约在80～90s，血液流失量在10mg左右波动，与空白对照组和医用纱布阳性对照组相比，复合海绵实验组血液凝固时间与血液流失量均明显减少，表明复合海绵样品具有明显的止血效果。
实施例7
对本申请制备的复合海绵进行止血材料生物安全性测试。
本发明公开技术制备的止血材料，根据其预期用途和生物学评价原则，以GBT16886/ASTMF756系列标准要求及其方法为依据，对该技术涉及的止血材料进行了溶血实验，实验结果如图16所示。
结论：根据溶血率时间数据可知，单独凹凸棒的溶血率随着浓度的降低而降低，在浓度高时与复合海绵和AC海绵相比具有显著性差异，而复合海绵与AC海绵两者之间无显著性差异，生物相容性良好。随着浓度的降低，凹凸棒与复合海绵和AC海绵之间差异性降低，说明材料都具有良好的血液相容性，并且可以明显的缩短凝血时间。
由以上实施例可知，本发明提供了一种复合海绵，将带有正电荷的烷基化壳聚糖和带有负电荷的凹凸棒进行结合，通过正负电荷互相吸附提高两者的结合度，最小化残留伤口的材料量，保证材料安全性；同时又提高了凹凸棒和壳聚糖的止血能力，达到快速止血的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种复合海绵的制备方法，其特征在于，包含下列步骤：
（1）将壳聚糖、脂肪醛和溶液混合后进行缩合反应，得到亚胺化壳聚糖；
（2）在酸性条件下，将亚胺化壳聚糖和还原剂进行还原反应，得到烷基化壳聚糖；
（3）将烷基化壳聚糖、凹凸棒和溶液混合得到混合体系，将混合体系干燥后即得所述复合海绵；
所述步骤（1）中的溶液为醋酸溶液；所述脂肪醛为月桂醛；
步骤（1）中所述壳聚糖和脂肪醛的摩尔比为1：0.1；
所述步骤（2）中的还原反应结束后调节酸碱度，调节酸碱度至目标pH值后即可得到沉淀产物，对沉淀产物过滤并进行洗涤和后处理；
所述后处理为顺次进行提取和干燥；所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的温度为﹣60~﹣50℃；所述冷冻干燥的真空度为0.8~1.2Pa；所述冷冻干燥的时间为36~48h；
所述烷基化壳聚糖和凹凸棒的质量比为1：0.3~1；
所述步骤（3）中溶液为醋酸溶液；
所述步骤（3）中干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥的冷陷温度为﹣60~﹣50℃，所述冷冻干燥的真空度为0.8~1.2Pa，所述冷冻干燥的时间为36~48h。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中壳聚糖的粘度为1000~2000cps，所述醋酸溶液的质量浓度为0.5~2%。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中壳聚糖和溶液的用量比为1g：（80~120）mL；所述缩合反应的时间为5~9h。
4.如权利要求1~3任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中还原剂为氢化铝锂、二异丁基氢化铝或硼氢化钠，所述还原剂与脂肪醛的质量比为1：0.8~1.2。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中酸性条件的pH为4~6，所述还原反应的时间为1.5~2.5h。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中醋酸溶液的质量浓度为0.1~0.4%，所述混合体系中烷基化壳聚糖的质量浓度为0.1~0.4%。
7.权利要求1~6任意一项所述制备方法得到的复合海绵。
8.权利要求7所述的复合海绵作为制备止血材料的应用。
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