CN111870702A - 一种纳米眼用药物的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种纳米眼用药物的制备方法及其应用，通过构建具有优异催化活性的新型氮掺杂多肽修饰石墨烯纳米药物，消除视网膜细胞中过量的活性氧，缓解细胞的氧化应激状态，对相关眼底病变的早期进行干预。采用含氮多肽分子与石墨粉共混球磨改性，制备氮掺杂多肽修饰石墨烯纳米体系。细胞实验和动物实验证实了所制备的纳米体系对于蓝光损伤的细胞模型和动物模型中过量的活性氧具有出色的清除能力，揭示了新型纳米体系在眼底病变早期阶段干预病程发展的可行性，为氧化应激损伤性眼底疾病的治疗提供了新的思路。

Description

一种纳米眼用药物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及纳米药物与生物医学技术领域，具体涉及一种纳米眼用药物的制备方法及其应用。

背景技术

氧气是人体生命运动过程中不可缺少的一种物质, 但是环境中的氧气具有较高的氧化性, 会导致人体各种器官随着年龄的增大不断地受到氧的腐蚀而老化损伤。造成这种损伤的主要原因就是体内活性氧（ROS）的过量产生。ROS是体内一类氧的单电子还原产物,是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗少量氧而生成的。ROS自由基是一类外轨道上含有孤对电子的分子，包括超氧阴离子（O^2-）、过氧化氢（H₂O₂）、羟自由基（•OH）等。这些自由基活性很强，为了获得自身的稳定，会从其他分子上夺取电子，破坏胞内其他分子的结构，引起一系列的氧化应激连锁损伤，引发病理性反应。而ROS在体内产生的主要负面作用就是氧化应激，是指体内氧化与抗氧化作用失衡而倾向于氧化的状态，被认为是导致衰老和疾病的重要原因。在眼内，由于眼底视网膜代谢旺盛，有很高的氧需求，此处微环境中氧分压可高达70-90 mmHg，使得视网膜处的细胞处于高氧化应激损伤的风险中，易导致多种氧化应激相关性眼底疾病，比如年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜脱落（RD）、青光眼、视网膜色素变性（RP）等。

譬如，视网膜色素上皮（RPE）细胞在内外不利条件的刺激下，会产生过多的ROS，从而导致细胞的氧化应激状态，被视为年龄相关性黄斑变性（AMD）的显著特征和主要诱因。AMD是一种涉及视网膜黄斑区域的眼病，可造成中心视力的进行性、不可逆性丧失，是目前全球主要不可逆致盲性眼病之一，严重威胁着人类的视觉健康。流行病学调查结果显示，目前全球有近9%的人受此病困扰，预计到2040年，患病人数预计将会增长到2.88亿人。在我国，AMD已成为继白内障和青光眼之后的第三大致盲眼病。

根据AMD的病程发展，可将其分为早期AMD和晚期AMD: 早期AMD表现为RPE细胞异常和玻璃膜疣的出现。晚期根据有无新生血管，可分为渗出性AMD（湿性AMD）和非渗出性AMD（干性AMD）。目前，临床上针对AMD的治疗的主要手段只能在湿性AMD发展到晚期阶段，出现新生血管后，对症应用抗血管内皮生长因子（VEGF）药物，以期减少病理性新生血管，降低渗出量，延缓疾病的恶化。但是长期抗VEGF治疗后不仅疗效下降，同时会诱导视网膜纤维化、瘢痕等多种并发症。且此种方法只针对湿性AMD晚期出现的新生血管，对疾病早期和干性AMD的发生发展无有效作用。因此，如何在AMD病程的前期进行对因干预，从而实现对病情发展的控制，是眼科临床上的一大挑战。RPE细胞中ROS量过多引起的氧化应激损伤是AMD的主要致病原因之一，若能有效降低RPE细胞内活性氧的量，缓解细胞的氧化应激状态，有望在对包括AMD的氧化应激损伤类眼底疾病实现早期的干预与预防。

发明内容

为了针对临床上对于氧化应激损伤类眼底疾病的有效治疗手段缺乏的技术缺陷，本发明提供了一种纳米眼用药物的制备方法及其应用，合成的新型纳米药物，有望为眼科临床实现在源头上干预氧化应激损伤类眼底疾病，抑制其病变进程提供新的治疗思路与干预手段。

本发明采用的技术解决方案是：一种纳米眼用药物的制备方法，包括以下步骤：将石墨粉与含氮多肽分子按比例混合后置于球磨罐内，室温球磨，球磨结束后采用高速离心处理和去离子水溶液透析，依次除去沉淀中的杂质，最后将沉淀分散于去离子水中，得到含氮多肽修饰石墨烯纳米体系的纳米眼用药物。

所述的石墨粉与含氮多肽分子的质量比为1:2-3:1。

所述的室温球磨时间为2-4个小时，球磨转速为300-500 rpm。

所述的含氮多肽分子为细胞因子多肽-碱性成纤维生长因子、TGA多肽、乳酸链球菌素、谷胱甘肽中的一种或几种。

所述的眼用药物的剂型包括滴剂、眼膏剂或注射剂中的一种。

一种所述的制备方法制备的纳米眼用药物。

一种纳米眼用药物在制备前期干预氧化应激损伤性眼底疾病药物的应用。

所述的氧化应激损伤性眼底疾病包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜脱落（RD）、青光眼、视网膜色素变性（RP）、糖尿病视网膜病变（DR）中的一种或几种。

一种纳米眼用药物在制备视网膜细胞氧化应激抑制剂上的应用。

所述的视网膜细胞包括视网膜色素上皮（RPE）细胞、感光（RPC）细胞或视神经节（RGC）细胞。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种纳米眼用药物的制备方法及其应用，通过细胞内的主动化学催化反应，高效消除细胞内的过量ROS，缓解细胞的氧化应激状态，在病变早期进行对因干预，以抑制病程的发展，变被动为主动，从而有效保护患者免受或尽可能少受视力与视功能损伤，提高生活质量，解决了现有临床技术，只能在氧化应激损伤性眼底疾病的晚期，采用对症治疗，通过药物或手术缓解病情以延缓病情的进一步恶化，对于已缺失的视野与损伤的视功能不可逆的技术缺陷。

附图说明

图1为本发明合成的含氮多肽修饰石墨烯纳米药物消除ROS的示意图。

图2为所制备的新型纳米药物的（a）水相分散图与（b）细胞生物相容性评价。

图3为所合成的新型纳米药物的原子力表征图。

图4为所制备的新型纳米药物对于细胞内ROS的消除效果评价。

图5为所制备的新型纳米药物对于细胞氧化应激DNA损伤的保护作用。

图6 为所制备的新型纳米药物对于眼内ROS的消除效果评价。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

下面结合附图以及具体实施例，可以更好地说明本发明。

实施例1.

一种前期干预氧化应激损伤性眼底疾病的纳米眼用药物，其制备方法包括下述步骤：

将石墨粉与多肽分子按质量比1:2-3:1的比例混合后置于球磨罐内。以300-500 rpm的转速室温球磨2-4个小时。球磨结束,分别采用高速离心处理和去离子水透析，依次除去沉淀中的杂质。最后将沉淀分散于去离子水中，得到含氮多肽修饰石墨烯纳米体系。从图1 的示意图中可以看出，所合成的新型纳米药物通过原子厚度纳米片的尺寸效应进入细胞，通过表面的大π键吸引ROS，然后通过氮掺杂得到的优异活性催化消除ROS。

实施例2.

将实施例1得到的纳米产物水相分散到去离子水中，如图2（a）所示，可得到稳定的分散液。在4℃储存这种分散液2周以上，未发现分散液有任何的变化，表明了纳米药物具有良好的长期水相分散性。将所制备的纳米药物与视网膜色素上皮（RPE）细胞的一种细胞系ARPE-19细胞共培养一定时间后，可以发现，即使采用了高达10 µg/mL的纳米药物共培养72小时之后，细胞存活率依然高达100%以上（图2b），充分说明了所制备纳米药物的良好生物相容性。

实施例3.

将实施例2得到的纳米药物水相分散液点涂到云母片上，然后通过AFM检测其形貌。从图3可以看出，所制备的氮掺杂多肽修饰石墨烯展现了典型的石墨烯纳米片结构，其厚度在1.4 nm左右，说明其优异的尺寸效应能够穿透细胞膜进入细胞。

实施例4.

采用超氧化物阴离子荧光探针（Dihydroethidium DHE）来定量检测细胞内活性氧的增减情况。DHE本身带蓝色荧光，可进入活细胞内，与胞内的超氧阴离子相互作用，脱氢生成乙啡啶（ethidium），脱氢产物可与DNA或RNA发生反应，生成一种红色荧光产物。胞内超氧阴离子的量和红色荧光产物的量成正相关。将ARPE-19细胞在6000 Lux的蓝光灯下照射3 h，如图4所示，细胞内的ROS表达量激增了86%。当将实施例1得到的纳米药物添加到蓝光损伤得到的细胞模型中时，从图4中可以看到，ROS的含量随着纳米药物浓度的增加而显著降低。当纳米药物浓度为100 ng/mL时，细胞内ROS的量降到最低值。由此可见，100 ng/mL的纳米药物在降低细胞内ROS含量方面是最适宜的浓度。

实施例5.

DNA是细胞内ROS攻击的大分子之一，细胞氧化应激状态越显著， DNA受攻击的概率及数量就越多，所以可以通过DNA的受损情况来推测细胞的氧化应激状态。图5是彗星实验中DNA染色的荧光图，图中的小尾巴样结构即为受损的DNA片段，此种结构越多，说明DNA受损伤的程度越大。从图中可以看出，在光照的细胞模型中，产生了大量的DNA损伤。通过量化分析可以得到损伤DNA约占全部DNA的38%。相比于未光照的对照组（10%的受损DNA），DNA损伤是非常明显的。且这种损伤持续到了光照结束后24h，比例并未见减少，说明过量的ROS持续攻击DNA，且不能被细胞自身修复，细胞处于氧化应激状态。而在加入实施例1所制备的纳米药物之后的细胞损伤模型，光照刚刚结束时，拖尾样结构的DNA含量约为17%，相比单纯光照组明显减少了54%。当光照结束24 h时，受损DNA的含量进一步减少到13%，相对于单纯光照组显著减少了64%。说明实施例1所制备的纳米药物，具有很好的消除ROS能力和缓解细胞氧化应激状态作用。

实施例6.

通过条件优化，采用1×10⁵ Lux的蓝光灯照射C57BL/6小鼠4 h制备动物模型，通过DHE染色检测眼内ROS的含量变化。为了消除注射带来的影响，在光照组依照相同条件注射了生理盐水（NS）作为对照。图6中可以看到，DAPI所染的蓝色代表细胞核所在，而DHE所染的红色代表视网膜组织中ROS含量。由图可知，与未处理的对照组相比，注射NS的光照组中的视网膜处的ROS含量显著上升。但是在注射了实施例1所制备的纳米药物之后，DHE染色的颜色明显变暗，说明光照所产生ROS含量显著降低。该结果在动物层面，证实了所制备的新型纳米药物，具有优异的ROS消除能力。

机理

（1）通过制备二维纳米厚度的功能化石墨烯纳米片以穿透细胞膜进入细胞，以实现近距离、更高效消除ROS的目的。

（2）采用亲水性好、生物相容性佳的多肽分子修饰石墨烯，以有效提高纳米片的水相分散性和生物相容性。

（3）通过石墨烯大π键的合成，有效增强纳米体系对于ROS的亲和力，以实现对于ROS的高靶向收集效果。

（4）采用含氮多肽分子，将吸电子原子氮掺杂到石墨烯π-π共轭碳环结构中，使得π键上的电子云部分转移，从而造成相邻碳原子成为高活性的位点，高效催化消除ROS。

结论

本发明将针对临床上对于氧化应激损伤类眼底疾病的有效治疗手段缺乏，致力于开发以多肽分子修饰的氮掺杂石墨烯（PG）为基础的纳米眼用药物体系，从源头上消除过量ROS的产生，缓解细胞的氧化应激状态，从而抑制病理状态的发生。所制备的纳米药物具有二维的原子厚度，能够穿透细胞膜进入细胞内部；典型的石墨烯π-π共轭碳环赋予了新型纳米药物大π键结构，对于ROS具有强亲和力；吸电子氮原子在石墨烯碳环中的掺杂，能够引起电子云的部分偏移，从而具有优异的催化活性，能够用于ROS的高效消除。所合成的新型纳米药物，有望为眼科临床实现在源头上干预氧化应激损伤类眼底疾病，抑制其病变进程提供新的治疗思路与干预手段，并能广泛的为与氧化应激相关的众多慢性凋亡性疾病的治疗提供新的策略。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种纳米眼用药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将石墨粉与含氮多肽分子按比例混合后置于球磨罐内，室温球磨，球磨结束后采用高速离心处理和去离子水溶液透析，依次除去沉淀中的杂质，最后将沉淀分散于去离子水中，得到含氮多肽修饰石墨烯纳米体系的纳米眼用药物。

2.根据权利要求1所述的一种纳米眼用药物的制备方法，其特征在于，所述的石墨粉与含氮多肽分子的质量比为1:2-3:1。

3.根据权利要求1所述的一种纳米眼用药物的制备方法，其特征在于，所述的室温球磨时间为2-4个小时，球磨转速为300-500 rpm。

4.根据权利要求1所述的一种纳米眼用药物的制备方法，其特征在于，所述的含氮多肽分子为细胞因子多肽-碱性成纤维生长因子、TGA多肽、乳酸链球菌素、谷胱甘肽中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种纳米眼用药物的制备方法，其特征在于，所述的眼用药物的剂型包括滴剂、眼膏剂或注射剂中的一种。

6.一种采用权利要求1所述的制备方法制备的纳米眼用药物。

7.一种权利要求6所述的纳米眼用药物在制备前期干预氧化应激损伤性眼底疾病药物的应用。

8.根据权利要求7所述的纳米眼用药物在制备前期干预氧化应激损伤性眼底疾病药物的应用，其特征在于，所述的氧化应激损伤性眼底疾病包括年龄相关性黄斑变性（AMD）、视网膜脱落（RD）、青光眼、视网膜色素变性（RP）、糖尿病视网膜病变（DR）中的一种或几种。

9.一种权利要求6所述的纳米眼用药物在制备视网膜细胞氧化应激抑制剂上的应用。

10.根据权利要求9所述的纳米眼用药物在制备视网膜细胞氧化应激抑制剂上应用，其特征在于，所述的视网膜细胞包括视网膜色素上皮（RPE）细胞、感光（RPC）细胞或视神经节（RGC）细胞。

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