CN111867728A - 分离核酸的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从样品去除非靶DNA污染的方法。另外,本发明涉及对来自宫颈内样品的胎儿DNA的分析。
Description
相关申请的交叉引用
本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求均于2018年1月8日提交的美国专利申请序列号62/614,691和62/614,692的优先权权益。先前申请的公开内容被认为是本申请的一部分,并且通过引用整体并入本申请的公开内容中。
背景技术
技术领域
本发明总体上涉及用于从含有靶核酸和非靶核酸的宫颈内样品中分离靶核酸的方法和试剂盒,并且更具体地涉及对胎儿核酸的分析。
背景信息
DNA分离是分子生物学中已确立的方法。在此方法的过程中,细胞以整体被裂解并且DNA与基质结合,或者使用在有机和无机溶剂中不同的溶解度以去除细胞物质,例如蛋白质和干净DNA样品中不需要的其他组分。
在某些情况下,外来DNA和/或不需要的DNA(例如,病毒/细菌/无细胞DNA)可与靶细胞共存。这种DNA可以进入或粘附在靶细胞群上,从而干扰基于下游DNA的分析,例如PCR、测序以及全基因组扩增。如果要分析的靶DNA存在于污染性DNA宿主以及目的细胞类型二者中,这特别具有挑战性。这种情况要求靶DNA具有一定量的总分数以便精确分析。在这种情况下,污染性DNA将与靶DNA竞争并掩盖信号,从而使分析从具有挑战性变为不可能。
先前在工业上使用的自动化和高通量系统中对细胞核分离的尝试已证明是不成功的。此外,不具有所需的可重复性。
当前,没有可用的方法或试剂盒允许使用可用于手动和高通量应用的在DNA基质上分离细胞核的途径来高效去除目的细胞中的污染性DNA(例如核外DNA、母体DNA、微生物DNA、病毒DNA或无细胞DNA)。
发明内容
本发明基于开创性的发现,即可以从怀孕受试者的宫颈内样品中分离胎儿细胞。本发明还包括从含有靶核酸和非靶核酸的宫颈内样品中分离靶核酸(即胎儿核酸)并且随后对靶核酸进行分析。
在一个实施方案中,本发明提供了一种通过以下方式从包含细胞的样品中分离靶核酸的方法:在DNA结合膜或DNA结合基质上将来自所述样品的细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核;洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸;裂解所述细胞核以释放所述靶核酸;并且分离所述靶核酸。在一方面,所述靶核酸是胎儿核酸,并且所述非靶核酸是母体核酸、病毒核酸、微生物核酸或无细胞DNA。在另外的方面,所述细胞是人的。在某些方面,所述细胞是母体细胞和/或胎儿细胞。在一方面,所述样品是宫颈内样品,并且所述宫颈内样品包含母体细胞和胎儿细胞。在某些方面,所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。在一方面,所述细胞未固定或未结合至表面(例如DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质)。在另外的方面,使用月经杯收集所述宫颈内样品。在进一步的方面,所述蛋白质混合物包含优选消化细胞壁但不消化核被膜的蛋白酶。在某些方面,所述蛋白质混合物包含胃蛋白酶,并且优选地不包含DNA酶。如果选择的采样条件不允许离子自由流入和流出细胞(例如活细胞),尽管不太好控制,但可以使用低渗溶液从其他细胞物质中释出细胞核。在一方面,在非结合条件下将所述细胞与所述蛋白质混合物孵育。在另一方面,裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。在某些方面,所述裂解缓冲液是酶促或非酶促裂解缓冲液。在某些方面,所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。在另外的方面,所述靶核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。在进一步的方面,分离所述靶核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合洗脱所述核酸。在一方面,所分离的靶核酸的非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。在进一步的方面,通过DNA测序、PCR或全基因组扩增来分析所分离的靶核酸。
在另外的实施方案中,本发明提供了一种分析来自宫颈内样品的胎儿核酸的方法,所述方法包括从所述宫颈内样品中分离胎儿细胞;在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述胎儿细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核;洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸;裂解所述细胞核以释放所述胎儿核酸;并且分离所述胎儿核酸。在一方面,使用月经杯收集所述宫颈内样品。在另一方面,宫颈内样品包含母体细胞和胎儿细胞。在另外的方面,分离所述胎儿细胞包括使所述胎儿细胞与抗HLA抗体结合。在某些方面,所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。在一方面,所述细胞未固定或未结合至表面(即DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质)。在进一步的方面,所述蛋白质混合物包含优选消化细胞壁但不消化核被膜的蛋白酶。在某些方面,所述蛋白质混合物包含胃蛋白酶,并且优选地不包含DNA酶。在一方面,裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。在某些方面,所述裂解缓冲液是酶促或非酶促裂解缓冲液。在某些方面,所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。在另一方面,所释放的胎儿核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。在另外的方面,分离所述胎儿核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合基质洗脱所述核酸。在某些方面,所述胎儿核酸的非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。在进一步的方面,通过DNA测序、PCR或全基因组扩增来分析所分离的胎儿核酸。在一方面,分析所述胎儿核酸包括鉴定遗传异常或基于基因的疾病;基因突变;或染色体异常。在另外的方面,分析所述胎儿核酸包括鉴定由遗传异常、基因突变或染色体异常引起的疾病或病症,所述疾病或病症是软骨发育不全、唐氏综合征、21三体、18三体、13三体、特纳综合征、镰状细胞疾病、囊性纤维化、脆性XD综合征、肌营养不良、泰-萨二氏病、脊柱裂、无脑畸形、地中海贫血、多囊性肾病、血友病A、亨廷顿病或先天性肾上腺增生症。
在进一步的实施方案中,本发明提供了一种用于收集宫颈内样品的试剂盒,所述试剂盒包括可折叠的月经杯;储存容器;以及运输介质。在一方面,将所述月经杯插入阴道腔中。在另一方面,将所述月经杯插入一段时间并在允许样品收集的条件下插入例如约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、少于一小时、1-2小时、1-5小时、1-10小时、1-20或更多小时。在另外的方面,所述运输介质包含至少一种细胞保存化学品。在进一步的方面,所述保存化学品是甘油、血清、二甲亚砜、甲醇、乙酸、细胞培养基、干燥剂或其组合。
附图说明
图1A-1D示出了BAF图,指示细胞核纯化改善了胎儿DNA质量。BAF频率(B等位基因频率)图示出了高度可变单核苷酸多态性的基因型的比较(在有或没有细胞核分离的情况下,胎儿细胞与胎儿胎盘,胎儿细胞与母体)。由于母亲与胎儿之间的遗传关系,在干净的DNA分离物中,大约有50%的基因型与母亲共享,如图1A所展示。胎盘与从宫颈内样本中分离的胎儿滋养层细胞相似,因此基因型应是相似的(图1B)。如果胎儿样品被母体或其他(例如父本)DNA污染,BAF将以剂量依赖性方式向母体(或例如父本)遗传谱转移。如果污染太高,胎儿DNA与母体基因型就无法区分(图1C)。结果是,胎儿样品将显得与胎盘DNA标记不同(图1D)。
具体实施方式
本发明基于开创性的发现,即可以从怀孕受试者的宫颈内样品中分离胎儿细胞。本发明还包括从含有靶核酸和非靶核酸的宫颈内样品中分离靶核酸(即胎儿核酸)并且随后对靶核酸进行分析。
在描述本发明的组合物和方法之前,应理解本发明不限于所述的特定组合物、方法和实验条件,因为这些组合物、方法和条件可以变化。还应理解,本文所用术语仅用于描述特定实施方案的目的,并非意在限制,因为本发明的范围将仅由所附权利要求限定。
除非上下文另有明确说明,否则如在本说明书及所附权利要求中所使用的,单数形式“一种/一个”(“a”、“an”)和“所述”包括复数指示物。因此,例如,对“方法”的引用包括本文描述的类型的一种或多种方法和/或步骤,这对于本领域技术人员而言在阅读本公开文本等之后将变得清楚。
当在数字标号或范围之前使用(例如,以定义长度或压力)时,术语“约”或“大约”指示可以相差(+)或(-)5%、1%或0.1%的近似值。本文提供的所有数值范围均包括所陈述的起始和终止数值。术语“基本上”指示大部分(即,大于50%)或本质上所有的装置、物质或组合物。
本说明书中所提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文中,并入程度如同明确且单独地指示每个单独出版物、专利或专利申请通过引用并入一样。
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员一般所理解的相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中,但是应当理解,修改和变型被涵盖在本公开文本的精神和范围内。现在描述优选的方法和材料。
本文描述了使用采用固体基质的细胞核分离与分离靶核酸的组合从样品中去除非靶核酸(即母体DNA)污染的方法和试剂盒。使用本文描述的方法,靶核酸(胎儿DNA)的回收率>80%、>85%、>90%、>95%、>96%、>97%或>98%或>99%。本文所述的方法和试剂盒实现了快速DNA分离,适用于在细胞数低至1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、250-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞和2500-5000个细胞的情况下的商业化高通量自动化过程。本文所述的方法和试剂盒通过提供对非靶DNA的高效去除,实现了可靠的DNA分离,以用于测序、PCR以及全基因组扩增。
在一个实施方案中,本发明提供了一种从细胞样品中分离靶核酸的方法,所述方法包括在DNA结合膜或DNA结合基质上将来自所述样品的细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育,以释出或释放细胞核;洗涤所述细胞以去除非靶核酸;裂解所述细胞核以释放核酸;并且分离所述靶核酸。在一方面,所述样品包含非靶核酸、母体细胞和/或胎儿细胞。
生物样品可以被游离的浮动核酸污染,所述游离的浮动核酸可以影响专注于样品中细胞的特定亚群的下游应用的成功。高效去除污染性DNA(即非靶DNA)对于获得受此类污染影响的测定的高质量读出是至关重要的。本文所述的方法通过使用酶或其他相当的手段(低渗溶液)将细胞移出和细胞核分离相结合,以将所有污染物带入溶液中。通过在非结合条件下在DNA结合基质上添加细胞核和污染物来简单地纯化细胞核。将污染物通过柱洗涤,而细胞核不会通过柱。pH的简单改变或离液高盐溶液的使用将使细胞核裂解,释放DNA,并使其高效地结合至任何DNA结合基质。这可以通过酶促消化步骤来支持。可以使用有机溶剂(乙醇和其他)从结合的DNA中高效去除盐和蛋白质。然后可以使用与下游应用相容的所选择的任何常用洗脱缓冲液(例如H2O,TRIS-HCL),简单地从柱洗脱DNA。在DNA分离过程期间,细胞未固定或未结合至表面(即DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质)。
如本文所用,术语“受试者”是指对其执行受试者方法的任何个体或患者。通常,受试者是人,但如本领域技术人员将理解的,受试者可以是动物。因此,受试者的定义内包括其他动物,所述其他动物包括脊椎动物,例如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠以及豚鼠)、猫、狗、兔、农场动物(包括牛、马、山羊、绵羊、猪、鸡等),以及灵长类动物(包括猴子、黑猩猩、猩猩以及大猩猩)。在一方面,受试者是女性。在另一方面,受试者是怀孕的。怀孕的受试者可能妊娠至少约5周、6周、7,周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周、15周、16周、17周、18周、19周、20周、25周、30周、35周或40周。
在整个公开文本中,术语“核酸”和“核酸分子”可互换使用。所述术语是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸聚合物(RNA)、RNA/DNA杂合体和聚酰胺核酸(PNA),并且除非另有限制,否则将涵盖可以按与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的已知天然核苷酸类似物。
如本文所用,术语“靶核酸”是指基于其来源细胞提取的目的核酸。在一方面,靶核酸是胎儿核酸。
如本文所用,术语“非靶核酸”是指存在于生物样品中的非期望的背景核酸。在一方面,非靶核酸来自宿主或宿主细胞。在另一方面,非靶核酸源自母体、病毒或微生物,或者是无细胞DNA。在一方面,用于释出细胞核的蛋白质混合物包括胃蛋白酶。在另一方面,蛋白质混合物不包含DNA酶。例如,将细胞在pH 7.5缓冲液(例如PBS或其他)中孵育,并用例如1NHCl酸化至例如0.04N的终浓度或确保胃蛋白酶活性的其他终浓度。
如果选择的采样条件不允许离子自由流入和流出细胞(例如活细胞),尽管不太期望,但可以使用低渗溶液从其他细胞物质中释出细胞核。可以使用低渗示例:10mM HEPES(pH 7.9,具有1.5mM MgCl2和10mM KCl)和或任何其他缓冲液,其使细胞核释放到溶液中。在某些情况下,使用等渗缓冲液可能是期望的,例如10mM Tris HCl(pH 7.5,具有2mMMgCl2、3mM CaCl2、0.3M蔗糖)。
在进一步的方面,将细胞核用缓冲液洗涤或孵育,导致所述缓冲液不裂解细胞核,并允许在该过程中去除其他生物材料。例如,膜或基质可用于截留细胞核,而洗涤缓冲液(例如PBS pH7.5)去除其他生物材料。不太期望但对于核被膜蛋白具有特异性的抗体可用于从洗涤缓冲液中免疫耗竭细胞核。例如,抗核纤层蛋白A抗体可以与固相偶联,使得能够从复合溶液中分离细胞核。
然后用蛋白酶(例如蛋白酶K或胰蛋白酶)和缓冲液(例如裂解缓冲液(例如PBS pH7.5)或任何其他允许细胞核裂解和随后DNA分离的缓冲液)裂解细胞核。在另外的方面,裂解后释放的核酸结合至膜或基质。在一方面,通过从DNA结合膜或DNA结合基质洗脱来分离核酸。在某些方面,裂解缓冲液是非酶促的。
本文所述的方法涉及从诸如以下的生物样品提取核酸:全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如支气管肺泡、胃、腹膜、导管、耳、关节内窥镜的)、活检样品、尿液、粪便、痰液、唾液、鼻粘液、淋巴液、胆汁、眼泪、汗液、母乳、乳房液、胚胎细胞、胎儿细胞或宫颈内样品。如本文所用,术语“宫颈内样品”涵盖从宫颈内管收集的细胞。在一方面,宫颈内样品来自怀孕的受试者。在另一方面,宫颈内样品包含非靶核酸、母体细胞和/或胎儿细胞。
本文所述的细胞核分离方法包括:分离细胞群;用消化混合物孵育所述细胞群,以使所述消化混合物去除胎儿细胞核以外的所有细胞组分并将外来DNA释放到溶液中;在非DNA结合条件下将所得的消化物施加于基质,使得细胞核将无法穿过所述基质;将洗涤缓冲液施加于所述基质,以使外来DNA和其他细胞组分穿过所述基质;将细胞核裂解和DNA结合缓冲液施加于所述基质,以使所述胎儿细胞核裂解,所述基质处于DNA结合状态,并且胎儿DNA结合至基质;用洗涤缓冲液洗涤所述基质以去除不需要的化学物质和蛋白质;并且使用缓冲液洗脱所述胎儿DNA。可以使用月经杯分离或收集细胞。对于本发明,分离的细胞在靶DNA即胎儿DNA的分离过程中未固定或未结合到表面。所述表面可以是DNA结合性或非DNA结合性的膜或基质。
如本文所用,术语“提取”是指将核酸从包含其他核酸的生物或非生物样品中部分或完全分开和分离。如本文所用,术语“选择性的”和“选择性地”是指基于分子大小,从包括或为核酸分子种类混合物的组合中提取特定种类的核酸分子的能力。
从生物材料中提取核酸需要细胞裂解,使细胞核酸酶失活以及从细胞碎片中分离所需核酸。常见的裂解程序包括机械破坏(例如研磨、低渗裂解)、化学处理(例如去污剂裂解、离液剂、硫醇还原)和酶促消化(例如蛋白酶K)。可以首先在缓冲液例如裂解缓冲液、离液剂(例如盐)以及蛋白酶(proteinase或protease)的存在下裂解生物样品。细胞膜破坏和细胞内核酸酶的失活可以结合在一起。例如,单一溶液可包含去污剂以溶解细胞膜,并包含强离液盐以使细胞内酶失活。细胞裂解和核酸酶失活后,可通过过滤或沉淀容易地去除细胞碎片。
所述方法在不使用DNA酶的情况下,使用缓冲液或酶在惰性网格或基质上从溶液中的细胞释出细胞核。例如,将1至10,000个靶细胞暴露于酶或低渗溶液中,导致细胞核释放。可在将酶或低渗溶液添加到基质之前或当细胞在基质上时,将酶或低渗溶液施加于细胞。在一些实施方案中,所述基质被配置为能够结合DNA(例如二氧化硅基质)。酶应优选消化细胞壁而不是核被膜。这种酶的例子是胃蛋白酶。在用磷酸盐缓冲盐水或者不诱导DNA与基质亲和力或可裂解靶细胞核的其他缓冲液洗涤数次后。
例如,在某些化学条件下,DNA可以结合至各种基质,例如二氧化硅。生理缓冲液(PBS,TRIS)不诱导DNA与基质的结合,也不裂解细胞核,并可使不需要的DNA高效地通过柱。这些缓冲液中的一些用于从基质洗脱结合的DNA,如下所示。相比之下,例如,充当离液剂的盐酸胍(GuHCl)导致细胞核裂解、DNA释放以及二氧化硅基质活化,从而紧密结合DNA分子。用例如高盐浓度或乙醇洗涤不会破坏结合,并且可用于去除细胞物质和盐。然后可以在水缓冲液、TE缓冲液、水以及其他将基质的结合能力逆转为非DNA结合状态从而导致DNA洗脱的溶液中洗脱出干净的DNA。
将不超过结合基质体积的裂解缓冲液(例如,包括Tris-HCl、EDTA、Triton X-100、NaCl、KCl等)与离液盐或任何其他使得DNA基质结合能够用于纯化目的的化学品的组合添加到基质中,导致细胞核裂解及其DNA释放以及结合至基质的DNA的活化。可以使用基于有机溶剂的洗涤缓冲液(例如,乙酸、丙酮、乙腈、苯、1-丁醇、2-丁醇、2-丁酮、叔丁醇、四氯化碳、氯苯、氯仿、环己烷、1,2-二氯乙烷、二乙二醇、乙醚、二甘醇二甲醚、DMA、DMF、DMSO、1,4-二噁烷、乙醇、乙酸乙酯、乙二醇、甘油、庚烷、HMPA、HMPT、己烷、甲醇、MTBE、二氯甲烷、NMP、硝基甲烷、戊烷、石油醚、1-丙醇、2-丙醇、吡啶、THF、甲苯、三乙胺、水、重水、邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯等)洗涤DNA结合基质以去除蛋白质污染物。裂解后,并在膜干燥后,在非结合溶剂条件下(例如Tris EDTA或水)从基质洗脱DNA。裂解缓冲液可以是酶促或非酶促裂解缓冲液。
所述方法可以包括添加一个或多个洗涤步骤以从固体支持物-靶核酸复合物或周围溶液中去除非核酸分子,例如盐。然后用基于乙醇的洗涤去除非核酸分子,并在低盐或无盐条件下(TE缓冲液或水)以小体积洗脱靶核酸,无需进一步浓缩即可准备好以便立即使用。在另一个实施方案中,通过引入载体例如tRNA、糖原、聚ARNA、蓝葡聚糖、线性聚丙烯酰胺(LPA)或增加核酸回收的任何材料来改善提取。可以将载体添加至第二结合溶液或洗涤缓冲液。
本文描述的方法可以与适用于核酸提取、分离或纯化的任何已知技术结合使用,所述已知技术包括但不限于氯化铯梯度、梯度、蔗糖梯度、葡萄糖梯度、离心方案、煮沸、Microcon 100过滤器、Chemagen病毒DNA/RNA1k试剂盒、Qiagen纯化系统、Qiagen MinElute试剂盒、Hi Speed Plasmid Maxi试剂盒、OlAfilter质粒试剂盒、Promega DNA纯化系统、基于MangeSil顺磁性颗粒的系统、Wizard SV技术、Wizard基因组DNA纯化试剂盒、Amersham纯化系统、Invitrogen Life Technologies纯化系统、CONCERT纯化系统以及Mo BioLaboratories纯化系统。
在一方面,DNA结合膜或DNA结合基质是在低pH和高盐下结合DNA分子的二氧化硅或其他基质材料。通常,将离子强度和pH降低为高于7.0会导致DNA洗脱。优选基质孔径<2微米,以确保将细胞核截留在基质中。DNA结合膜或DNA结合基质可以指具有化学和物理特性从而能够吸附DNA的任何表面。例如,可以通过pH变化(这可以使所述表面或多或少带电)来调节带电表面的静电荷。使用适当的缓冲液的情况下,当pH和盐浓度最佳时,可以调节表面的静电荷,这可以减少带负电荷的DNA与带负电荷的表面之间的静电排斥或增加带负电荷的DNA与带正电荷的表面之间的静电吸引;这些有利于DNA吸附到表面。能够吸收带负电荷的DNA的任何材料都可以用于此目的。二氧化硅是可用于形成DNA结合基质的合适材料的非限制性例子。在替代实施方案中可以使用非DNA结合膜来保持细胞核,其中如果基质孔径太大,则可以捕获细胞核。
在分离靶核酸后,靶核酸(即胎儿DNA)与非靶核酸的最终相对百分比为至少约5%-6%胎儿DNA、约7%-8%胎儿DNA、约9%-10%胎儿DNA、约11%-12%胎儿DNA、约13%-14%胎儿DNA、约15%-16%胎儿DNA、约16%-17%胎儿DNA、约17%-18%胎儿DNA、约18%-19%胎儿DNA、约19%-20%胎儿DNA、约20%-21%胎儿DNA、约21%-22%胎儿DNA、约22%-23%胎儿DNA、约23%-24%胎儿DNA、约24%-25%胎儿DNA、约25%-35%胎儿DNA、约35%-45%胎儿DNA、约45%-55%胎儿DNA、约55%-65%胎儿DNA、约65%-75%胎儿DNA、约75%-85%胎儿DNA、约85%-90%胎儿DNA、约90%-91%胎儿DNA、约91%-92%胎儿DNA、约92%-93%胎儿DNA、约93%-94%胎儿DNA、约94%-95%胎儿DNA、约95%-96%胎儿DNA、约96%-97%胎儿DNA、约97%-98%胎儿DNA、约98%-99%胎儿DNA或约99%-99.7%胎儿DNA。
如果纯化后的DNA定量与预期的DNA量不匹配,则可认为纯化过程中DNA有损失。为了减少这种损失,可以按以经验确定的量使用人工DNA或RNA(取决于下游应用),以增加靶DNA与基质的结合及靶DNA的回收。
在另一方面,非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。在进一步的方面,通过DNA测序、PCR或全基因组扩增来分析所分离的靶核酸。
可使用免疫耗竭技术从宫颈管分离胎儿细胞。通常,胎儿细胞的存在比率为2000个母体细胞中1个至10,000个母体细胞中1个。使用胎儿细胞特异性抗体,通过弃去母体细胞使胎儿细胞富集至接近纯。尽管对于一名男婴,FISH分析显示胎儿细胞几乎是纯净的,但胎儿DNA的检测分析可被大量非靶标(例如,样品中存在的母体DNA)掩盖,指示非靶DNA存在于细胞外和/或胎儿细胞中。
为了允许精确的DNA分析,需要高质量的DNA样品。靶DNA的量和污染的量与分析的成功成正比,所述分析例如为在进行和不进行全基因组扩增的情况下的测序和PCR。靶细胞的较少细胞数需要非靶DNA去除和靶DNA回收的增加的一致性。在样品中具有少至1-25、25-50、50-100、100-250、250-500、500-750、750-1000、1000-2000或2000-5000个靶细胞时,使用本文所述的试剂盒和方法后,结果示出高纯度(例如,>50%、>80%、>85%、>90%、>85%、>98%)。
有多种可用于产前诊断的无创和有创技术,包括超声检查、羊膜穿刺术、绒毛膜绒毛采样(CVS)、母体血液中的胎儿血细胞、母体血清甲胎蛋白、母体血清β-HCG以及母体血清雌三醇。但是,无创技术的特异性较低,而具有高特异性和高灵敏度的技术是高度有创的。此外,为发挥最大的效用,大多数技术只能在怀孕期间的特定时间段期间应用。
为在母体血浆中检测胎儿DNA而开发的第一个标记物是Y染色体,该染色体存在于男性胎儿中。Y染色体标记物的鲁棒性已被本领域的许多工作人员再现。这种途径构成了确定胎儿性别的高度准确的方法,这可用于性别相关性疾病的产前检查。母体血浆DNA分析还可用于RhD阴性孕妇的胎儿RhD血型状况的无创产前确定。最近,母体血浆DNA分析已显示可用于胎儿重型β地中海贫血的无创产前排除。类似的途径也已用于HbE基因的产前检测。
在母体血浆中的胎儿DNA的其他遗传应用包括软骨发育不全、强直性肌营养不良、囊性纤维化、亨廷顿病以及先天性肾上腺增生症的检测。预期此类应用的范围将在未来几年内增加。
对于本文所述的方法,受试者是怀孕的,并且评价受试者或其胎儿的疾病或生理状况的方法有助于对受试者或其胎儿的检测、监测、预后或治疗。更具体地,本发明的特征在于通过检测从母亲获得的生物样品中的胎儿DNA来检测胎儿的异常的方法。根据本发明的方法提供用于通过将胎儿DNA与母体DNA区分来检测母体样品中的胎儿DNA。利用此类方法,可以鉴定出预测遗传异常或基于遗传的疾病的胎儿DNA,从而提供了产前诊断的方法。这些方法可应用于任何和所有妊娠相关病症,对此核酸变化、突变或其他特征(例如,甲基化状态)与疾病状态相关。例如,序列分析可用于检测单核苷酸多态性(SNP)和DNA突变(例如插入和/或缺失)。可以诊断的示例性疾病包括例如先兆子痫、早产、妊娠剧吐、异位妊娠、胎儿染色体非整倍性(例如18三体、21三体或13三体)和子宫内生长迟缓。
本文所述的方法和试剂盒允许分析胎儿遗传性状,包括染色体畸变(例如,与唐氏综合征相关的非整倍性或染色体畸变)或遗传性孟德尔遗传障碍以及对应地与之相关的遗传标记物(例如,单基因病,例如囊性纤维化或血红蛋白病)中涉及的那些胎儿遗传性状。
在另外的实施方案中,本发明提供了一种分析来自宫颈内样品的胎儿核酸的方法,所述方法包括从所述宫颈内样品中分离胎儿细胞;在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述胎儿细胞与含有酶的蛋白质混合物一起孵育以释出或释放细胞核;洗涤所述胎儿细胞核以去除非靶核酸;裂解所述细胞核以释放所述胎儿核酸;并且分离所述胎儿核酸。在一方面,使用月经杯收集所述宫颈内样品。在另外的方面,宫颈内样品包含非靶核酸、母体细胞和/或胎儿细胞。在进一步的方面,蛋白质混合物包含优先消化细胞壁而不是核被膜的蛋白酶。在某些方面,使用酶促或非酶促裂解缓冲液裂解细胞核。裂解缓冲液可包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。
通常,胎儿细胞的存在比率为2000个母体细胞中1个至10,000个母体细胞中1个。使用胎儿细胞特异性抗体,通过弃去母体细胞使胎儿细胞富集至接近纯。在本文所述的方法中,通过使胎儿细胞与抗HLA-G结合来分离胎儿细胞。HLA-G组织相容性抗原I类G也称为人白细胞抗原G(HLA-G),是一种在人中由HLA-G基因编码的蛋白质。HLA-G属于HLA非经典I类重链旁系同源物。这种I类分子是由重链和轻链(β-2微球蛋白)组成的异二聚体。HLA-G由胎儿细胞表达。在一方面,使用抗HLA-G抗体包被的纳米颗粒分离胎儿细胞。在一些实施方案中,通过流式细胞术、免疫染色、显微镜检查、聚合酶链反应、测序或本领域技术人员已知的任何其他方法分析胎儿细胞。
在另外的方面,所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。在一方面,用于释出细胞核的蛋白质混合物包含至少一种酶,其优先消化细胞壁而不是核被膜。这种酶的例子是胃蛋白酶。在进一步的方面,所述蛋白质混合物优选不包含DNA酶。在一些方面,通过将细胞与裂解缓冲液一起孵育来裂解细胞核。所述裂解缓冲液可以是酶促的或非酶促的。裂解缓冲液可包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。在另一方面,所释放的胎儿核酸结合至膜或基质。在进一步的方面,通过从膜上洗脱核酸来分离所述胎儿核酸。在一方面,非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。
如本文所用,术语“妊娠相关障碍”是指可影响孕妇、妇女所怀的胎儿或妇女和胎儿二者的任何病症或疾病。这种病症或疾病可在有限的时间段期间(例如在妊娠或分娩期间)表现出其症状,或者可在胎儿出生后持续胎儿的一生。妊娠相关障碍的一些例子包括异位妊娠、先兆子痫、早产以及胎儿染色体异常(例如13三体、18三体或21三体)。
术语“染色体异常”是指受试者染色体的结构与正常同源染色体之间的偏差。术语“正常”是指在特定物种的健康个体中发现的主要核型或带型。染色体异常可以是数字异常或结构异常,并且包括但不限于非整倍性、多倍性、倒位、三体、单体、重复、缺失、染色体的一部分缺失、添加、染色体的一部分添加、插入、染色体的片段、染色体的区域、染色体重排以及易位。染色体异常可与病理状况的存在或发展成病理状况的倾向相关。
由遗传异常、基因突变以及染色体异常引起的胎儿疾病或病症的例子包括软骨发育不全、唐氏综合征、21三体、18三体、13三体、特纳综合征、镰状细胞疾病、囊性纤维化、脆性XD综合征、肌营养不良(例如杜氏肌营养不良)、泰-萨二氏病、神经管缺陷(例如脊柱裂和无脑畸形)、地中海贫血、多囊性肾病、血友病A、亨廷顿病以及先天性肾上腺增生症。
本文描述了用于收集宫颈内样品的试剂盒和方法。本文所述的方法可以使用诸如月经杯之类的可折叠杯、储存容器以及运输溶液,以使得能够在妊娠5至20周之间对源自宫颈管的宫颈细胞安全地“在家采样”。本文所述的试剂盒可由医疗保健专业人员以及在家中的个人安全地使用。
如本文所述的月经杯是漏斗形的可重复使用的装置,其被妇女放置在宫颈管的正下方。所述杯可以被配置成各种尺寸和形状,以确保舒适性和最大程度的细胞收集。确认妊娠后将所述杯定位在宫颈管的开口下方。还可以在确认妊娠之前将所述杯定位在宫颈管的开口下方,以例如收集可用于识别或确认妊娠的细胞或样品。将所述杯插入宫颈管的开口处,直到所述杯收集了至少一个胎儿细胞。例如,所述杯可以定位在宫颈管的开口处长达一小时、五小时、十小时、十二小时、十五小时、二十小时或介于其间的任何范围或子范围。与其他方法(例如宫颈抹片检查)相比,所述杯的优势在于它是一种用以收集细胞的无创技术。
小心地取出杯并将其放置到储存容器中,所述储存容器中填充有或将填充有运输介质以进行运送和随后的分析。例如,运输介质可以包括一种或多种细胞保存化学品(例如,甘油、血清、二甲亚砜、甲醇、乙酸、细胞培养基、干燥剂等)。
在进一步的实施方案中,本发明提供了一种用于收集宫颈内样品的试剂盒,所述试剂盒包括可折叠的月经杯;储存容器;以及运输介质。在一方面,将所述月经杯插入阴道腔中。在另一方面,将所述月经杯插入一段时间并在允许样品收集的条件下插入例如约10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、少于一小时、1-2小时、1-5小时、1-10小时、1-20或更多小时。在进一步的方面,所述运输介质包含至少一种细胞保存化学品。在某些方面,所述保存化学品是甘油、血清、二甲亚砜、甲醇、乙酸、细胞培养基和/或干燥剂。
提供以下实施例以进一步说明本发明的实施方案,但并非旨在限制本发明的范围。尽管它们是可能使用的那些的典型,但可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术
实施例
实施例1
从混合样品中分离靶DNA
在培养基中,在具有和不具有2至10,000倍的男性标准DNA的情况下,将1-2,000个女性细胞孵育一小时。添加十倍的固定剂以模拟DNA粘附至靶细胞。将细胞收获,计数,并暴露于释出细胞核的蛋白质混合物。将混合物等分到基质(例如,柱内的基质)上。使用对照细胞,其中不进行细胞核释放程序。
在微量离心机中以8000xg将柱旋转十秒钟。将五百微升磷酸盐缓冲盐水添加至基质两次,以洗去污染性DNA。添加裂解结合缓冲液以启动细胞核DNA释放和基质结合。低于五十个细胞的样品接受掺入裂解缓冲液中的载体RNA,以确保高效结合
用基于乙醇的溶液洗涤DNA,然后干燥基质,随后使用十微升TRIS EDTApH 8缓冲液洗脱DNA。
使用定量PCR针对RNAseH(总拷贝数)和性别决定区域Y(SRY)对DNA进行定量。结果显示>90%的非靶DNA被去除。
实施例2
宫颈样品收集
在妊娠十四周时,志愿者使用月经杯持续十二小时过夜,提供了总计2500万个细胞。通过对胎儿HLAG和bHCG进行免疫染色,鉴定出约250个胎儿细胞。
实施例3
TRIC-宫颈内样本中的胎儿细胞分离方案
具有结合的抗HLA-G的纳米颗粒的制备。在该程序前一天,将与山羊抗小鼠IgG(Clemente and Assoc.)偶联的磁性纳米颗粒与小鼠单克隆抗HLA-G抗体(BD)一起孵育。合并100μL无菌PBS、10μL抗体(0.5mg/mL)和10μL纳米颗粒,并在4℃的冷室中在摇床上在伴随混合下孵育过夜。第二天,通过首先添加900μL无菌PBS,然后磁化颗粒10分钟,之后去除所有液体来去除未结合的抗体。将200μL Pipetman的吸头抵靠在试管的相对壁上,并且在将吸头移至试管底部时缓慢抽出液体。将颗粒重悬浮于1mL无菌PBS中,并再洗涤2次,添加100μL以用于最终的重悬浮。
初始宫颈内样品放到10mL Cytolyt溶液中。使用塑料刮铲,将漂浮在溶液中的细胞团破碎,并且从细胞刷(如果其留在小瓶中)上刮下任何可见的物质。(任选的:如果有问题,可在伴随混合下添加500μL未稀释的乙酸以分解多余的粘液。)将10μL细胞悬浮液等分到血细胞计数器上并对细胞计数,并对起始材料中的总细胞计数。
将100μL样品取出,并使用Shandon细胞离心涂片机旋转到显微镜载玻片上。使用Shandon EZ Megafunnel一次性样品室。将初始细胞样品用抗HLA-G小鼠单克隆抗体(BD#557577)和DAB染色。用苏木精对细胞进行染色,并计数以获得HLA-G阳性细胞数的估计值(载玻片上的总数x 20=样品中的总数)。可以计算出滋养层细胞/总细胞的比率(载玻片上的总HLA-G阳性细胞数x 20/从血细胞计数器计数确定的总细胞数)。所述比率应为约1:2000。
将细胞以1200rpm(400x g)沉淀5分钟(去除所有固定剂)。将细胞沉淀重悬浮于12-13mL无菌PBS中,最终体积为14mL。任选地,使样品通过插入15mL离心管中的250μm组织滤器,以去除大块粘液和细胞团。
通过离心并将细胞重悬浮于14mL无菌PBS中来将宫颈样品洗涤2次。
将样品重悬浮于1.4mL无菌PBS中。将整个100μL经抗HLA-G包被的磁性纳米颗粒(在#1中制备)添加到样品中以分离滋养层细胞,并将样品在4℃的冷室中在摇床上孵育过夜。
过夜孵育后,将滋养层细胞在磁体(DynaMag-Spin磁体;Life Technologies)上在4℃分离10分钟。通过以下方式去除未结合的母体细胞:抵靠试管的相对壁吸移,并在将吸头移至试管底部时缓慢抽出液体。使用磁体(使纳米颗粒磁化10分钟以用于每次洗涤,之后吸移)将滋养层细胞在4℃用1mL无菌PBS洗涤3次。最后去除未结合的细胞后,将捕获的细胞在4℃重悬浮于100μL无菌PBS中。
取出分离的细胞悬浮液的小等分试样(10μL),并对分离的胎儿细胞计数以计算回收的胎儿细胞的总数。使用血细胞计数器对来自第一次洗涤的母体细胞计数。
通过用或不用固定在珠粒上的DNA酶处理滋养层细胞来制备用于DNA分离的细胞。
制备载玻片用于纯度分析、蛋白质标记物染色和FISH分析。用细胞离心涂片机将大约50-100个细胞旋转到每个载玻片上,然后加热载玻片1分钟。***可替代地,将40-100+个细胞以小滴(约10-40μL)放置在载玻片中心,在载玻片上加热至更热到45℃,保持5-10分钟,直到干燥。
通过用抗βhCG以免疫荧光方式标记细胞来确定细胞的纯度。确定荧光βhCG阳性细胞和总细胞(DAPI标记的)的数量,并发现βhCG阳性细胞%大于85%
实施例4
胎儿DNA分离
制备20X胃蛋白酶(在50ml 0.01N HCl中0.22g胃蛋白酶)。将100μl的20X胃蛋白酶添加至100μl TRIC细胞(如上所述分离),并在Eppendorf ThermoMixer C(500rpm)上在37℃孵育11分钟。
使细胞通过旋转柱(DNeasy blood&tissue),以600g旋转30秒,并通过以600g旋转30秒用500μl的PBS洗涤5次。
将200ul PBS、20ul蛋白酶K、200ul AL裂解缓冲液(DNeasy blood&tissue)添加至柱,并将柱在56℃在Eppendorf ThermoMixer C(500rpm)上放置10分钟。
将200ul ETOH添加至上述混合物[PBS+蛋白酶K+AL缓冲液],并通过上下吸移进行混合,然后以6000g旋转1分钟。
将DNeasy Mini旋转柱放置在新的2mL收集管中,添加500μL缓冲液AW1,并以6000xg(8000rpm)离心一分钟。弃去流通管和收集管。
将DNeasy Mini旋转柱放置在新的2mL收集管中,添加500μL缓冲液AW2,并以20,000x g(14,000rpm)离心3分钟以干燥DNeasy膜。弃去流通管和收集管。
重要的是干燥DNeasy旋转柱的膜,因为残留的乙醇可能干扰随后的反应。此离心步骤确保在随后的洗脱过程中不会携带任何残留的乙醇。
将DNeasy Mini旋转柱放置在干净的1.5或2mL微量离心管中,并将25μL缓冲液AE直接吸移到DNeasy膜上,并在室温下孵育一分钟,然后以6000xg(8000rpm)离心一分钟以洗脱。通过从第一次洗脱到膜中起添加25μL缓冲液AE来重复孵育和离心洗脱步骤。在-20℃储存。全纯度(获得的DNA的量)数据显示即使有污染(一些)您也拥有可以分析的DNA(因此序列数据可能有帮助但不确定是否关键)。我们投入应用中的数据越多越好。现在是时候尽可能多地进行添加。
实施例5
从胎儿细胞分离的DNA的分析
从胎儿细胞中分离DNA,获得了被外来/母体DNA污染的宫颈内样本。从宫颈内样本(样品A-D)中分离出滋养层细胞(260-380个细胞),其纯度通过免疫组织化学测定为大于90%(hCG阳性)。分离胎儿细胞,并处理以在进行/不进行细胞核分离的情况下提取DNA。使用与Illumina Forenseq技术相似的方法,通过下一代测序分离并分析DNA。高度可变的身份SNP被用于使用参考DNA从母亲和胎儿创建特定的遗传标记。数据用于确定从宫颈内样本中分离的胎儿细胞中的胎儿DNA和母体DNA含量。在不进行细胞核分离的情况下,胎儿部分导致在样品的此子集中,低于11.5%的低胎儿分数和88.5%-90.5%的母体污染(表1)。细胞核分离可将母体污染降低到2%-10%,并且实现高胎儿分数和90%-98%纯度(表1)。
表1
实施例6
胎儿DNA样品中母体DNA污染的分析
如先前所述,在从被外来/母体DNA污染的宫颈内样本获得的胎儿细胞中进行细胞核分离后进行DNA分离。最初通过免疫耗竭从宫颈内样本(样品1-30)中分离出滋养层细胞。使用与Illumina Forenseq技术相似的方法,通过下一代测序分离并分析DNA。高度可变的身份SNP被用于使用参考DNA从母亲和胎儿创建特定的遗传标记。数据用于确定从宫颈内样本中分离的胎儿细胞中的胎儿DNA和母体DNA含量。细胞核分离可将母体污染降低到0.5%-16.7%,并且实现高胎儿分数和83.3%-99.5%纯度(表2)。
表2
实施例7
在进行和不进行细胞核分离的情况下对胎儿DNA的分析
如先前所述,在从被外来/母体DNA污染的宫颈内样本获得的胎儿细胞中进行细胞核分离之前和之后进行胎儿DNA分离。DNA分离之前的细胞核分离改善了胎儿DNA质量(图1和表3)。与细胞核分离的相关性达到接近1(0.98)。在不进行细胞核分离的情况下,由于未能成功去除母体DNA,胎儿样品与母亲高度相关。
表3
细胞核分离后的DNA提取 | 进行细胞核分离 | 不进行细胞核分离 |
使用的细胞数量 | 190 | 190 |
与母体的亲缘得分(预期约0.5) | 0.49 | 0.98 |
与胎盘的亲缘得分(预期>0.9) | 0.98 | 0.47 |
尽管已经参考以上实施例描述了本发明,但是应理解,修改和变型被涵盖在本发明的精神和范围内。因此,本发明仅由所附权利要求限制。
Claims (39)
1.一种从细胞样品中分离靶核酸的方法,其包括:
a)在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述细胞与含有至少一种酶的蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核;
b)洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸;
c)裂解所述细胞核以释放所述靶核酸;并且
d)分离所述靶核酸。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述靶核酸是胎儿核酸。
3.根据权利要求1所述的方法,其中非靶核酸是母体核酸、病毒核酸、微生物核酸、无细胞DNA或其组合。
4.根据权利要求1所述的方法,其中所述细胞是人的。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述细胞是母体细胞和/或胎儿细胞。
6.根据权利要求1所述的方法,其中样品是宫颈内样品。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述宫颈内样品包含非靶核酸、母体细胞以及胎儿细胞。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述蛋白质混合物包含消化细胞壁的蛋白酶。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述蛋白酶是胃蛋白酶。
11.根据权利要求1所述的方法,其中在非DNA结合条件下将所述细胞与所述蛋白质混合物一起孵育。
12.根据权利要求1所述的方法,其中裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述裂解缓冲液可以是酶促的或非酶促的。
14.根据权利要求12所述的方法,其中所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。
15.根据权利要求1所述的方法,其中靶核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。
16.根据权利要求1所述的方法,其中分离所述靶核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合基质洗脱所述核酸。
17.根据权利要求1所述的方法,其中所分离的靶核酸的非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。
18.根据权利要求1所述的方法,其还包括通过DNA测序、PCR或全基因组扩增对所分离的靶核酸进行分析。
19.一种分析来自宫颈内样品的胎儿核酸的方法,其包括:
a)从所述宫颈内样品中分离胎儿细胞;
b)在DNA结合膜或DNA结合基质上将所述胎儿细胞与蛋白质混合物一起孵育以释出细胞核;
c)洗涤所述DNA结合膜或所述DNA结合基质以去除非靶核酸;
d)裂解所述细胞核以释放所述胎儿核酸;并且
e)分离所述胎儿核酸。
20.根据权利要求19所述的方法,其中使用月经杯收集所述宫颈内样品。
21.根据权利要求19所述的方法,其中所述宫颈内样品包含母体细胞和胎儿细胞。
22.根据权利要求19所述的方法,其中分离所述胎儿细胞包括使所述胎儿细胞与抗HLA抗体结合。
23.根据权利要求19所述的方法,其中所述样品包含约1-10个细胞、10-25个细胞、25-50个细胞、50-100个细胞、100-250个细胞、25-500个细胞、500-750个细胞、750-1000个细胞、1000-2500个细胞或2500-5000个细胞。
24.根据权利要求19所述的方法,其中所述蛋白质混合物包含消化细胞壁的蛋白酶。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述蛋白酶是胃蛋白酶。
26.根据权利要求19所述的方法,其中裂解所述细胞核包括将所述细胞与裂解缓冲液一起孵育。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述裂解缓冲液是酶促的或非酶促的。
28.根据权利要求26所述的方法,其中所述裂解缓冲液包含蛋白酶K和/或胰蛋白酶。
29.根据权利要求19所述的方法,其中所释放的胎儿核酸结合至所述DNA结合膜或所述DNA结合基质。
30.根据权利要求19所述的方法,其中分离所述胎儿核酸包括从所述DNA结合膜或所述DNA结合基质洗脱所述核酸。
31.根据权利要求19所述的方法,其中所述胎儿核酸的非靶核酸污染少于约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%或少于约50%。
32.根据权利要求19所述的方法,其还包括通过DNA测序、PCR或全基因组扩增对所分离的胎儿核酸进行分析。
33.根据权利要求19所述的方法,其中分析所述胎儿核酸包括鉴定遗传异常或基于基因的疾病;基因突变;或染色体异常。
34.根据权利要求33所述的方法,其中分析所述胎儿核酸包括鉴定由遗传异常、基因突变或染色体异常引起的疾病或病症,所述疾病或病症选自由以下组成的群组:软骨发育不全、唐氏综合征、21三体、18三体、13三体、特纳综合征、镰状细胞疾病、囊性纤维化、脆性XD综合征、肌营养不良、泰-萨二氏病、脊柱裂、无脑畸形、地中海贫血、多囊性肾病、血友病A、亨廷顿病或先天性肾上腺增生症。
35.一种用于收集宫颈内样品的试剂盒,其包括:
a)可折叠的月经杯;
b)储存容器;以及
c)运输介质。
36.根据权利要求35所述的试剂盒,其中将所述月经杯插入阴道腔中。
37.根据权利要求35所述的试剂盒,其中所述运输介质包含至少一种细胞保存化学品。
38.根据权利要求37所述的试剂盒,其中所述保存化学品选自由以下组成的群组:甘油、血清、二甲亚砜、甲醇、乙酸、细胞培养基、干燥剂或其组合。
39.根据权利要求1或19所述的方法,其中在核酸分离过程中,所述细胞未固定或未结合至表面。
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Citations (7)
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---|---|---|---|---|
WO2000040697A1 (en) * | 1999-01-06 | 2000-07-13 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for isolation of nucleic acid molecules |
CN1452665A (zh) * | 2000-07-10 | 2003-10-29 | 赛姆格有限公司 | 在母体样品中鉴定胎儿dna的诊断方法 |
EP2942394A1 (en) * | 2014-05-09 | 2015-11-11 | Molzym GmbH & Co. KG | New method for isolating microbial DNA |
US20160053301A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Clearfork Bioscience, Inc. | Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna |
US20160090588A1 (en) * | 2013-05-07 | 2016-03-31 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
US20160324506A1 (en) * | 2014-08-12 | 2016-11-10 | Nextgenjane, Inc. | System and method for monitoring health based on collected bodily fluid |
WO2017176985A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Wayne State University | Isolation and analysis of fetal dna from extravillous trophoblast cells retrieved from the endocervical canal |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0587951B1 (en) * | 1992-09-18 | 1997-12-17 | AMERSHAM INTERNATIONAL plc | Cell nuclei capture method and device used therefor |
DE69723297D1 (de) * | 1996-12-11 | 2003-08-07 | Amersham Plc Little Chalfont | Selektives verfahren zur lyse von zellen |
WO2007046108A2 (en) * | 2005-10-21 | 2007-04-26 | Monaliza Medical Ltd. | Methods and kits for analyzing genetic material of a fetus |
WO2008081451A2 (en) * | 2007-01-03 | 2008-07-10 | Monaliza Medical Ltd. | Methods and kits for analyzing genetic material of a fetus |
AU2010239131A1 (en) * | 2009-04-21 | 2011-11-17 | Genetic Technologies Limited | Methods for obtaining fetal genetic material |
CA2817990A1 (en) * | 2009-12-23 | 2011-06-30 | Genetic Technologies Limited | Methods of enriching and detecting fetal nucleic acids |
WO2013131021A1 (en) * | 2012-03-02 | 2013-09-06 | Sequenom Inc. | Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations |
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Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000040697A1 (en) * | 1999-01-06 | 2000-07-13 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for isolation of nucleic acid molecules |
CN1452665A (zh) * | 2000-07-10 | 2003-10-29 | 赛姆格有限公司 | 在母体样品中鉴定胎儿dna的诊断方法 |
US20160090588A1 (en) * | 2013-05-07 | 2016-03-31 | Micronics, Inc. | Device for preparation and analysis of nucleic acids |
EP2942394A1 (en) * | 2014-05-09 | 2015-11-11 | Molzym GmbH & Co. KG | New method for isolating microbial DNA |
US20160324506A1 (en) * | 2014-08-12 | 2016-11-10 | Nextgenjane, Inc. | System and method for monitoring health based on collected bodily fluid |
US20160053301A1 (en) * | 2014-08-22 | 2016-02-25 | Clearfork Bioscience, Inc. | Methods for quantitative genetic analysis of cell free dna |
WO2017176985A1 (en) * | 2016-04-06 | 2017-10-12 | Wayne State University | Isolation and analysis of fetal dna from extravillous trophoblast cells retrieved from the endocervical canal |
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