CN111850140A

CN111850140A - 一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用

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Publication number: CN111850140A
Application number: CN202010797583.0A
Authority: CN
Inventors: 白洋洋; 王新雨; 蓝贤勇; 潘传英; 陈宏�; 雷初朝; 黄永震; 朱海鲸; 董书伟; 屈雷
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-08-10
Also published as: CN111850140B

Abstract

本发明公开了一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用。以待测山羊全基因组DNA为模板，通过PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳，鉴定山羊PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472‑16491位InDel位点的基因型。根据PPP3CA基因InDel位点的不同基因型与陕北白绒山羊产仔数的关联分析结果，确定了PPP3CA基因InDel位点的基因型可作为提高山羊产仔数的DNA标记。本发明通过快速、精准的检测与山羊产仔数密切相关的InDel标记，可快速建立山羊优势遗传资源群体，从而加快山羊繁殖性状的标记辅助选择育种进程。

Description

一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与家畜育种领域，涉及基因插入/缺失多态性(InDel)的检测，特别涉及快速、精准的检测与山羊产仔数相关的PPP3CA基因InDel标记。

背景技术

动物育种技术主要包括以表型和表型值为基础的常规育种技术以及以DNA多态为基础的分子育种技术。作为分子育种技术体系的重要组成部分，标记辅助选择(marker-assisted selection，MAS)育种技术根据与遗传性状显著相关的DNA标记进行性状选择，通过在DNA水平上分析个体的遗传组成，实现对基因型的直接选择，提高育种目标的定向性，在早期选择、无损害性状评价和选择及提高回交育种效率等方面具有优越性。寻找重要功能基因、筛查重要基因遗传变异位点，并分析重要功能基因遗传变异位点与性状的相关性，是标记辅助选择技术应用的前提和关键。

插入/缺失多态性(insertion/deletion,InDel)是指DNA序列上核苷酸片段的插入或缺失而引起的DNA序列的改变，插入或缺失片段的长度在1-50bp之间。从DNA水平上对小片段核苷酸的差异进行InDel检测，利用InDel分析个体基因组，可以更好地解释个体的表型差异，在动物分子育种中具有重要意义。

随着比较基因组学的深入研究，InDel为理论研究和遗传育种应用提供了大量的遗传信息，其作为新一代的遗传学鉴定标记，兼具SNP的优点。InDel与SNP均是源于单突变事件，突变频率较低，相对比较稳定；在结构上属于二等位基因多态性，等位基因都固定且已知，能够通过很小的扩增子进行扩增(<50bp)。作为一种重要的遗传标记来源，InDel遍布于整个基因组，频率仅次于SNP，其中约三分之一位于已知的基因区域内，还有一些位于决定基因功能的关键性区域，如启动子区和外显子区。

2005年Schnabel等人结合SSR标记和InDel标记对控制奶牛产奶量进行了研究，并成功进行了精细定位。InDel的研究目前多集中在人类和各种农作物(如水稻和玉米等)的基因组研究中，对反刍家畜的功能性基因的InDel标记的挖掘与应用亟待深入。

随着社会对山羊产品的需求不断加强，在高产、优质和高效的山羊育种目标上，为了更早、更快的培育出地方山羊优良品种，需要在DNA水平上筛查和检测与山羊产仔数密切相关的DNA标记。PPP3CA是蛋白磷酸酶3催化亚基α编码基因。目前尚未见到山羊PPP3CA基因与产仔数标记辅助选择相关的DNA标记的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用，从而可以通过分子标记辅助选择加快山羊良种选育速度。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，包括以下步骤：

以待测山羊个体全基因组DNA为模板，以引物对P1为引物，通过PCR扩增包含PPP3CA基因20-bp插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)的片段；对PCR的扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定山羊个体在该插入/缺失多态性位点的基因型。

优选的，所述的引物对P1为：

上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；

下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。

优选的，所述PCR采用的扩增反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。

优选的，所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。

优选的，根据琼脂糖凝胶电泳结果，所述插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型(II)表现为179bp的一条带纹，插入/缺失基因型(ID)表现为179bp和159bp的两条带纹，缺失/缺失基因型表现为159bp的一条带纹(DD)。

一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，该试剂盒包括上述引物对P1。

上述山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型(ID)可以作为提高山羊产仔数的DNA标记(具体为InDel标记)。

本发明的有益效果体现在：

本发明通过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可以对山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)进行基因分型鉴定，根据对该插入/缺失多态性位点与陕北白绒山羊产仔数进行关联分析的结果，首次发现PPP3CA基因与山羊产仔数显著相关，并具有可提高山羊产仔数的DNA标记。本发明的检测方法简单、快速、低成本，可用于精准建立产仔数优异的山羊种群，从而加快山羊繁殖性状的标记辅助选择育种进程。

附图说明

图1为山羊PPP3CA基因PCR扩增(引物对P1)产物3.0％琼脂糖凝胶电泳的结果；其中：M为Marker I泳道，其他个别泳道出现的三条带表示存在非特异性扩增，但并不影响对基因型的识别。

图2为山羊PPP3CA基因PCR扩增产物测序图；其中：上半部分表示基因型为II，下半部分表示基因型为ID，黑色方框标出的部分表示20-bp缺失序列(NC_030813.1:g.16472-16491del ATCAGGATTGGCTATATACT)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。

本发明利用PCR及琼脂糖凝胶电泳的方法，对山羊PPP3CA基因16472-16491位(NC_030813.1)产生的插入/缺失多态性进行检测，并将其与山羊产仔数进行关联分析，确定了可以作为山羊分子育种中辅助选择的候选分子标记。

1.实验药品与试剂

1.1生化试剂与生物学试剂

①Taq DNA聚合酶(购自Fermantas，即MBI公司)；②蛋白酶K(购自华美生物工程公司)③Marker I(购自天根生化科技(北京)有限公司)。

1.2普通试剂

普通试剂从华美生物工程公司购买，为进口分装产品：柠檬酸、柠檬酸钠、葡萄糖、Tris、EDTA、NaCl、NaOH、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris饱和酚、氯仿、异戊醇、无水乙醇、醋酸钠、十二烷基磺酸钠(SDS)、溴化乙锭(EB)、溴酚蓝、二甲基苯氰FF、乙酸、蔗糖、硼酸、琼脂糖等。

1.3溶液与缓冲液

所有溶液与缓冲液均采用去离子超纯水配制。高压灭菌条件为15bf/in(1.034×10⁵Pa)、25min。配制方法均参考Sambrook等编著的《分子克隆实验指南》。

1)提取组织样DNA所用溶液

①2mol/L NaCl：11.688g NaCl溶于水，定容至100mL，高压灭菌。

②组织DNA提取液(100mL)：l mol/L Tris-Cl(pH 8.0)l mL，0.5mol/L EDTA(pH8.0)20mL，2mol/L NaCl 5mL，定容至100mL。

③基因组DNA提取时的公用溶液。

2)琼脂糖凝胶电泳分析所用溶液

①0.5×TBE缓冲液：取10×TBE 50mL定容至1000mL。

②上样缓冲液：0.25％溴酚蓝及0.25％二甲基苯氰FF，溶剂为40.0％(w/v)蔗糖水溶液。

2.山羊PPP3CA基因InDel位点扩增引物

在NCBI上检索山羊PPP3CA基因的序列，并利用Primer 6.0设计能够扩增山羊PPP3CA基因起始密码子上游区域InDel位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)的PCR引物对P1，具体引物序列如下：

上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；

下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。

理论上，PPP3CA基因16472-16491位的20-bp序列(ATCAGGATTGGCTATATACT)缺失时，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为一条159bp的带纹；所述16472-16491位的20-bp序列(ATCAGGATTGGCTATATACT)存在时，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为一条179bp的带纹。所述16472-16491位的20-bp序列(ATCAGGATTGGCTATATACT)在配对的两个染色体中仅有一个发生上述缺失的情况时，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为179bp和159bp的两条带纹。因此，PPP3CA基因16472-16491位作为突变位点，理论上存在三种基因型：II基因型表现为179bp的一条带纹，ID基因型表现为159bp和179bp的两条带纹，DD基因型表现为159bp的一条带纹。

3.PCR扩增待测山羊PPP3CA基因片段

3.1山羊耳组织样品的采集

2018年7月于陕西省榆林市狄青塬陕北白绒山羊养殖场随机选取营养水平、年龄和胎次相同的成年母羊，实验共采集366个陕北白绒山羊样本的耳组织。

采用随机采样方式采取个体耳组织样品，样品用70％乙醇保存于低温冰盒，带回实验室后置于-80℃冻存。

3.2耳组织样品中基因组DNA的提取

1)取约10mg耳组织，放于1.5mL的离心管中，用剪刀尽量剪碎。

2)加入600μL组织DNA提取液，保证耳组织样均匀地分布在组织提取液中，加入10％SDS至终浓度为1％，加入蛋白酶K至终浓度为100μg/mL，55.0℃消化过夜。

3)将消化后溶液冷却至室温，加入等体积的Tris饱和酚，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。

4)取上清液，加入等体积的酚:氯仿(1:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。

5)取上清液，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管10min，12000r/min离心15min。

6)取上清液，加入2倍体积的冰冷无水乙醇和1/10体积的3mol/L醋酸钠，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，直至液体清亮，并出现白色絮状DNA。

7)挑出DNA，放进一个1.5mL的离心管中，加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇。

8)再一次向离心管中加入500μL 70％乙醇，盖紧管盖，缓慢地来回颠倒离心管，然后12000r/min离心3～5min，小心倒掉乙醇，将管倒置于吸水纸上。

9)待DNA干燥后，加入60μL灭菌超纯水，4℃保存过夜，使DNA完全溶解，待测。

3.3琼脂糖凝胶电泳检测DNA

1)将电泳槽洗干净，用胶带纸将两端封住，插上梳子。

2)称取1.2g的琼脂糖，转入三角瓶中，加入0.5×TBE 40mL使其悬浮，微波炉中火加热，待沸腾2次后取出，待其冷却至不烫手时加入终浓度为0.5μg/mL的EB，轻微摇动，防止出现气泡。

3)混匀后(约60℃)，立即将琼脂糖溶液到入电泳槽内。如出现气泡，立即用移液器移出。

4)完全冷却凝固(约25～40min)后，拔掉梳子，去掉两端胶带纸。

5)向电泳槽中加入1×TBE缓冲液，使液面高出胶面2～5mm。

6)取DNA溶液2～4μL，加2μL上样缓冲液后混匀，上样，并将DNAMarker加在一边。

7)80V电压电泳2h。

8)在紫外分析仪上观察，如果有RNA则需要纯化，如果有明显降解，则需重新提取相应样品的DNA。

3.4 DNA的纯化

1)500μL的DNA溶液中加入10％SDS，使SDS终浓度为0.1％，加入蛋白酶K至终浓度达到100μg/mL。

2)55℃保温10h左右。

3)等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿分别抽提一次。

4)12000r/min离心5min分相，吸取上层水相至另一离心管中。

5)加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积冰冷无水乙醇沉淀DNA。

6)倒掉液体，70％乙醇洗涤，待DNA晾干，加入60μL灭菌超纯水溶解，4℃保存，待检测。

3.5分光光度法检测DNA

用紫外光光度计测定DNA样品在260nm、280nm处的OD值。计算OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值。如OD₂₆₀/OD₂₈₀比值小于1.6，说明样品DNA中含有较多的蛋白质或酚，则应进行纯化；若比值大于1.8，则应该考虑去除RNA纯化。

DNA浓度(ng/μL)＝50×OD₂₆₀值×稀释倍数

DNA检测合格后，取出一定的量DNA溶液，稀释至50ng/μL，存于-20℃备用，其余的存放于-80℃。

3.6 PCR扩增

PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和1次反应所需的PCR反应的个数，算出各种反应组分的总量，加入到1个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。

PCR反应体系(13μL)：2×Taq PCR SuperMix(包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和反应缓冲液，浓度为2×)6.5μL、上游引物0.5μL、下游引物0.5μL(上、下游引物浓度分别为10pmol/μL)、模板DNA(浓度为50ng/μL山羊基因组DNA)1.0μL，及去离子水4.5μL。

PCR反应程序：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。

4.PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析

4.1琼脂糖凝胶电泳检测

1)制作3.0％的琼脂糖凝胶，使用EB核酸染料染色，点样4μL，120V电压电泳1-1.5h；

2)分子量不同的DNA片段分离后，即可在BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统成像；

3)根据琼脂糖凝胶电泳结果分析。

4.2鉴定Indel位点的基因型

参见图1、图2，通过BIO-RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统对电泳结果进行照相分析，分析结果表明，利用引物对P1对山羊基因组进行扩增，并对扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行分析，能够实现对山羊PPP3CA基因16472-16491位(NC_030813.1)的20-bp插入/缺失多态性位点进行快速、准确的分型鉴定(基因型：II、ID)。

5.山羊PPP3CA基因Indel位点的频率统计分析

基因型频率是指一个群体中某种基因型的个体数占总个体数的比率。

陕北白绒山羊样本PPP3CA基因在上述20-bp插入/缺失多态性位点的基因型频率统计结果如表1所示。

表1.山羊PPP3CA基因InDel位点基因频率分布

6.山羊PPP3CA基因InDel位点基因效应的关联分析

基因型数据：通过PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳识别的基因型(II、ID)

繁殖数据：第一胎产仔数

利用SPSS(23.0)软件来分析InDel位点与山羊产仔数的相关性。在数据处理的过程中，考虑到个体的效应，基因之间的互作以及基因型的效应，采用固定的模型来进行相关分析，如下所示：

Y＝μ+G+e

其中，Y：个体表型记录；u：总体均值；G：标记基因型效应；e：随机误差。

分析结果具体参见表2、表3。

表2.PPP3CA基因InDel位点与陕北白绒山羊第一胎产仔数的相关性分析

表3.PPP3CA基因InDel位点与陕北白绒山羊第一胎产仔数卡方分析(_χ ²).

由表2可以看出，PPP3CA基因插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)的不同基因型对成年母羊个体产仔数有显著影响(P<0.05)，基因型为ID的个体在产仔数上优于基因型为II的个体。

由表3可以看出，经过卡方分析，PPP3CA基因插入/缺失多态性位点(NC_030813.1:g.16472-16491位)的成年母羊个体产单羔和多羔之间有显著差异(P<0.05)。

因此，上述插入/缺失多态性位点的ID基因型可以作为提高山羊繁殖性状(例如，产仔数)的候选遗传标记。

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种山羊PPP3CA基因InDel标记的检测方法及其应用

<160> 3

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

tgttaaaagt gtcagaggaa ttagc 25

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

cgcacttcat tctgagtagc tg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> NC_030813.1: g.16472-16491

<400> 3

atcaggattg gctatatact 20

Claims

1.一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

以山羊基因组DNA为模板，通过PCR扩增PPP3CA基因部分片段，对扩增的片段进行琼脂糖凝胶电泳；根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定PPP3CA基因插入/缺失多态性位点的基因型，所述插入/缺失多态性位点位于PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472-16491位。

2.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的扩增引物对为：

上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；

下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。

3.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PCR的反应程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸20s，18个循环，每循环后退火温度减1℃；50℃退火30s，72℃延伸20s，30个循环；72℃延伸10min。

4.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳采用质量浓度为3.0％的琼脂糖凝胶。

5.根据权利要求1所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法，其特征在于：所述PPP3CA基因插入/缺失多态性位点的插入/插入基因型的琼脂糖凝胶电泳结果表现为179bp的一条带纹，插入/缺失基因型表现为179bp和159bp的两条带纹，缺失/缺失基因型表现为159bp的一条带纹。

6.一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于PCR扩增PPP3CA基因插入/缺失多态性位点的引物对，所述插入/缺失多态性位点位于PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472-16491位。

7.根据权利要求6所述一种山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测试剂盒，其特征在于：所述引物对为：

上游引物：5’-TGTTAAAAGTGTCAGAGGAATTAGC-3’；

下游引物：5’-CGCACTTCATTCTGAGTAGCTG-3’。

8.PPP3CA基因NC_030813.1:g.16472-16491位插入/缺失多态性位点在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

9.一种如权利要求1所述的山羊PPP3CA基因插入/缺失多态性的检测方法在山羊分子标记辅助选择育种中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述插入/缺失多态性位点的插入/缺失基因型可以作为提高山羊产仔数的DNA标记。