CN111849946A - 透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素c酰化酶表达量中的应用 - Google Patents

透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素c酰化酶表达量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素C酰化酶表达量中的应用，公开了一种提高头孢菌素C酰化酶表达量的方法，所述方法包含头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中共表达的步骤。

Description

透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素C酰化酶表达量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素 C酰化酶表达量中的应用。
背景技术
头孢菌素是世界上使用较为广泛的半合成抗生素，在临床使用中,多数头孢类抗生素生产的中间体为7-氨基头孢烷酸。7-氨基头孢烷酸主要来自头孢菌素C 脱酰作用，主要脱酰方式有化学法、二步酶法和一步酶法。化学脱酰法具有环境不友好且反应条件苛刻等缺点已经被市场淘汰。二步酶法已经基本应用于工业生产，但二步酶法转化率低，反应不易于控制。一步酶法可以直接将头孢菌素C 脱酰转化为7-氨基头孢烷酸，具有高转化率、高经济性和环境友好性等优点受到了广泛研究。
透明颤菌血红蛋白发现于透明颤菌体内，属于贝日阿托菌属，专性好氧革兰氏阴性丝状菌。透明颤菌血红蛋白与血红蛋白在光谱学和氧结合动力学上相似，是人类首次发现的微生物血红蛋白。透明颤菌血红蛋白可以在很多宿主细胞中表达，通过促进氧的输送增强呼吸和能量代谢，以提高许多有用的代谢产物，如抗生素、蛋白质、聚合物等的产量和宿主抗逆性，还能降低有害化合物的毒害作用。
由于大自然中存在的头孢菌素C酰化酶活性较低且不稳定，难于工业应用，因此获得一种具有高转化效率的头孢菌素C酰化酶成为解决问题的关键。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高头孢菌素C酰化酶表达量的方法，所述方法包含头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中共表达的步骤。
具体步骤如下：
(1)分别扩增头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因；
(2)以步骤1获得的两种基因构建大肠杆菌共表达载体并转化感受态大肠杆菌获得重组菌株；
(3)培养并诱导重组菌株表达头孢菌素C酰化酶；
(4)优化培养条件提高重组菌株表达头孢菌素C酰化酶的酶活。
进一步地，所述大肠杆菌为ptsG基因缺失的大肠杆菌。
本发明的另一个目的是提供头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因的共表达在提高头孢菌素C酰化酶表达中的应用。
进一步地，所述大肠杆菌为ptsG基因缺失的大肠杆菌。
本发明的再一个目的是通过培养基优化提高头孢菌素C酰化酶在大肠杆菌中的表达。
附图说明
图1是头孢菌素C酰化酶基因PCR扩增电泳图，其中，第一泳道是M maker，第2-5泳道是CA条带。
图2是透明颤菌血红蛋白vgb基因PCR电泳扩增图，其中第一泳道是M maker，第2泳道是vgb条带。
图3是表达载体pETDuet-CA的构建图。
图4是表达载体pETDuet-Vgb的构建图。
图5是表达载体pET28α-CA-Vgb的构建图。
图6是重组菌株pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))菌落PCR验证图。其中，左起第1泳道为M maker，第2-11泳道分别为相同的重组菌株。泳道2、4、6、8、10为头孢菌素C酰化酶PCR验证，泳道3、5、7、9、11为透明颤菌血红蛋白PCR验证。
图7是重组菌SDS-PAGE电泳图，其中，左起第1泳道为M maker，第2-7 泳道分别是pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG (+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))；RSFDuet-CA (ptsG(+)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。
图8是7-氨基头孢烷酸标准曲线。
图9是HPLC结果图。其中，从上到下分别是7-ACA、CPC、重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))、混合物(重组菌株 pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))+7-ACA)。
图10是小分子质谱图。其中，从上到下分别是7-ACA:[M+Na]+m/z 295.0362、CPC:[M+H]+m/z416.1104、重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-) BL21(DE3)): [M+Na]+m/z295.0356。
图11是不同底物浓度反应酶活的测定图。其中每组不同底物浓度从左到右 6个样品分别为1：pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；2： pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；3：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb (ptsG(-)BL21(DE3))；4：RSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；5： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；6： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))
图12是遗传稳定性对比图。其中，1：pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； 2：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；3：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb (ptsG(-)BL21(DE3))；4：RSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；5： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；6： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))，每组的左边是F0，右边是 F10。
图13是不同IPTG诱导浓度酶活的测定。其中1-6组分别是 1：pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；2：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+) BL21(DE3))；3：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))；4：RSFDuet-CA (ptsG(+)BL21(DE3))；5：pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； 6：pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))，每组中从左到右的IPTG 诱导浓度分别为0.01M、0.05M、0.1M、0.5M。
图14是不同氧含量酶活的测定。其中，1：pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； 2：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；3：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb (ptsG(-)BL21(DE3))；4：RSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；5： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；6： pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))，每组中从上到下分别为150mL、100mL、50mL、25mL培养基条件下的酶活测定。
图15是不同外加C源酶活的测定图。其中，外加C源分别为果糖0.3％、麦芽糖0.3％、可溶性淀粉0.3％、蔗糖0.3％、葡萄糖0.3％和甘油0.3％。每组中从左到右重组菌株分别为：
1：pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；2：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+) BL21(DE3))；3：pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))；4：RSFDuet-CA (ptsG(+)BL21(DE3))；5：pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； 6：pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)
图16是不同甘油浓度对酶活的影响图。
图17是不同外加N源酶活的测定图。其中，每组的左边为 pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)，右边为 pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)。
图18是不同牛肉膏浓度对酶活的影响图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的全部材料、试剂，质粒等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
【实施例1】实验材料
菌株与质粒
大肠杆菌E.coli BL21(DE3)、大肠杆菌E.coli DH5α均购自深圳康体生命科技有限公司。质粒pETDuet-1，pACYCDuet-1，pRSFDuet-1购自Addgene。
实验方法：
1.P1噬菌体转导受体菌
(1)供体菌JM1087的裂解(JM1087基因型:BW25113 ptsG::kan，表型:Kan+，供体菌的ptsG基因已敲除，相应位置由卡那霉素抗性基因所取代，该基因两端还带有FRT序列)
①将供体菌JM1089在5mL的LB中培养至OD600＝0.1～0.2，加入50μL 1M CaCl2，混匀。
②加入10～100μL的野生型P1噬菌体，37℃摇床培养至少3h至细胞裂解。
③每毫升培养液中加入1～3滴氯仿，震荡杀死细胞。
④37℃摇床培养10min后，取1mL培养液于离心管中以最高转速离心2min，将上清液转移至无菌管中，加入2滴氯仿(每毫升上清液1～3滴)并震荡混匀，置于4℃保存备用。
(2)转导
①在5mL LB培养基中将受体菌BL21(DE3)至少培养至OD600＝0.7。
②加入50μL 1M CaCl2，混匀。
③设置三组实验：
a.200μL受体菌液+50μL P1噬菌体裂解液；
b.200μL受体菌液+50μL LB培养基；
c.200μL LB培养基+50μL P1噬菌体裂解液。
三组后续进行相同操作：30℃静置保温30min，加入100μL 30％的柠檬酸钠和500μL LB培养基，37℃静置保温1h，6000rpm离心2min，弃掉上清液，加入
30μL 30％的柠檬酸钠和70μL LB培养基将细胞沉淀重新悬浮起来。取10～ 50μL
悬浮液涂在含有卡那霉素和柠檬酸钠的LB平板上，37℃培养过夜。
(3)转导子的鉴定和分离
挑取5～10个转导子于新的含有卡那霉素和柠檬酸钠的LB平板上涂板，37℃保温培养。利用菌落PCR鉴定P1噬菌体是否使用含卡那霉素抗性基因的片段转
导置换了ptsG基因，若能检测到卡那霉素抗性基因片段，即为获得了ptsG缺陷
型菌株BL21(DE3)。
2.受体菌BL21(DE3)卡那霉素抗性基因的敲除
(1)制备电击转化法用的受体菌BL21(DE3)感受态细胞
①将受体菌接种到50mL LB液体培养基中，再向培养基中加入50μL 50mg/mL 的卡那霉素溶液，37℃，250rpm，摇床培养至od600＝0.5-0.6。
②将菌液转移至无菌离心管中，冰中放置15min。
③5000rpm，4℃，离心10min，弃去上清。
④用无菌水清洗4次菌体，无菌水与菌液体积关系为：第一和第二次使用等体积的无菌水，后两次使用1/4菌液体积的无菌水。每次加入无菌水均需无菌
操作并震荡重悬菌体，再按照(3)步骤离心一次。
⑤使用终浓度为15％的无菌甘油溶液重悬菌体，100μL/管分装至无菌的 1.5mLEP管中，-80℃保存备用。
⑥若当天使用，步骤(5)可用无菌水重悬菌体，100μL/管分装至无菌的1.5mL EP管中，冰中放置备用。
(2)质粒pCP20电击转化受体菌BL21(DE3)感受态细胞
①10000rpm，离心1min，弃去上清，再用200μL枪头尽量吸尽上清。
②加入100μL无菌水，震荡混匀。
③加入50ng质粒pCP20(0.5μL 100ng/μL),混匀。
④吸取质粒与感受态细胞的混悬液，加入到冰中预冷的无菌电转杯中，放置在电转仪器卡槽里。
⑤电转仪器电压设定为1800v。
⑥电转结束后以最快速度加入1mL LB培养基。
⑦30℃,200rpm，摇床培养1h。
⑧培养后取出菌液混匀，吸取100μL，涂布在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上；菌液4000rpm，离心4min，弃去800μL，余下上清与沉淀混匀，涂布在另一个含有氨苄青霉素的LB固体培养基上。
⑨30℃培养过夜
(3)受体菌BL21(DE3)卡那霉素抗性基因的敲除与筛选
①挑取上述过夜培养的氨苄青霉素平板上的单菌落，接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃培养过夜；
②按菌液：LB培养基＝1:100的体积比，取过夜培养的菌液接种至新的无抗生素的LB培养基中，30℃摇床培养。
③当菌液OD600约为0.1左右时，把培养温度提高到42℃，继续摇床培养到 OD600＝0.8～1.0。
④吸取50μL菌液涂布于无抗生素的平板上，37℃培养过夜。
⑤筛选：挑取10个菌落，使用3种LB平板进行筛选鉴定：①含有氨苄青霉素的平板(验证菌体中质粒pCP20是否已经丢失)、②含有卡那霉素的平板(验证菌体的卡那霉素抗性基因是否已经敲除)、③无抗生素的平板。每一个菌落均在三种平板上划线接种，在有抗性的平板上无法生长，在无抗性的平板能够生长的菌落即为目标菌落(即卡那霉素抗性基因和ptsG基因均缺失的缺陷型菌株)，用于后续实验。
试剂与仪器
本申请使用到的主要试剂和仪器如表1所示。
表1
Figure RE-GDA0002682439150000061
Figure RE-GDA0002682439150000071
常用溶液与培养基的配置
液体Luria-Bertani培养基(LB培养基)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，在121℃条件下灭菌21min。
固体Luria-Bertani培养基(LB培养基)：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L，在121℃条件下灭菌21min，室温放置至60℃左右，加入相应的抗生素，配置成相应抗生素的板。
pH8.0的磷酸盐缓冲液：磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g溶解于1L的中，用2MNaOH调节pH至8.0，室温保存。
75mg/mL7-ACA溶液：称取0.75g的7-ACA溶液溶解于10mL的0.5MNaOH 溶液，用2M稀盐酸调节pH为8.0，4℃保存。
20mg/mL头孢菌素钠盐溶液：称取0.1g头孢菌素溶解于pH为8.0的磷酸盐缓冲液中，用2MNaOH溶液调节pH至8.0，4℃保存。
5g/L对二甲氨基苯甲醛(显色液)：称取0.5g对二甲氨基苯甲醛溶解于100mL 甲醇，避光保存。
0.05M NaOH溶液：称取2g NaOH溶解于1L去离子水中，室温保存。
终止液：20％乙酸和0.05M NaOH以2:1的比例混合，室温保存。
100mg/mL氨苄青霉素溶液：称取1mg的氨苄青霉素粉末，溶解于10mL的去离子水中，在超净台中用0.22μm的滤膜过滤，分装到1.5mL的EP管中，-20℃保存。
50mg/mL卡那霉素溶液：称取0.5mg的卡那霉素粉末，溶解于10mL的去离子水中，在超净台中用0.22μm的滤膜过滤，分装到1.5mL的EP管中，-20℃保存。
50mg/mL氯霉素溶液：称取0.5mg的氯霉素粉末，溶解于10mL的无水乙醇中，分装到1.5mL的EP管中，-20℃保存。
0.1M异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropylβ-D-Thiogalactoside)溶液：称取0.24g IPTG，溶解于去离子水中，在超净台中用0.22μm的滤膜过滤，分装到 1.5mL的EP管中，-20℃保存。
0.25％考马斯亮蓝R-250(100mL)：在通风橱中，准确称取考马斯250 0.25g 放入500mL烧杯中加入蒸馏水45mL，甲醇45mL，冰乙酸10mL，用玻璃杯搅拌溶解后，过滤，过滤液保存在棕色瓶中待用。
考马斯亮蓝脱色液(1L)：在通风橱中，准确量取850mL的蒸馏水，而后加入冰乙酸100mL，乙醇50mL，室温保存。
【实施例2】实验方法
头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因克隆及序列分析
头孢菌素C酰化酶基因是根据大肠杆菌密码子识别特点优化GC含量重新合成，如SEQ ID NO.9所示，更利于其在大肠杆菌中的表达。
菌种复苏
1.将从-80℃保存的菌株取出至冰上溶解。
2.在超净台中用接种环将融化的保存的菌株接种至装有含有相应抗生素的 5mL液体LB的摇菌管中。37℃，200rpm，过夜培养。
3.在超净台中，取过夜培养的菌种一环划线至具有对应抗生素的固体LB平板上。37℃，倒置过夜培养。
4.挑取平板上单菌落进行后续的实验操作。
质粒DNA小量提取
1.取1-4mL过夜培养的菌液(根据菌液的菌体量酌情添加)于2mLEP管中， 12,000rpm，1min，弃上清。
2.向倒掉上清的EP管中加入150μL，的溶液P1(已加入RNaseA和 TIANRed)，悬浮沉淀，溶液变成浑浊的红色。
3.向上述EP管中加入P2 150μL，缓慢的上下晃动翻转使菌体裂解，至溶液变成澄清的紫色。
4.向上述的EP管中加入350μL溶液P5，马上迅速地摇晃均匀12-20次，至溶液变成澄清的黄色，伴随白色絮状物出现，如果黄色中伴有紫色，说明复性不充分，，继续混匀至溶液变成澄清的黄色。12,000rpm,2min。
5.将上一步骤中的上清转移至吸附柱CP3中(吸附柱放在收集管中)，尽量不要吸到沉淀，12,000rpm,30sec，弃掉上清，吸附柱重新放入收集管中。
6.往吸附柱中加入300μL漂洗液PWT(已加入无水乙醇)，12,000rpm,30sec，弃掉收集管中的废液，吸附柱CP3放入收集管，再次离心12,000rpm,1min，使吸附柱中残余的漂洗液尽可能去掉。
7.将吸附柱CP3放置于一个全新的1.5mL EP管中，向吸附柱中加入50-100 μL洗脱液TB(洗脱液可以先在60℃中预热)，离心12,000rpm,30sec将质粒收集至EP管中，做好标签备用。
目的基因的扩增
分别挑取单菌落接种液体LB培养基中，于37℃，200rpm过夜培养，法提取含有头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因的质粒，进行目的基因的扩增，所需引物如表2所示，经过核酸电泳，将大小条带与目的基因基因一致的PCR产物送至艾基生物科技有限公司测序验证。
表2寡核苷酸引物
序列号 引物名称 5'引物序列3'
SEQ ID NO.1 CA(NdeI)1F CGC<u>CATATG</u>GCGATGACCATGGCGGCGAAAACTG
SEQ ID NO.2 CA(HindⅢ)1R CCC<u>AAGCTT</u>GGGTTACGCCGGCACCAGTTCCT
SEQ ID NO.3 Vgb-1F(EcoRI) CCG<u>GAATTC</u>ATGTTAGACCAACAAACCGTAGACA
SEQ ID NO.4 Vgb-1R(HindⅢ) CCC<u>AAGCTT</u>TTATTCAGCGTCTTGAGCGTAC
SEQ ID NO.5 CA-2F(EcoRI) CCG<u>GAATTC</u>GCGATGACCATGGCGGCGAAAACTG
SEQ ID NO.6 CA-2R(vgb) ACGGTTTGTTGGTCTAACATGGGTTACGCCGGCACCAGTT
SEQ ID NO.7 Vgb-2F(CA) AGGAACTGGTGCCGGCGTAAATGTTAGACCAACAAACCGT
SEQ ID NO.8 Vgb-2R(HindIII) CCC<u>AAGCTT</u>TTATTCAGCGTCTTGAGCGTAC
大肠杆菌重组菌株的构建
1.大肠杆菌感受态的制备
受体菌的培养：从平板上挑取活化的ptsG(+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3) 接种于装有5mLLB培养基的摇菌管中在37℃，200rpm过夜培养。将该菌悬液以2％的接种量接种至装有50mLLB培养基的250mL摇瓶中，37℃振荡培养2.5h 至OD约为0.6左右。
感受态细胞的制备：
1.将1mL菌液转移至1.5mL EP中,冰上放置10min,离心4℃，5000rpm，10min。
2.弃上清，加入1mL预冷的0.05mol/Lde CaCl2溶液(灭菌)轻轻悬浮细胞，冰上放置30min，离心4℃，5000rpm，10min。
3.弃上清，加入0.2mL预冷的含有15％甘油和0.05M CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置5min，既得感受态细胞。
2.大肠杆菌表达载体的构建
将测序正确的头孢菌素C酰化酶的PCR产物和透明颤菌血红蛋白的PCR产物进行纯化回收，头孢菌素C酰化酶回收产物和pACYCDuet-1，pRSFDuet-1， pETDuet-1三种质粒分别进行NdeI和HindⅢ双酶切，酶切产物纯化回收后进行 T4 DNA酶连接反应(27℃，30min)。连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，获得转化子，挑选10个转化子进行菌落PCR验证，选取2～3个PCR验证正确的转化子送去测序验证。验证正确的转化子扩大培养并保种。从转化子中提取质粒于 -20℃保存备用。
3.头孢菌素C酰化酶质粒和透明颤菌血红蛋白质粒共转化至大肠杆菌ptsG (+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3)
将上述三种头孢菌素C酰化酶质粒和三种透明颤菌血红蛋白两两组合分别转化至ptsG(+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3)，经过菌落PCR和测序验证。质粒组合为：①pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb；②pETDuet-CA/pACYCDuet-vgb；③ pRSFDuet-CA/pETDuet-vgb；④pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb；⑤ pACYCDuet-CA/pETDuet-vgb；⑥pACYCDuet-CA/pRSFDuet-vgb)，分别转化至 ptsG(+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3。
酶活测定方法
1.标准曲线的确定
称取0.75g的7-ACA粉末溶解于10mL的0.5M NaOH溶液，用2M稀盐酸调节pH为8.0，得到0.75mg/mL的7-ACA母液。取6支5mL EP管标记为 0,1,2,3,4,5按序号从小到大的顺序向EP管中一次加入7-ACA母液 0mL,0.2mL,0.4mL,0.6mL,0.8mL,1.0mL以及分别加入pH为8.0的磷酸盐缓冲液 1.0mL,0.8mL,0.6mL,0.4mL,0.2mL,0mL混匀，同时向这6支5mLEP管中加入3mL 的反应终止液和0.5mL的显色液混匀，室温放置10min，用分光光度计测定OD415处的吸光度，绘制标准曲线。每支EP管设置3个重复。
2.酶活的测定方法
1.粗酶液的制备：取1mL菌液在12 000rpm,4℃,10min离心弃上清，加1mL pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心12 000rpm,4℃,10min，稀释 5倍，确保吸光度值不超过1.0。
2.分光光度计法测酶活：取稀释酶液0.1mL于一新EP管中，37℃预热10min，加入已经预热好的20mg/mL CPC溶液(37℃预热10min)0.1mL混匀，37反应 10min后，加入0.6mL终止液和0.1mL显色液，混匀。室温静置10min，用分光光度计测定OD415处的吸光度并记录。
酶活单位的定义为每分钟催化生成1μmol 7-ACA所需的酶量，既是μmol/(mL*min)。得酶活公式为
U＝(Y*1000μg/mg)/(272μg/μmol*10min*0.1mL)*5
4.反应产物的小分子质谱检测
取1mL菌液在12 000rpm,4℃,10min离心弃上清，加1mL pH8.0的0.1M Tris-Hcl缓冲液重悬菌体，超声破碎，离心12 000rpm,4℃,10min。取上清的粗酶液0.1mL于一新EP管中，37℃预热10min，加入已经预热好的20mg/mL CPC 溶液(37℃预热10min)0.1mL混匀，37℃反应10min后，加入0.6mL终止液，混匀。用0.22μm滤膜过滤至色谱瓶中，进行液相色谱测定，并将与标品出峰时间一致的峰接出送至深圳大学测试中心进行小分子质谱的检测。
不同条件对重组菌株酶活的影响
1.最佳反应底物浓度的确定
头孢菌素C酰化酶与头孢菌素的反应具有底物浓度抑制和产物抑制的影响，所以在进行酶活反应监测时需要一个合适的反应底物浓度。配置不同浓度的反应底物(15mg/mL、20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL)进行酶活反应，确定最适的反应底物浓度。
2.遗传稳定性的检测
为了研究质粒在菌体内的稳定性，进行多次传代培养并进行酶活的测定。将转化成功并成功验证的菌株进行酶活的测定，选取具有酶活的菌株作为第0代进行传代培养，转接至LB液体培养基中，37℃过夜培养，此为第一代(F1)并在固体LB平板上分离出单个纯种菌落。挑取F1单菌落，转接，培养得到第二代 (F2)。依次传代培养至第十代(F10)并进行酶活测定。
3.最适IPTG诱导浓度的确定
在使用大肠杆菌作为宿主用于表达外源蛋白过程中，对于需要诱导表达的载体，诱导剂对于外源基因高效、稳定的表达起着非常重要的作用。Lac启动子是使用最早、研究最详细的启动子之一，所以目前用于诱导重组蛋白表达的诱导剂主要是IPTG和乳糖。乳糖作为诱导剂的诱导过程较为复杂和繁琐，诱导效果不如IPTG明显。但IPTG诱导剂较为昂贵且对细胞有毒性作用，所以在外源蛋白表达时需要合适的IPTG诱导浓度。按10％装瓶量于250mL三角瓶加入LB培养基，按1％接种量接入转化菌株pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG (-)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。在37℃，200rpm，培养约 3h至OD600至0.6时，分别加入终浓度为0.01M，0.05M，0.1M，0.5M IPTG， 28℃,150rpm培养20h，超声破碎后测定头孢菌素C酰化酶酶活，检验不同IPTG 诱导浓度对头孢菌素C酰化酶酶活的影响。从而确定最适的IPTG诱导浓度。
4.不同氧含量条件下酶活的测定
分别按10％、20％、40％、60％装瓶量于250mL三角瓶加入LB培养基，按 1％接种量接入转化菌株pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG (-)BL21(DE3))；；pRSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。在37℃，200rpm，培养约 3h至OD600至0.6时，加入终浓度为0.05MIPTG后，28℃,150rpm培养20h，超声破碎后测定头孢菌素C酰化酶酶活，检验含氧量对头孢菌素C酰化酶酶活的影响。
5.最佳pH的确定
配置不同pH(6.0，6.5，7.0，7.5,8.0,8.5,9.0)的LB培养基，按1％接种量接入转化菌株pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG (+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA (ptsG(+)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。在37℃，200rpm，培养约 3h至OD600至0.6时，加入终浓度为0.05M IPTG后，28℃,150rpm培养20h，超声破碎后测定头孢菌素C酰化酶酶活，检验不同pH对头孢菌素C酰化酶酶活的影响。
6.合适外加C源以及C源含量的确定
配置外加有不同C源(0.3％)的LB培养基，选择的外加C源有葡萄糖、甘油、果糖、麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖和胰蛋白胨。按1％接种量接入转化菌株pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+) BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA (ptsG(+)BL21(DE3))；pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。在37℃，200rpm，培养约3h至OD600至0.6时，加入终浓度为0.05M IPTG后，28℃,150rpm培养20h，超声破碎后测定头孢菌素C酰化酶酶活，检验不同的外加C源对头孢菌素C酰化酶酶活的影响。
确定了最佳外加C源后，选择重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG (-)BL21(DE3)作为研究对象，设置不同的含量(0％，0.3％，0.5％，0.7％，0.9％， 1.1％，1.3％，1.5％)进行酶活的检测，以确定外加C源的最佳含量。
7.外加N源的确定N源含量的确定
配置外加有不同N源(0.3％)的LB培养基，选择的外加N源有硫酸铵 ((NH4)2SO4)、尿素(U)、氯化铵(NH4Cl)和牛肉膏。按1％接种量接入转化菌株pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))。在37℃，200rpm，培养约 3h至OD600至0.6时，加入终浓度为0.05M IPTG后，28℃,150rpm培养20h，超声破碎后测定头孢菌素C酰化酶酶活，检验不同的外加N源对头孢菌素C酰化酶酶活的影响。
确定了外加N源后选择重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-) BL21(DE3)作为研究对象，设置不同的外加N源含量(0％，0.5％，1.0％，1.5％， 2.0％，2.5％，3.05％，4.0％，6.0％，8.0％，10％，15％)进行酶活检测，以确定外加N源的最佳含量。
【实施例3】实验结果
1.头孢菌素C酰化酶的扩增和序列对比
为了获得头孢菌素C酰化酶(CA)基因，按实施例2中所述的菌种复苏的步骤活化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，并提取质粒pET28α-CA。以引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2(CA-1F/CA-1R)为引物扩增头孢菌素C酰化酶基因序列，扩增产物琼脂糖电泳结果见附图1。PCR扩增产物CA的大小约2500bp，符合预期结果。将符合结果预期的头孢菌素C酰化酶基因的PCR产物送去艾基测序公司检测后，其测序结果与目标序列结果一致。
2.透明颤菌血红蛋白基因的扩增和序列对比
为了获得透明颤菌血红蛋白(Vgb)基因，按实施例2中所述菌种复苏的步骤活化透明颤菌血红蛋白菌株，并以其基因组为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4(Vgb-1F/Vgb-1R)为引物，扩增大小为456bp的透明颤菌血红蛋白基因，扩增产物琼脂糖电泳结果见附图2，结果符合预期。将符合结果预期的透明颤菌血红蛋白基因的PCR产物送去艾基测序公司检测后，其测序结果与目标序列结果一致，如GenBank:L21670.1所示序列。
3.大肠杆菌表达载体的构建
共表达质粒是指在一个菌株中可以共存两个质粒并表达。本次实验选取pACYCDuet-1，pRSFDuet-1，pETDuet-1这三种共表达质粒在大肠杆菌中共表达头孢菌素C酰化酶基因及透明颤菌血红蛋白基因。
4.头孢菌素C酰化酶载体的构建
头孢菌素C酰化酶的PCR产物进行纯化回收，头孢菌素C酰化酶回收产物和pACYCDuet-1，pRSFDuet-1，pETDuet-1三种质粒分别进行NdeI和HindⅢ双酶切，酶切产物纯化回收后进行T4 DNA酶连接反应(27℃，30min)。以质粒pETDuet-CA构建为例，如图3所示。连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑选转化子，进行菌落PCR验证，选取2～3个PCR验证正确的转化子送去测序验证。验证正确的转化子扩大培养并保种。从转化子中提取质粒于-20℃保存备用。
5.透明颤菌血红蛋白载体的构建
透明颤菌血红蛋白的PCR产物进行纯化回收，透明颤菌血红蛋白回收产物和pACYCDuet-1，pRSFDuet-1，pETDuet-1三种质粒分别进行EcoRI和HindⅢ双酶切，酶切产物纯化回收后进行T4 DNA酶连接反应(27℃，30min)。以质粒 pETDuet-Vgb构建为例，如图4所示。连接产物转化至大肠杆菌DH5α中，挑选转化子，经过菌落PCR验证，选取2～3个PCR验证正确的转化子送去测序验证。验证正确的转化子扩大培养并保种。从转化子中提取质粒于-20℃保存备用。
6.融合头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白表达载体的构建
以验证正确并纯化回收的头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白为模板，分别以CA-2F/CA-2R，Vgb-2F/Vgb-2R为引物扩增并回收。用重叠PCR技术使头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白重叠拼接并与质粒连接，构建重组质粒 pET28α-CA-Vgb，如图5所示。转化至大肠杆菌DH5α中，获得转化子，挑选10 个转化子进行菌落PCR验证，选取2～3个PCR验证正确的转化子送去测序验证。验证正确的转化子扩大培养并保种。从转化子中提取质粒于-20℃保存备用。
7.头孢菌素C酰化酶质粒和三种透明颤菌血红蛋白在大肠杆菌中的组合表达
将上述三种头孢菌素C酰化酶质粒和三种透明颤菌血红蛋白质粒两两组合 (①pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb；②pETDuet-CA/pACYCDuet-vgb；③ pRSFDuet-CA/pETDuet-vgb；④pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb；⑤ pACYCDuet-CA/pETDuet-vgb；⑥pACYCDuet-CA/pRSFDuet-vgb)，分别转化至 ptsG(+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3)。菌落PCR验证，以重组菌株 pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))为例，如图6所示。经过酶活测定，共表达重组菌株中只有质粒组合为pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb和 pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb的重组菌株有酶活反应，故后续所有实验均以此组合质粒的重组菌株进行实验测定。
8.融合基因头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白的重组菌株的构建
将质粒pET28α-CA-Vgb转化至ptsG(+)BL21(DE3)和ptsG(-)BL21(DE3)两种大肠杆菌，经过菌落PCR和酶活测定验证，该质粒在两种大肠杆菌中并不表达。因此后续实验不考虑此组重组菌株。
9.重组菌株SDS-PAGE
将有CPCacy的重组大肠杆菌进行产酶发酵，28℃诱导20h后，取菌液离心破壁后，取上清进行SDS-PAGE分析，如图7所示，6种重组大肠杆菌均在30kD 处和60kD左右处有大量蛋白，推测为CPCacy基因表达后产生的蛋白，酰化酶的蛋白经SDS处理后变性分为两个亚基，分别为α和β亚基，58kD为β亚基， 33kD处为α亚基，α亚基大小理论值应为25kD，比实际值偏小，推测为α亚基与载体上S标签融合后相对分子质量约为33kD。鉴于科学的严谨性，将粗酶液与反应底物的反应液进行HPLC和小分子质谱的测定，以进一步证明酶活反应产物确为7-ACA。
10.酶活标准曲线
7-氨基头孢烷酸可以和对二甲氨基苯甲醛发生显色反应，采用比色法测定头孢菌素C酰化酶酶活。按实施例2所述操作绘制酶活标准曲线，如图所示8所示，其中，y＝0.167x+0.0004，x为OD415，y为7-ACA浓度(mg/mL)。
11.反应产物的小分子质谱检测
HPLC
将标品7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、头孢菌素C(CPC)、重组菌株 pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))的酶活反应液以及重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))的酶活反应液和7-ACA 混合液进行液相色谱分析如图9所示,标品7-ACA的出峰时间为4.518s，标品 CPC的出峰时间为6.206S，重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-) BL21(DE3))酶活反应液和重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-) BL21(DE3))的酶活反应液和7-ACA混合液在4.512s和6.350s左右有目标峰出现，和标品7-氨基头孢烷酸、头孢菌素C的出峰时间大致一致，推断实验产生的头孢菌素C酰化酶与底物头孢菌素C的反应产物确为目标产物7-氨基头孢烷酸。
12.小分子质谱
上述HPLC出峰位置的样品转移至新EP管中，做好标记送至深圳大学测试中心进行分子质量的检测，结果如图10所示，对照组7-氨基头孢烷酸和钠离子分子质量为295.0362，符合7-氨基头孢烷酸的相对分子质量272。头孢菌素C加一个氢离子的相对分子质量为416，与小分子质谱结果一致。实验组出现295.0356 峰，和标品7-氨基头孢烷酸一致，再次验证酶反应产物为7-氨基头孢烷酸。
不同条件对重组菌株酶活的影响
1.最佳反应底物浓度的确定
头孢菌素C酰化酶的应用受到低活力、产物抑制和底物抑制等因素的制约。因此，一个合适的反应底物浓度对头孢菌素C酰化酶的反应来说非常重要。使用不同浓度的反应底物(15mg/mL、20mg/mL，25mg/mL，30mg/mL)进行酶活反应的对比，实验重复3次。如图11所示，重组菌株为pETDuet-CA(ptsG(+) BL21(DE3))、pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))、 pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))、RSFDuet-CA(ptsG(+) BL21(DE3))、pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))，在反应底物为20mg/mL时，各重组菌株的酶活力最高。重组菌株 pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))在反应底物浓度为25mg/mL 时酶活力最高。
2.遗传稳定性的检测结果
将转化成功并成功验证且具有酶活的菌株作为选择对象。从第0代进行传代培养，依次传代培养至第十代(F10)并进行酶活测定的对比(如图12)，以观察重组菌株的遗传稳定性，实验重复3次。由F0代和F10代酶活对比结果看，经过十代传代之后酶活力稍微有些下降，但都属于正常传代出现的衰退现象。
3.最适IPTG诱导浓度
IPTG作为有诱导物诱导外源蛋白的表达，因为IPTG对细胞具有一定的毒性作用。因此，一个合适的诱导物浓度既可以最大程度上减少对细胞的毒害作用，也可以降低成本。选定0.01M、0.05M、0.1M、0.5M的IPTG诱导浓度进行酶活测定，实验重复3次，结果如图13所示。
4.不同氧含量条件下酶活的测定
含氧量对外源蛋白的表达具有至关重要的影响。通过设置不同的培养基占比(10％、20％、40％、60％)改变摇瓶中氧气含量的变化，实验重复3次，通过酶活对比选定一个合适的含氧量。结果如图14所示,在培养基体积依次减少时，所有重组菌株的酶活依次提高。且在培养基体积为100mL时，透明颤菌血红蛋白对于大肠杆菌提高异源蛋白的表达具有一定的提高效果。考虑到实验成本以及操作等问题，后续实验都将使用培养基占比为10％的比例进行实验。
5.最佳pH的确定
不同微生物生长所需的pH环境不同，过酸或者过碱都会导致酶蛋白变性失活。同时在微生物的生长过程中由于营养物质的分解、代谢产物的积累，培养基的pH也会发生改变。因此，外源蛋白酶正确表达需要一个合适的pH培养基培养并表达。不同pH培养基发酵表达外源蛋白，实验重复3次，重组菌株 pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)、RSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3) 和pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))在pH为6.5和7.5时酶活较高，在pH为7.0时，酶活有一个显著的低估。综合所有重组菌株在各pH 培养基条件下酶活结果的显示，重组菌株的最适培养基pH为7.5。
6.最佳C源及含量的确定
在普通LB培养基中添加不同的C源发酵培养重组菌株，实验重复3次，通过酶活的测定，选择合适的外加C源。结果如图15所示，在外源添加0.3％甘油时，各重组菌株的酶活最高。其中，重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG (-)BL21(DE3)的酶活达到2.96U/mL。确定外加C源，设计合适的外加C源的比例以确定外加C源的含量，选择重组菌株pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG (-)BL21(DE3)为研究对象，结果如图16所示。当甘油浓度为0.5％时，酶活最高为3.5U/mL。因此选取甘油浓度为0.5％时为最佳浓度。当甘油的量达到最佳值后，继续添加甘油会抑制菌株的生长，发酵产酶有抑制作用，随着甘油的加入，酶活逐渐降低。
7.最佳N源及含量的确定
以重组菌株pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)和 pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)为例，在普通LB培养基中添加不同的N源发酵培养重组菌株，实验重复3次，酶活测定结果如图17所示，在外源添加牛肉膏后，重组菌株的pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-) BL21(DE3)酶活最高为2.3U/mL，pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3) 酶活为2.0U/mL。外源添加胰蛋白胨次之。通过酶活的测定，选择合适的外加N 源。确定外加N源，设计合适的外加N源的比例以确定外加N源的含量，结果如图18所示。当牛肉膏占比为6.0％时，酶活最高为6.5U/mL。因此选取牛肉膏占比为6.0％时为最佳浓度。当牛肉膏的量达到最佳值后，继续添加牛肉膏会对发酵产酶有抑制作用，随着牛肉膏的加入，酶活显著降低。
结论
综上所述，本申请成功在大肠杆菌中共表达头孢菌素C酰化酶和透明颤菌血红蛋白，构建重组菌株pETDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))；pETDuet-CA/pRSFDuet-vgb (ptsG(-)BL21(DE3))；RSFDuet-CA(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(+)BL21(DE3))； pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3))，酶活分别为0.51U/mL,0.67 U/mL,1.40U/mL,0.83U/mL,1.1U/mL,2.1U/mL。在大肠杆菌中，透明颤菌血红蛋白的表达使头孢菌素C酰化酶的酶活提高约30％。大肠杆菌中的ptsG基因的缺失可以使头孢菌素C酰化酶得酶活提高约1倍左右。经过外加碳源和外加氮源的单因素试验后，得到最佳外加碳源浓度为0.5％甘油，最佳外加氮源浓度为6％牛肉膏，酶活最高重组菌株为pRSFDuet-CA/pACYCDuet-vgb(ptsG(-)BL21(DE3)， 6.5U/mL。对比基因来源所构建的无Vgb基因表达和无ptsG基因缺失的重组菌株，培养基优化后酶活提高了77％。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 透明颤菌血红蛋白在提高头孢菌素C酰化酶表达量中的应用
<130> DJCN2010302
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> CA(NdeI)1F
<400> 1
cgccatatgg cgatgaccat ggcggcgaaa actg 34
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(32)
<223> CA(HindⅢ)1R
<400> 2
cccaagcttg ggttacgccg gcaccagttc ct 32
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> Vgb-1F（EcoRI
<400> 3
ccggaattca tgttagacca acaaaccgta gaca 34
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> Vgb-1R（HindⅢ）
<400> 4
cccaagcttt tattcagcgt cttgagcgta c 31
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> CA-2F(EcoRI)
<400> 5
ccggaattcg cgatgaccat ggcggcgaaa actg 34
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> CA-2R（vgb）
<400> 6
acggtttgtt ggtctaacat gggttacgcc ggcaccagtt 40
<210> 7
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(40)
<223> Vgb-2F(CA)
<400> 7
aggaactggt gccggcgtaa atgttagacc aacaaaccgt 40
<210> 8
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> Vgb-2R(HindIII)
<400> 8
cccaagcttt tattcagcgt cttgagcgta c 31
<210> 9
<211> 2325
<212> DNA
<213> 人工序列()
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2325)
<223> 头孢菌素C酰化酶基因
<400> 9
atgaccatgg cggcgaaaac tgatcgtgaa gctctgcagg ccgctctgcc accgctgtcc 60
ggtagcctgt ctatcccggg tctgtctgca ccggttcgtg tgcagcgcga cggctggggc 120
atcccgcata tcaaagcgag cggcgaagcg gatgcgtatc gtgcgttggg ctttgtgcat 180
gcgcaggatc gtctgtttca gatggaactg acccgtcgta aagcgctggg ccgtgcggcg 240
gaatggctgg gtgcggaagc agcggaagca gatatcctgg ttcgccgtct gggcatggaa 300
aaagtgtgcc gtcgtgactt cgaggctctg ggcgctgaag ccaaagacat gctgcgtgct 360
tatgttgcgg gtgttaacgc atttctggca tctggtgcgc cgctgccaat tgaatacggt 420
ctgctgggcg ccgaaccgga gccgtgggaa ccgtggcact ccatcgcggt aatgcgtcgc 480
ctgggtctgc tgatgggcag cgtgtggttt aaactgtggc gtatgctggc gctgccggtg 540
gtgggcgcgg cgaacgcgct gaaactgcgt tatgatgatg gcggccagga tctgctgtgc 600
atcccgccgg gcgtggaagc ggaacgtctg gaagcggatc tggcggcgct gcgtccggcg 660
gtggatgcgc tgctgaaagc gatgggtggt gacgcatccg atgctgcagg tggcggttct 720
aacaactggg cggttgcccc gggtcgtacc gcgactggtc gcccgatcct ggctggcgac 780
ccgcatcgtg tgtttgaaat cccgggcatg tatgcgcagc atcatctggc gtgcgatcgt 840
tttgatatga tcggcctgac cgtgccgggc gtgccgggct ttccgcattt tgcgcataac 900
ggcaaagtgg cgtattgcgt gacccatgcg tttatggata ttcatgatct gtatctggaa 960
cagtttgcgg aagatggccg taccgcgcgt tttggcaacg aatttgaacc ggtggcttgg 1020
cgtcgtgatc gtatcgcggt gcgtggcggc gcggatcgtg aatttgatat cgtggaaacc 1080
cgtcatggcc cggtgatcgc gggcgatccg ctggaaggcg cggcgctgac cctgcgtagc 1140
gtgcagtttg cggaaaccga tctgagcttt gattgcctga cccgtatgcc gggcgcgagc 1200
accgtggcgc agctgtatga tgcgacccgt ggctggggcc tgattgatca taacctggtt 1260
gccggcgatg tggcaggttc cattggtcat ctggtacgtg cgcgcgttcc gagccgtccg 1320
cgtgaaaacg gttggctgcc ggtaccgggc tggtccggtg aacacgaatg gcgcggctgg 1380
atcccacacg aagcgatgcc gcgtgttatc gacccgccag gtggtctgat tgttaccgca 1440
aacaaccgtg tggtggctga tgatcacccg gactatctgt gtaccgactg ccatccgccg 1500
taccgtgcag aacgtatcat ggaacgtctg gtagcgagcc cagctttcgc ggttgacgac 1560
gcggcagcaa ttcacgcgga tactctgtcc ccgcacgtag gcctgctgcg tgctcgtctg 1620
gaggctctgg gcatccaggg tagcctgccg gcggaggaac tgcgccagac gctgatcgct 1680
tgggatggtc gcatggacgc gggttctcag gcggcttctg cctacaacgc tttccgccgt 1740
gctctgaccc gtctggtaac cgcccgctct ggtctggagc aggcaatcgc ccacccgttt 1800
gccgctgtgc cgcctggcgt ctctccgcaa ggccaggttt ggtgggcggt tcctactctg 1860
ctgcgtaatg acgatgcggg tatgctgaaa ggctggtctt gggacgaagc tctgtctgaa 1920
gcactgtccg tggcaaccca gaacctgacc ggccgtggct ggggcgaaga acatcgtccg 1980
cgttttaccc atccgctgag cgcgcagttt ccggcgtggg cgggtctgct gaacccggtg 2040
agccgtccga tcggcggcga tggcgatacc gtgctagcga acggcctggt gccgagcgcg 2100
ggcccggaag cgacttatgg cgcgctgagc cgttatgtgt ttgatgtggg caactgggat 2160
aacagccgtt gggtggtgtt tcatggcgcg agcggccatc cggcgagccc gcattatgcg 2220
gatcagaacg cgccgtggag cgattgcgcg atggtgccga tgctgtatag ctgggatcgt 2280
atcgcggcgg aagcggtgac cagccaggaa ctggtgccgg cgtaa 2325

Claims (6)

1.一种提高头孢菌素C酰化酶表达量的方法，其特征在于，所述方法包含头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因在大肠杆菌中共表达的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，具体步骤如下：
(1)分别扩增头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因；
(2)以步骤1获得的两种基因构建大肠杆菌共表达载体并转化感受态大肠杆菌获得重组菌株；
(3)培养并诱导重组菌株表达头孢菌素C酰化酶；
(4)优化培养条件提高重组菌株表达头孢菌素C酰化酶的酶活。
3.如权利要求1或2中所述的方法，其特征在于，所述大肠杆菌为ptsG基因缺失的大肠杆菌。
4.一种如权利要求2所述方法获得的表达头孢菌素C酰化酶的重组大肠杆菌菌株。
5.头孢菌素C酰化酶基因和透明颤菌血红蛋白基因的共表达在提高头孢菌素C酰化酶表达中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述大肠杆菌为ptsG基因缺失的大肠杆菌。
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US5192678A (en) * 1990-09-10 1993-03-09 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. Cephalosporin c acylase
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