CN111849934A - 粤桑大十n-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶及其应用 - Google Patents

粤桑大十n-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了粤桑大十N‑乙酰‑5羟色胺氧甲基转移酶及其应用，粤桑大十N‑乙酰‑5羟色胺氧甲基转移酶包含3个成员，MaASMT4、MaASMT6和MaASMT20，MaASMT4基因的全长为1077bp，编码507个氨基酸，PI＝5.05、MaASMT6基因的全长为1077bp，编码532个氨基酸，PI＝4.93、MaASMT20基因的全长为1098bp，编码157个氨基酸，PI＝5.26，这些基因运用原核表达系统较高的表达酶的活性，可以有效的合成褪黑素和异构体，这些基因可以通过不同的路径应用到合成褪黑素和异构体的基因工程。

Description

粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体设计粤桑大十N-乙酰色胺氧甲基转移酶，还涉及粤桑大十N-乙酰色胺氧甲基转移酶的应用。
背景技术
褪黑素，学名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种吲哚胺，色氨酸的代谢产物。目前已知它广泛存在于人体、动物体及植物体内，生理作用非常广泛。由于其首先在人体的松果体内被发现，因此又被称为松果体素。随后的研究发现，其广泛存在于人体内的各个部位，含量极少，只有pg(1×10-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍；抗氧化，褪黑素本身及其代谢产物不仅有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强，增强免疫作用，抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病有明显效果等优点。
长期以来褪黑素被认为是动物体内专有的，自从1995年在植物中检测到褪黑素之后，人们陆续在许多高等植物中也发现褪黑素存在。在动物中，褪黑素的生物合成途径已经非常清楚。在植物中褪黑素的合成途径包括3条：(1)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(2)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰色胺氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(3)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将5-羟色胺转化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺转移酶将5-甲氧基-色胺转化成褪黑素。
因此，探寻出产N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶含量高的菌种及相关基因至关重要。粤桑大十中的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶基因未见报道，因此克隆粤桑大十N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶基因并研究其表达活性，用于合成褪黑素和异构体具有很好的应用前景。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT；本发明的目的之二在于提供粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT基因；本发明的目的之三在于提供所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在制备N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT基因在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT的方法；本发明的目的之六在于提供由所述的方法制得的重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT；本发明的目的之七在于提供所述重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在作为N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT，其特征在于：所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT包括ASMT4、ASMT6和ASMT20，所述ASMT4的氨基酸序列如SEQID NO.4所示，所述ASMT6的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述ASMT20的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
优选的，所述ASMT4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ASMT6的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ASMT20的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2、粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT，所述ASMT包括ASMT4基因、ASMT6基因和ASMT20基因，所述ASMT4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ASMT6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ASMT20基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3、所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在制备N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用。
4、所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用。
5、一种制备重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT的方法，所述将如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示的粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT分别连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和SalⅠ、SpeI E和EcoRI、KpnI和EcoRI酶切位点，分别获得重组表达载体Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6和Pcold-tf-ASMT20，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT。
优选的，所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。
优选的，所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。
6、由所述的方法制得的重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT。
7、所述重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在制备N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT及其基因，包含3个成员，分别为ASMT4、ASMT6和ASMT20，将N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT基因的3个成员进行原核表达和酶活性的测定，测得其具有较高的N-乙酰色胺氧甲基转移酶的活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报道的N-乙酰色胺氧甲基转移酶序列有差异。因此，我们认为这是新的N-乙酰色胺氧甲基转移酶基因，其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因表达重组酶，重组酶作为催化剂合成褪黑素或褪黑素异构体，作为抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病候选药物，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因电泳图(A：ASMT4基因；B：ASMT6基因；C：ASMT20基因)。
图2为诱导上清经镍柱纯化后咪唑洗脱SDS-PAGE电泳图(A：ASMT4重组酶；B：Pcold-tf-ASMT6重组酶；C：ASMT20重组酶)。
图3为N-乙酰-5-羟色胺在N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶的催化下生成物经UPLC-MS/MS鉴定的质谱图(A：褪黑素标品；B：褪黑素异构体标品；C：底物在MaASMT4酶催化作用下生成物鉴定图；D：底物在MaASMT6酶催化作用下生成物鉴定图；E：底物在MaASMT20酶催化作用下生成物鉴定图)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、克隆粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因
(1)克隆粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT4
根据Morus.ASMT4 datebase上已报道的Morus.ASMT4 N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因(Morus003479)设计扩增ASMT4的引物。ASMT4上游引物为：5'-ggggtaccatgaaacttgacgaggcaag-3'(SEQ ID NO.1)，ASMT4下游引物为：5'-gactagttcactgtggatatgcctcaa-3'(SEQ ID NO.2)。以粤桑大十的cDNA为模版，SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，PCR扩增ASMT4基因全长，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示。然后回收目的产物与pMD19-T载体连接，转化入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序；测序获得ASMT4的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.4所示。
(2)克隆粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT6
根据Morus.ASMT6 datebase上已报道的Morus.ASMT6 N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因(Morus003483)设计扩增ASMT6的引物，ASMT6上游引物为：5'-gactagtatggaatcaaacgaggcaag-3’(SEQ ID NO.5)，ASMT6下游引物为：5'-cggaattctcactctggataagcctc-3'(SEQ ID NO.6)。以粤桑大十的cDNA为模版，SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6为引物进行PCR扩增，扩增获得ASMT6基因全长，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示。回收目的基因与pMD19-T载体连接，转化入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序；测序获得ASMT6的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.8所示。
(3)克隆粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT20
根据Morus.ASMT20 datebase上已报道的Morus.ASMT20 N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因(Morus025923)设计扩增ASMT20基因的引物。ASMT20基因上游引物为：5'-ggggtaccatggagggaatagatcatcatg-3'(SEQ ID NO.9)，ASMT20基因下游引物为：5'-cggaattcttaaactggataggcctc-3'(SEQ ID NO.10)。以粤桑大十的cDNA为模版，SEQ IDNO.9和SEQ ID NO.10所示序列为引物进行PCR扩增，扩增获得ASMT20基因全长，回收产物与pMD19-T载体连接，转化入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序；测序获得ASMT20的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，其编码的氨基酸如SEQ IDNO.12所示。
实施例2、川桑N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶(ASMT4、ASMT6和ASMT20)基因重组载体构建及原核表达
将实施例1中克隆得到的N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT4、ASMT6和ASMT20基因分别连入Pcold-tf空质粒的KpnⅠ和SpeI、SpeI E和EcoRI、KpnI和EcoRI酶切位点处，分别获得重组载体Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6、Pcold-tf-ASMT20，然后转化入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，送往华大基因公司测序，测序结果与第一次测序得到的序列一致从而获得了正确的序列。
分别提取Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6和Pcold-tf-ASMT20质粒，分别将其转入表达菌株B21(DE3)，在1.5ml的离心管加入450μl含有Amp抗性的LB培养基，按照1：100扩大培养到试管中，28℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.6，取1ml菌液保存了作为诱导前阳性对照，加入IPTG进行诱导，IPTG中浓度为1mM，28℃下诱导8h，诱导后各取1ml菌液保存作为诱导后总蛋白，剩余菌液4℃，5000rpm离心10min收菌，弃上清，菌体用PBS洗两次；超声破碎，超声功率为200W，超声1s，暂停3s，超声总时间15min；4℃，15000×g，20min，取上清于新的离心管中。将之前保存的诱导前和诱导后的菌液10000rpm离心1min沉淀用PBS重悬，加入适量5×Loading buffer。取破碎离心后的上清加入适量5×Loading buffer。将加入的样品沸水浴，之后12000rpm离心2min，吸取上清进行检测目的蛋白的表达情况。
分别将含Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6和Pcold-tf-ASMT20质粒的菌株诱导8小时后，上清进行镍柱纯化，分别用含咪唑浓度为100mM，200mM，250mM，300mM的洗脱液进行洗脱，SDS-PAGE检测其咪唑洗脱浓度，结果为100mM的咪唑可以将大量的目的蛋白洗脱下来(图2)。
实施例3、重组N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶浓度及活性检测
分别取含Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6和Pcold-tf-ASMT20质粒的菌株诱导8小时后，上清经镍柱纯化，后采用UPLC测定酶促反应的产物的物质量来表示酶活力，酶的活力单位定义为每分钟生成1nmol的物质的量为一个比活力即1U诱导诱导菌液摇了8小时之后，5ml上清经纯化后，用10ml咪唑浓度为100mM洗脱，洗脱后，洗脱液里面所含的N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶浓度分为0.1485mg/ml、0.037mg/ml、0.042mg/ml。
以浓度为0.1μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为28℃、pH为8.8条件下以酶活力3.087U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶(ASMT4)反应10min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中C所示，结果显示生成褪黑素总量为76.13nmol(17723ng)。以浓度为2μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为28℃、pH为8.8条件下以酶活力0.162U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶(ASMT4)反应20min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中C所示。结果显示，生成异构体总量为3.24nmol(754.92ng)。
以浓度为0.2μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为55℃、pH为8.8条件下以酶活力2.65U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶反应30min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中D所示。结果如图3中D所示，结果显示，生成褪黑素总量为53.0nmol(12349ng)。以浓度为0.2μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为45℃、pH为6.5条件下以酶活力0452U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶(ASMT6)反应30min，用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中D所示。结果显示，生成异构体总量为9.05nmol(2108.65ng)。
以浓度为0.1μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为55℃、pH为8.8条件下以酶活力1.064U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶(ASMT20)反应20min，用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中E所示。结果显示，生成褪黑素总量为21.29nmol(4960ng)。以浓度为1.0μM的N-乙酰-5-羟色胺为底物，在温度为37℃、pH为8.8条件下酶活力0.985U的N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶(ASMT20)反应30min，用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3中E所示。结果显示，生成异构体总量为19.7nmol(4590.1ng)。
上述结果表明原核表达的重组N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶具有较高的N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶的活性，可以用于在原核构建褪黑素代谢途径的目的基因，也可将获得的重组N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶用于体外合成褪黑素或褪黑素异构体。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtaccat gaaacttgac gaggcaag 28
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gactagttca ctgtggatat gcctcaa 27
<210> 3
<211> 1077
<212> DNA
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 3
atgaaacttg acgaggcaag tctgagaggc caagcagagg tatggaagta catgttcagc 60
ttcgcggatt ccatggccgt gaaatgcgcg gtcgagctcc gaatacccga catcataaac 120
tccaacggcg gcccgatgag tttggctcaa atagtcgccg cctttccaaa ggcttcttct 180
ccagacatct cctgcctctc gcgcatcatg cgcctcctgg tccgccgaaa gatcttcacc 240
gcccgtcaat catcagacgg ctccggagac agcgccactc tttacggcct gacacagtcg 300
tcgaggtggc ttctgcgtga cacgtcggat gatcagctga ctctggcacc gatgctcctg 360
ctagagaacc atccgttgct gatggcgccc tggcactgct tcagccagtg cgtcaaagat 420
ggtgggcttc ccttggagaa ggcccatggg cccgagatat gggacttcgt ggccgggaac 480
ggcgagttca ataagatgtt caatcggggc atggagtgtg cgtcccggat cgtgatgagg 540
gcggtcctgt cggaatacta caaagatgga ttcggttgtt tgggatcgtt gctggacgtt 600
ggaggtggga ccggtggtga cgtggctcag atcgttaaat cctgtccgca catcatcaag 660
ggcatcaact ttgatctgcc agatgtggtc gccgaggcac cggagcatcc gggagtttcc 720
catgtaggag gagacatgtt taagagtgtt ccaaatgctg acgcaatttt catgaagtgg 780
ataatgcacg agtggagcga tgaagattgt gtgaagatct tgaagaattg ccggaaagtg 840
ataccggaga agagcgggaa agttattata gtggacatag ttttggagcc agaaggaact 900
ggagtttttg atgagacagg tttggtgttt gaccttgtta tggttgcaca cacttctggt 960
ggtaaggaga ggactgagaa tgagtggaaa aagatattga atgaaggagg ttttcctcgt 1020
tacaaagtca ccaaaatccc tgccgtaaca tccatcattg aggcatatcc acagtga 1077
<210> 4
<211> 358
<212> PRT
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 4
Met Lys Leu Asp Glu Ala Ser Leu Arg Gly Gln Ala Glu Val Trp Lys
1 5 10 15
Tyr Met Phe Ser Phe Ala Asp Ser Met Ala Val Lys Cys Ala Val Glu
20 25 30
Leu Arg Ile Pro Asp Ile Ile Asn Ser Asn Gly Gly Pro Met Ser Leu
35 40 45
Ala Gln Ile Val Ala Ala Phe Pro Lys Ala Ser Ser Pro Asp Ile Ser
50 55 60
Cys Leu Ser Arg Ile Met Arg Leu Leu Val Arg Arg Lys Ile Phe Thr
65 70 75 80
Ala Arg Gln Ser Ser Asp Gly Ser Gly Asp Ser Ala Thr Leu Tyr Gly
85 90 95
Leu Thr Gln Ser Ser Arg Trp Leu Leu Arg Asp Thr Ser Asp Asp Gln
100 105 110
Leu Thr Leu Ala Pro Met Leu Leu Leu Glu Asn His Pro Leu Leu Met
115 120 125
Ala Pro Trp His Cys Phe Ser Gln Cys Val Lys Asp Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Glu Lys Ala His Gly Pro Glu Ile Trp Asp Phe Val Ala Gly Asn
145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Lys Met Phe Asn Arg Gly Met Glu Cys Ala Ser Arg
165 170 175
Ile Val Met Arg Ala Val Leu Ser Glu Tyr Tyr Lys Asp Gly Phe Gly
180 185 190
Cys Leu Gly Ser Leu Leu Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Gly Asp Val
195 200 205
Ala Gln Ile Val Lys Ser Cys Pro His Ile Ile Lys Gly Ile Asn Phe
210 215 220
Asp Leu Pro Asp Val Val Ala Glu Ala Pro Glu His Pro Gly Val Ser
225 230 235 240
His Val Gly Gly Asp Met Phe Lys Ser Val Pro Asn Ala Asp Ala Ile
245 250 255
Phe Met Lys Trp Ile Met His Glu Trp Ser Asp Glu Asp Cys Val Lys
260 265 270
Ile Leu Lys Asn Cys Arg Lys Val Ile Pro Glu Lys Ser Gly Lys Val
275 280 285
Ile Ile Val Asp Ile Val Leu Glu Pro Glu Gly Thr Gly Val Phe Asp
290 295 300
Glu Thr Gly Leu Val Phe Asp Leu Val Met Val Ala His Thr Ser Gly
305 310 315 320
Gly Lys Glu Arg Thr Glu Asn Glu Trp Lys Lys Ile Leu Asn Glu Gly
325 330 335
Gly Phe Pro Arg Tyr Lys Val Thr Lys Ile Pro Ala Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ile Glu Ala Tyr Pro Gln
355
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggggtaccat ggagggaata gatcatcatg 30
<210> 6
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cggaattctc actctggata agcctc 26
<210> 7
<211> 1077
<212> DNA
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 7
atggaatcaa acgaggcaag tctgagaggc caagcggtga tatggaagta catgttcaac 60
tttgcggatt ccttggcctt gagatgcgct gtggagctca aaattcccga catcatcaac 120
tcccacggcg gcccaatgac tctggcccaa atagcctcct ccattgccac cacttcctct 180
gatccggaca tctcctgcct cgcgcgcatc ttgcgcctcc tggtccgccg aaagatcttc 240
accgcccatc aaccatcgga cggctccgga aacagcacca ttctctacgg cctgacccac 300
tcgtcaaaat ggctcctgcg tgacacgtta gatgatgatc agcttactct ggctcccatt 360
tttctgatgg agacccatcc gtggcttgtg tctccgtggc actgctttag ccgttgcgtc 420
aaggaaggtg ggattgcctt cgagaaggcc catggacgtg agatatggga tttcgcatcc 480
gagaatccag agttcaacaa gctcttcaat gatgggatgg aatgcacggc caggatcatt 540
ctgaaggcga tcttgtcgga gtataaagat gggttcgatt atttggggtc gttggttgac 600
gtgggtggtg ggaccggtgg agccctatct gagatcgtga aatctcatcc gcacatcaag 660
ggaatcaact ttgatcttcc gcatgtcgtc gctacggcac cagcgtaccc cggagtgtcc 720
catgttggag gcgacatgtt tgagactatc ccaaatgccg atgctgtttt catgaagtgg 780
ataatgcatg actggggaga tgaagattgt gtgaagatct tgaaaaattg ccggaaagca 840
ataccagaaa aaagtgggaa agttattata atagatgtag ttttgaaccc cgaaggcaat 900
ggactatttg atgacacggg cttaatattt gaccttgtaa tggttgccca tgcttcaggt 960
ggaaaagaga gaactgagaa tgaatggaag aagatcttga aagaaggagg tttctctcgc 1020
tacaaaatca tcaaaattcc tgccctaaca cccataattg aggcttatcc agagtga 1077
<210> 8
<211> 358
<212> PRT
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 8
Met Glu Ser Asn Glu Ala Ser Leu Arg Gly Gln Ala Val Ile Trp Lys
1 5 10 15
Tyr Met Phe Asn Phe Ala Asp Ser Leu Ala Leu Arg Cys Ala Val Glu
20 25 30
Leu Lys Ile Pro Asp Ile Ile Asn Ser His Gly Gly Pro Met Thr Leu
35 40 45
Ala Gln Ile Ala Ser Ser Ile Ala Thr Thr Ser Ser Asp Pro Asp Ile
50 55 60
Ser Cys Leu Ala Arg Ile Leu Arg Leu Leu Val Arg Arg Lys Ile Phe
65 70 75 80
Thr Ala His Gln Pro Ser Asp Gly Ser Gly Asn Ser Thr Ile Leu Tyr
85 90 95
Gly Leu Thr His Ser Ser Lys Trp Leu Leu Arg Asp Thr Leu Asp Asp
100 105 110
Asp Gln Leu Thr Leu Ala Pro Ile Phe Leu Met Glu Thr His Pro Trp
115 120 125
Leu Val Ser Pro Trp His Cys Phe Ser Arg Cys Val Lys Glu Gly Gly
130 135 140
Ile Ala Phe Glu Lys Ala His Gly Arg Glu Ile Trp Asp Phe Ala Ser
145 150 155 160
Glu Asn Pro Glu Phe Asn Lys Leu Phe Asn Asp Gly Met Glu Cys Thr
165 170 175
Ala Arg Ile Ile Leu Lys Ala Ile Leu Ser Glu Tyr Lys Asp Gly Phe
180 185 190
Asp Tyr Leu Gly Ser Leu Val Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Gly Ala
195 200 205
Leu Ser Glu Ile Val Lys Ser His Pro His Ile Lys Gly Ile Asn Phe
210 215 220
Asp Leu Pro His Val Val Ala Thr Ala Pro Ala Tyr Pro Gly Val Ser
225 230 235 240
His Val Gly Gly Asp Met Phe Glu Thr Ile Pro Asn Ala Asp Ala Val
245 250 255
Phe Met Lys Trp Ile Met His Asp Trp Gly Asp Glu Asp Cys Val Lys
260 265 270
Ile Leu Lys Asn Cys Arg Lys Ala Ile Pro Glu Lys Ser Gly Lys Val
275 280 285
Ile Ile Ile Asp Val Val Leu Asn Pro Glu Gly Asn Gly Leu Phe Asp
290 295 300
Asp Thr Gly Leu Ile Phe Asp Leu Val Met Val Ala His Ala Ser Gly
305 310 315 320
Gly Lys Glu Arg Thr Glu Asn Glu Trp Lys Lys Ile Leu Lys Glu Gly
325 330 335
Gly Phe Ser Arg Tyr Lys Ile Ile Lys Ile Pro Ala Leu Thr Pro Ile
340 345 350
Ile Glu Ala Tyr Pro Glu
355
<210> 9
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cggaattctt aaactggata ggcctc 26
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<211> 1098
<212> DNA
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 11
atggagggaa tagatcatca tgtggacgaa atgcaaagag gccaagcaga catttgggaa 60
gtcatgtaca gccatgtgga ttccttggta ctgaaatgtg ctgtggagct ccgtatagcc 120
gatattattc actcccacgg ttgccccatc actttatccc aaatagcttc ctctatttct 180
ggctcaagct ctccaaacat ccactacctc caacgcattc tgagactgct tgtttgcaag 240
aagatcttca ccgcacatcg cgatgatcac gactcctcaa gtggtgatta tcatcatcag 300
actcgatacg ggttgaccga aaaatcgaga tggataatgt gggagtcaaa gccgagcttg 360
gcacccgtta taatgatgca aaatcgacgg ctgacaattg acgcttttga tcaccttagt 420
gacagcgtca gacacggtgt tgttccgtat aaggcagcct ttggccatga tttcgttgga 480
gaatcaacag tggaccccaa gagcaacaag tggttcaaag atggcatgat caatttggcc 540
aatatggtga tggatccagt cttatcagct ttaaaaaatg agtttagttc catgggatca 600
ttgatcgatg tcggaggttt tacaggtgag actgtttatg agattgtgaa agctcatccg 660
catatcaaag gctttaactt tgatttgcca gatattattg ctatggctcc ttcatacgat 720
ggggtcactc acgtggtagg agacatgttt gaggctattc ccagcgcaga tgccattttt 780
atgaagaagg tgcttaataa ttggactgat gaacaatgca tcaagatttt aagaaattgt 840
cgcaaatcaa taccagagaa gactggcaag gtcattattg tggatatcgt tttggagtca 900
ttggaaagca atgatgttga cttcttatat gatgaaatgc ggatcagatt tgatttgggt 960
ttgatggcac ttcgtggtgt tgcaagggag agaaccgagc ttgagtggaa gaagctgtta 1020
gaggaagcag gcttccctca ctataaaatc atcaagattc cagctatgcc ctcaattatt 1080
gaggcctatc cagtttaa 1098
<210> 12
<211> 358
<212> PRT
<213> 粤桑大十(Morus alba)
<400> 12
Met Lys Leu Asp Glu Ala Ser Leu Arg Gly Gln Ala Glu Val Trp Lys
1 5 10 15
Tyr Met Phe Ser Phe Ala Asp Ser Met Ala Val Lys Cys Ala Val Glu
20 25 30
Leu Arg Ile Pro Asp Ile Ile Asn Ser Asn Gly Gly Pro Met Ser Leu
35 40 45
Ala Gln Ile Val Ala Ala Phe Pro Lys Ala Ser Ser Pro Asp Ile Ser
50 55 60
Cys Leu Ser Arg Ile Met Arg Leu Leu Val Arg Arg Lys Ile Phe Thr
65 70 75 80
Ala Arg Gln Ser Ser Asp Gly Ser Gly Asp Ser Ala Thr Leu Tyr Gly
85 90 95
Leu Thr Gln Ser Ser Arg Trp Leu Leu Arg Asp Thr Ser Asp Asp Gln
100 105 110
Leu Thr Leu Ala Pro Met Leu Leu Leu Glu Asn His Pro Leu Leu Met
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Ala Pro Trp His Cys Phe Ser Gln Cys Val Lys Asp Gly Gly Leu Pro
130 135 140
Leu Glu Lys Ala His Gly Pro Glu Ile Trp Asp Phe Val Ala Gly Asn
145 150 155 160
Gly Glu Phe Asn Lys Met Phe Asn Arg Gly Met Glu Cys Ala Ser Arg
165 170 175
Ile Val Met Arg Ala Val Leu Ser Glu Tyr Tyr Lys Asp Gly Phe Gly
180 185 190
Cys Leu Gly Ser Leu Leu Asp Val Gly Gly Gly Thr Gly Gly Asp Val
195 200 205
Ala Gln Ile Val Lys Ser Cys Pro His Ile Ile Lys Gly Ile Asn Phe
210 215 220
Asp Leu Pro Asp Val Val Ala Glu Ala Pro Glu His Pro Gly Val Ser
225 230 235 240
His Val Gly Gly Asp Met Phe Lys Ser Val Pro Asn Ala Asp Ala Ile
245 250 255
Phe Met Lys Trp Ile Met His Glu Trp Ser Asp Glu Asp Cys Val Lys
260 265 270
Ile Leu Lys Asn Cys Arg Lys Val Ile Pro Glu Lys Ser Gly Lys Val
275 280 285
Ile Ile Val Asp Ile Val Leu Glu Pro Glu Gly Thr Gly Val Phe Asp
290 295 300
Glu Thr Gly Leu Val Phe Asp Leu Val Met Val Ala His Thr Ser Gly
305 310 315 320
Gly Lys Glu Arg Thr Glu Asn Glu Trp Lys Lys Ile Leu Asn Glu Gly
325 330 335
Gly Phe Pro Arg Tyr Lys Val Thr Lys Ile Pro Ala Val Thr Ser Ile
340 345 350
Ile Glu Ala Tyr Pro Gln
355

Claims (10)

1.粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT，其特征在于：所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT包括ASMT4、ASMT6和ASMT20，所述ASMT4的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示，所述ASMT6的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述ASMT20的氨基酸序列如SEQID NO.12所示。
2.根据权利要求1所述的粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT，其特征在于：所述ASMT4的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ASMT6的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ASMT20的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
3.粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT，其特征在于：所述ASMT包括ASMT4基因、ASMT6基因和ASMT20基因，所述ASMT4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述ASMT6基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，所述ASMT20基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示。
4.权利要求1所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在作为N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用。
5.权利要求3所述粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT在宿主细胞中重建褪黑素合成途径中的应用，其特征在于：所述ASMT为催化N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的关键酶基因。
6.一种制备重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT的方法，其特征在于：所述将如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.11所示的粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶基因ASMT分别连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和SalⅠ、SpeI E和EcoRI、KpnI和EcoRI酶切位点，分别获得重组表达载体Pcold-tf-ASMT4、Pcold-tf-ASMT6和Pcold-tf-ASMT20，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT。
7.根据权利要求6所述制备重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT的方法，其特征在于：所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。
8.根据权利要求6所述制备重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT的方法，其特征在于：所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。
9.由权利要求6～8任一项所述的方法制得的重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT。
10.权利要求9所述重组粤桑大十N-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶ASMT在制备N-乙酰-5-羟色胺转化为褪黑素或褪黑素异构体的催化剂中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528411A (zh) * 2021-06-29 2021-10-22 河北维达康生物科技有限公司 生产n-乙酰基-5-甲氧基色胺的基因工程菌、构建方法及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1047974A (zh) * 1989-05-17 1990-12-26 迈克尔·科恩 实现避孕的组合物与方法
US20070225209A1 (en) * 1998-12-22 2007-09-27 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
US20090263368A1 (en) * 2005-10-14 2009-10-22 Institut Pasteur Genetic variations associated with psychiatric disorders
CN108143741A (zh) * 2018-01-04 2018-06-12 中国科学院昆明植物研究所 厚朴酚糖苷在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1047974A (zh) * 1989-05-17 1990-12-26 迈克尔·科恩 实现避孕的组合物与方法
US20070225209A1 (en) * 1998-12-22 2007-09-27 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating neurological disorders and diseases
US20090263368A1 (en) * 2005-10-14 2009-10-22 Institut Pasteur Genetic variations associated with psychiatric disorders
CN108143741A (zh) * 2018-01-04 2018-06-12 中国科学院昆明植物研究所 厚朴酚糖苷在制备治疗中枢神经系统疾病药物中的应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BYEON,Y ET AL: "Cloning and functional characterization of the Arabidopsis N-acetylserotonin O-methyltransferase responsible for melatonin synthesis", 《JOURNAL OF PINEAL RESEARCH》 *
WANG, L; ET AL: "Catalytic mechanism of human N-acetylserotonin methyltransferase: a theoretical investigation", 《 MOLECULAR PHYSICS》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113528411A (zh) * 2021-06-29 2021-10-22 河北维达康生物科技有限公司 生产n-乙酰基-5-甲氧基色胺的基因工程菌、构建方法及应用

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