CN111838153A - 一种果蔬青霉病病原菌的生物控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了庚醛用作意大利青霉抑制剂的用途，属于食品保鲜技术领域。本发明还公开了一种意大利青霉抑制剂以及一种果蔬青霉病病原菌的生物控制方法，该方法包括将果蔬用庚醛进行处理的步骤。试验结果表明，庚醛使意大利青霉孢子不能萌发，菌丝生长被抑制，同时增加细胞膜的通透性，促使膜内蛋白质渗出。本发明利用天然植物提取物庚醛作为抗菌剂用于果蔬采后青霉病病原菌意大利青霉的控制，相较于常用的化学防治方法，对人体、环境无害无污染。

Description

一种果蔬青霉病病原菌的生物控制方法
技术领域
本发明属于食品保鲜技术领域，具体涉及一种果蔬青霉病病原菌的生物控制方法。
背景技术
果蔬在人们生活中具有极为重要的作用，不仅含有丰富的维生素、矿物质、微量元素等人体需要的营养素，还含有丰富的纤维素，对人体健康发挥着重要作用。随着经济的发展和人们生活水平的提高，我国果蔬产量和贸易量持续增加。但多数果蔬营养丰富、含水量大，在采后贮运和销售过程中易受到病原真菌的侵染而腐烂变质。其中意大利青霉是引起果蔬采后腐烂变质的重要病原真菌，给生产带来巨大损失。意大利青霉引起的青霉病相较于绿霉病传播速度更快，且更耐低温，病害一旦发生，很难控制，危害更大。因此，果蔬贮藏过程中青霉病的有效控制对于果蔬采后寿命的延长具有重要意义。
目前报道的果蔬采后防腐保鲜的方法主要物理方法、化学方法和生物方法等。化学杀菌剂如抑霉唑、噻菌灵处理是实际生产中常用的控制果蔬采后病害的方法，但长期、大量的使用将会引起抗药性菌株、农药残留、环境污染等诸多问题，寻找安全、高效的病害防控措施是目前生产上亟待解决的问题。
庚醛是一种安全无毒的植物次级代谢产物，可以柠檬、苦橙、玫瑰、风信子等植物中经过蒸馏获得，主要用于用于配制香水香精，也是制药、有机合成及橡胶制品的原料，目前尚未见有关庚醛抑菌的文献报道。本发明首次从众多植物精油单体中发现庚醛对意大利青霉具体良好的抑制效果，进一步评价了庚醛对意大利青霉的体外抑菌效果及对细胞膜完整性的影响，开发一种能够有效抑制意大利青霉的控制方法。
发明内容
为了解决果蔬采后由青霉病引起的腐败变质问题以及使用化学杀菌剂的缺陷，本发明旨在提供一种低毒、安全、高效的抑制果蔬采后病原菌的方法。该方法能有效抑制意大利青霉在体外孢子萌发和菌丝生长并对菌丝细胞膜有很强的损伤作用，具有良好的开发应用前景。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种果蔬采后青霉病病原菌的生物控制方法，该方法主要分为两个方面，对果蔬采后青霉病病原菌的体外抑制效果和对病原菌细胞膜的破坏作用，具体包括如下步骤：
(1)体外抑制作用
将意大利青霉孢悬接种于固体培养基上，在培养皿上盖固定滤纸片并添加庚醛使得最终浓度为0、5、7.5、10、12.5、15μL/L，以不加庚醛为对照组，计算熏蒸处理对青霉病菌孢子萌发的抑制率。
将意大利青霉孢悬接种于固体培养基上，在培养皿上盖固定滤纸片并添加庚醛使得最终浓度为0、2、4、8、16μL/L，以不加庚醛为对照组，测量熏蒸处理0、24、48、72h后菌丝径向生长的菌落直径。
将意大利青霉孢悬接种于50mL液体培养基中，并加入庚醛二甲亚砜溶液使得最终体积浓度为0、5、10、20μL/L，以不加庚醛为空白对照，测定摇床培养0、12、24、36、48h后的菌丝湿重。
(2)细胞膜破坏作用
将意大利青霉孢悬接种于固体培养基上，在培养皿上盖固定滤纸片并添加庚醛使得最终浓度为0、8、16μL/L，以不加庚醛为对照组，培养24h后收集幼嫩菌丝，再测定4h后意大利青霉菌丝膜外电导率和蛋白质泄露的影响。
与现有技术相比，本发明涉及的一种果蔬果实采后青霉病的生物防治方法具有以下优点：
(1)本发明利用天然植物提取物庚醛作为保鲜剂，相较于常用的化学防治方法，对人体、环境无害无污染。该方法的实施有利于抑制因意大利青霉引起的果蔬采后青霉病的发生并减少果蔬采后腐烂变质。
(2)本发明采用庚醛熏蒸和直接接触处理抑制果蔬青霉病病原菌的方法，熏蒸处理能够在较低浓度下抑制意大利青霉孢子萌发和菌丝生长，直接接触处理能够有效抑制意大利青霉菌丝体的聚集形成，两种方式对意大利青霉均有良好的体外控制效果。
附图说明
图1：庚醛对意大利青霉孢子萌发的影响。
图2：庚醛熏蒸处理对意大利青霉菌丝生长的影响。
图3：庚醛直接接触对意大利青霉菌丝生长量的影响。
图4：庚醛对意大利青霉菌丝细胞膜膜外电导率的影响。
图5：庚醛对意大利青霉菌丝细胞膜蛋白质泄露的影响。
具体实施方式
以下结合附图附表和具体实施例进一步阐述本发明。其中的实施例仅用于说明本发明而不限制于本发明的保护范围。
实施例1：孢子萌发测定的实施例
将已灭菌的培养基平铺至载玻片上，均匀涂布20μL浓度为1×106cfu/mL意大利青霉孢子悬浮液。在培养皿盖中央放置一片直径20mm的已灭菌的圆形滤纸片，用移液枪移取庚醛于滤纸片上，使最终浓度分别为0、5、7.5、10、12.5、15μL/L，以未加庚醛作为对照组。迅速密封培养皿于25℃培养箱中培养10h后，在显微镜下观察孢子萌发情况，测量并计算孢子萌发抑制率。每个处理重复3次，每次重复统计3-4个视野，每个视野约30-40个孢子，即每个重复至少统计100个孢子。
结果表明：不同浓度庚醛均能抑制青霉病菌孢子的萌发，且呈现出良好的浓度效应关系，浓度越高抑制率越高，在浓度为15μL/L时，孢子完全不能萌发(图1)。因此，庚醛熏蒸处理能够抑制果蔬青霉病病菌孢子在空气中的产生和萌发，在较早阶段控制阻断意大利青霉的空气传播。
实施例2：菌丝生长测定实施例
(1)200μL孢子悬浮液接种到20mL培养基上，涂布器涂布均匀，26℃倒置培养36h左右至白色幼嫩菌丝均匀可见，用直径9mm的打孔器制备菌饼，将菌饼放于新的培养基中央，在培养皿上盖贴无菌滤纸并滴加庚醛，迅速用封口膜封口，使平板内庚醛浓度为0、2、4、8、16μL/L，以未加庚醛作为对照组。将平板放于25℃条件下培养，并在0、24、48、72h后采用十字交叉法测定意大利青霉的菌落直径。
(2)200μL孢子悬浮液接种到50mL液体培养基，26±2℃，120r/min摇床培养36h以得到幼嫩菌丝，无菌过滤收集后准确称取0.5g湿重菌丝接种于含50mL液体培养基的锥形瓶中，并加入庚醛二甲亚砜溶液使其浓度为0、5、10、20μL/L，不含庚醛的培养基为对照，置于恒温震荡培养箱中培养48h，每隔12h记录一次菌丝湿重。
结果表明：随着培养时间的延长不同浓度处理下的意大利青霉菌落直径呈显著下降趋势，但随着处理浓度的增加，菌落直径随之减小，熏蒸浓度达到16μL/L时菌丝完全不能在固体培养基上生长(图2)。直接接触处理的抑制效果要略差于熏蒸处理，对照组菌丝体随着培养时间的延长生长量均匀增加，而其他3种处理组菌丝体生长量在整个生长过程中均显著低于对照组，其中5、10μL/L处理组的菌丝湿重增长缓慢，20μL/L处理组菌丝量先稍微增加后逐渐减少，说明庚醛直接接触菌丝体后菌丝不能正常聚集生长，逐渐分解至培养液中(图3)。因此，庚醛熏蒸处理或直接接触处理均表现出良好的体外抑菌作用。
实施例3：细胞膜膜外电导率测定实施例
在冷却凝固的20mLPDA培养基上平铺一层已灭菌的玻璃纸，然后接种200μL孢子悬浮液，涂布器涂布均匀，26℃倒置培养18h左右至白色幼嫩菌丝均匀可见，然后再加入0、8、16μL/L庚醛熏蒸处理，继续26℃倒置培养6h得到处理后的菌丝备用。称取0.5g菌丝于50mL洁净离心管中，20mL双蒸水重悬浮，以未经庚醛熏蒸处理的菌丝溶液为对照组，电导率仪测定4h时溶液的电导率。
由图4可知庚醛熏蒸作用条件下意大利青霉膜外溶液电导率随着熏蒸浓度的增大而增大，对照组电导率为37.47Us/cm，而8μL/L处理组为47.90Us/cm，16μL/L处理组为53.67Us/cm。结果表明，庚醛可使细胞膜通透性增加，导致胞内电解质泄漏。
实施例4：细胞膜蛋白质泄露测定实施例
在冷却凝固的20mLPDA培养基上平铺一层已灭菌的玻璃纸，然后接种200μL孢子悬浮液，涂布器涂布均匀，26℃倒置培养18h左右至白色幼嫩菌丝均匀可见，然后再加入0、8、16μL/L庚醛熏蒸处理，继续26℃倒置培养6h得到处理后的菌丝备用。称取0.5g菌丝，重悬浮于20mLPBS中，以未经庚醛熏蒸处理的菌丝溶液为对照组。12000xg离心10min取上清液，用紫外可见分光光度计测定第4h时280nm波长处溶液的吸光值(A280nm)。
由图5可知在8、16μL/L庚醛熏蒸处理的吸光度值均高于未熏蒸处理的对照组，熏蒸浓度越高则吸光度值越大，说明意大利青霉菌丝在经过庚醛熏蒸处理后的细胞膜内蛋白质渗出，破坏了细胞膜的完整性。
综上，庚醛熏蒸处理可以在不同生长阶段有效抑制果蔬青霉病病原菌意大利青霉的体外生长，直接接触处理也能够抑制意大利青霉菌丝体的聚集形成，两种方式对意大利青霉均有良好的体外控制效果，经庚醛熏蒸处理后的菌丝细胞膜完整性受到破坏，膜内离子和蛋白质渗出。

Claims (5)

1.庚醛用作意大利青霉抑制剂的用途。
2.一种意大利青霉抑制剂，其活性成分中含有庚醛。
3.一种果蔬青霉病病原菌的生物控制方法，其特征在于：该方法包括将果蔬用庚醛进行处理的步骤，庚醛使病原菌孢子不能萌发，在较早阶段阻断病原菌的传播，同时抑制菌丝生长，增加细胞膜的通透性，促使膜内蛋白质渗出。
4.如权利要求3所述的果蔬青霉病病原菌的生物控制方法，其特征在于：所述病原菌为为意大利青霉。
5.如权利要求3所述的果蔬青霉病病原菌的生物控制方法，其特征在于：所述处理方法是熏蒸。
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