CN111826381A

CN111826381A - 假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用

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Publication number: CN111826381A
Application number: CN202010287380.7A
Authority: CN
Inventors: 王晶晶; 刘建秀; 宗俊勤; 李丹丹; 郭爱桂; 郭海林; 陈静波; 李建建
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2020-04-13
Filing date: 2020-04-13
Publication date: 2020-10-27
Anticipated expiration: 2040-04-13
Also published as: CN111826381B

Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用，所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明将EoSINAT5基因转入目标植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的根长显著增长，根系数目显著增多。本发明通过转化外源E3泛素连接酶EoSINAT5基因并正常转录表达，从而调控了目标植物的根系生长，获得具有较强生根能力的新种质，对于优良草坪品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。

Description

假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用。

背景技术

假俭草[Eremochloa ophiuroides(Munro.)Hack.]属禾本科黍亚科蜈蚣草属，是该属中唯一可用作草坪草的优良暖季型C4草本植物，也是国内外公认的起源于我国最好的暖季型草坪草。假俭草具有耐瘠薄、病虫害少、养护水平低、观赏性好及坪用价值高等重要特性，又被称之为“懒人草”(Hanna,1995)，已经在美国东南部水土保持和景观建设中广泛应用(Liu et al.2003)。作为本土草种，假俭草具有抗病虫害、耐贫瘠且低养护的特性，且兼具良好的观赏价值和应用价值，非常符合目前国内外草坪产业的发展趋势，是当前我国生态环境建设中的主要草种。由于假俭草种子产量低(150kg/hm2)，种子价格昂贵，且发芽率低，建植成坪的速度较慢，因此生产上常用营养体繁殖方法来建植草坪(Ferrell etal.2001)。假俭草的生根部位在营养体匍匐茎的节，根系生长发育缓慢，且不同节生根所需时间有很大差异(游明鸿等,2002)。在水肥充足的条件下，假俭草仍需要15～20天才能生根，且成活率一般仅为55％左右，这就导致了假俭草早期生长发育迟缓，进而降低了成坪速度；期间的维护需要大量的人力财力，大大增加了假俭草草坪建植的成本(游明鸿等,2002)。

泛素化是真核生物蛋白转录后修饰的重要方式之一，E3泛素连接酶携带底物特异性的信息，决定了靶蛋白的特异性识别，因此泛素化在植物的抗逆和生长发育过程中均发挥着重要的作用。现有研究表明，E3泛素连接酶异常能够影响不定根的生长发育。水稻中的研究表明，OsIAA9能够抑制MHZ2的泛素连接酶活性，当乙烯诱导的生长素激活OsTIR1/AFB2介导的OsIAA9和OsIAA20蛋白降解后，OsIAA26/9/20复合体解离，释放了MHZ2的E3泛素连接酶活性，启动了MHZ2对OsIAA26蛋白的降解，从而导致乙烯对水稻根系生长的抑制(陈辉，2014)。在拟南芥中，E3泛素连接酶AtPUB9能够与拟南芥受体激酶AtARK2相互作用，导致AtPUB9在自噬体中积累；双突变ark2/pub9基因能够抑制自噬，导致磷酸盐饥饿条件下根尖生长素积累的减少，抑制侧根的发育(Deb et al.2014)。因此，E3泛素连接酶与根系发育有着密切的关系。

近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达特定的内源基因以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段，其中农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。本发明将假俭草中具有促进生根功能的E3泛素连接酶EoSINAT5基因构建植物表达载体，用于农杆菌介导的植物遗传转化，可获得具有较强生根能力的新种质，对于优良草坪品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。

参考文献：

Deb,S.,Sankaranarayanan,S.,Wewala,G.,Widdup,E.,&Samuel,M.A.(2014).Thes-domain receptor kinase arabidopsis receptor kinase2 and the u box/armadillorepeat-containing e3 ubiquitin ligase9 module mediates lateral rootdevelopment under phosphate starvation in arabidopsis.Plant Physiology,165(4),1647.

Hanna,W.W.(1995).Centipedegrass—diversity and vulnerability.CropScience,35(2),332-334.Liu,J.,Hanna,W.,&Elsner,E.(2003).Morphological and seedset characteristics of centipedegrass accessions collected in china.EconomicBotany,57(3),380-388.

Ferrell,J.A.,Murphy,T.R.,&Webster,T.M.(2001).Using preemergenceherbicides to improve establishment of centipedegrass(eremochloa ophiuroides)from seed.Weed Technology,20(3),682-687.

游明鸿,刘金平,毛凯,&干友民.(2002).3种生根剂对假俭草插穗成活生根的作用.草业科学,19(7),000051-54.

陈辉.(2014).水稻泛素连接酶MHZ2调控根部乙烯反应和重力反应的机制研究.(Doctoral dissertation,中国科学院大学).

发明内容

本发明的目的在于针对解决定向改良假俭草生根能力弱的问题，提供一个新的E3泛素连接酶基因EoSINAT5，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一目的在于提供一种EoSINAT5基因植物表达载体及其应用。

本发明的又一目的在于构建的植物表达载体可确定EoSINAT5的促进生根的功能，为植物种质改良提供优异的基因。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

假俭草促进生根基因EoSINAT5，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体，该重组植物表达载体为将上述的假俭草促进生根基因EoSINAT5构建入植物表达载体中得到的。具体的，所述的重组植物表达载体为将带有同源重组臂的EoSINAT5基因片段与线性化后的pCAMBIA1305.1表达载体质粒进行重组反应得到的。

上述的假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体的构建方法，该方法包括如下步骤：

(1)假俭草促进生根基因EoSINAT5的克隆：以假俭草‘赣北’的cDNA为模板，设计引物EoSINAT5-F和EoSINAT5-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，测定序列为SEQ ID NO.1；

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′；

(2)重组植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5的构建：以步骤(1)提取的阳性质粒为模板，设计引物1305-EoSINAT5-F和1305-EoSINAT5-R进行PCR反应，在EoSINAT5基因的上下游分别引入同源重组臂，将PCR产物与经Xba I单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，重组植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5构建成功；

上游引物1305-EoSINAT5-F：5′-ggtacccggggatcctctagaATGGCATCAGTTACTTATATTGATGATAGC-3′，

下游引物1305-EoSINAT5-R：5′-tgcctgcaggtcgactctagaCCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′。

含有上述假俭草促进生根基因EoSINAT5的转基因细胞系或重组菌。优选的，该转基因细胞系或重组菌为将上述假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体转入宿主菌中得到。

用于扩增上述假俭草促进生根基因EoSINAT5的引物对，该引物对包括上游引物EoSINAT5-F和下游引物EoSINAT5-R，

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′。

上述的假俭草促进生根基因EoSINAT5或其植物表达载体在促进植物根系生长中的应用。

上述的假俭草促进生根基因EoSINAT5在培育具有较强生根能力的植物新种质中的应用。

上述的重组植物表达载体在培育具有较强生根能力的植物新种质中的应用。

本发明研究表明，将EoSINAT5基因植物表达载体导入拟南芥，促进拟南芥根系生长，确定EoSINAT5的具有促进生根的功能，可用于假俭草种质改良。

上述的EoSINAT5基因及其植物表达载体在调控植物根系生长中的基因工程应用。该应用为采用农杆菌介导法将所述的EoSINAT5基因植物表达载体导入目标植物，促进目标植物根系生长。

所述的目标植物以拟南芥为例，但不限于此。本发明所述的技术方案利用根癌农杆菌介导法，将EoSINAT5基因导入拟南芥，并经过潮霉素筛选抗性植株；经过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行RT-PCR检测验证外源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录，获得生根能力更强的转基因拟南芥植株，并对转基因植株后代进行表型观察，确定假俭草EoSINAT5基因促进植物根系生长的功能。EoSINAT5基因从‘赣北’中克隆得到，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

所述的对阳性转化植株进行RT-PCR检测的过程为：

取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，设计引物，扩增出的片段长为182bp，引物序列为：

上游引物EoSINAT5-RT-F：5′-CAAGCCAAGGGTTCATAATCG-3′(SEQ ID NO.6)，

下游引物EoSINAT5-RT-R：5′-GTCTGTACTGACATTGTGATTCGTG-3′(SEQ ID NO.7)。

分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以EoSINAT5-RT-F和EoSINAT5-RT-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；

以拟南芥AtEF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为76bp，引物序列：

上游引物AtEF1α-F：5′-TGAGCACGCTCTTCTTGCTTTCA-3′(SEQ ID NO.8)，

下游引物AtEF1α-R：5′-GGTGGTGGCATCCATCTTGTTACA-3′(SEQ ID NO.9)。

本发明假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用，具体包括以下详细步骤：

(1)假俭草EoSINAT5基因的克隆

以假俭草‘赣北’根部为材料，提取幼嫩根的总RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物EoSINAT5-F和EoSINAT5-R，结合PCR扩增目的基因的全长序列，

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′(SEQ ID NO.2)，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′(SEQ ID NO.3)；

以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，获得目的基因的序列为SEQ ID NO.1。

(2)植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5的构建

根据EoSINAT5基因全长序列设计引物1305-EoSINAT5-F和1305-EoSINAT5-R，以步骤(1)中提取的阳性质粒为模板，用高保真酶进行PCR反应，在EoSINAT5基因的上游和下游分别引入同源重组臂，

上游引物1305-EoSINAT5-F：

5′-ggtacccggggatcctctagaATGGCATCAGTTACTTATATTGATGATAGC-3′(SEQ IDNO.4)，

下游引物1305-EoSINAT5-R：5′-tgcctgcaggtcgactctagaCCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′(SEQ ID NO.5)；

将PCR产物与经Xba I单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5构建成功，所述的EoSINAT5基因序列为SEQ ID NO.1。

(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)构建的EoSINAT5基因植物表达载体转入拟南芥中，进行培养获得纯合的转基因植株。

制备感受态的农杆菌，将步骤(2)中构建的EoSINAT5基因植物表达载体转入感受态的农杆菌EHA105中，挑选阳性克隆，摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)+500μL/L的Silwet L-77培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染。将盛花期拟南芥已有的果荚剪掉，然后将拟南芥所有花序直接浸泡于农杆菌悬浮液中1分钟。侵染完后用保鲜膜完全包裹植株，放回培养室暗培养24小时，之后去掉保鲜膜正常培养，等种子成熟后收种。

种子消毒与播种：将收到的T0代的种子放入1.5mL离心管中，加入75％酒精1mL，振荡灭菌15min，在超净台中用灭菌的枪头吸出75％酒精，加入1mL无水乙醇，摇匀后将种子吸出打在无菌滤纸上吹干，然后把滤纸对折，轻轻敲击滤纸，将种子均匀撒播到筛选培养基(1/2MS+25mg/L潮霉素)上。筛选培养15天左右，把阳性苗移栽到土中，用保鲜膜覆膜1周左右保湿。

对长大的T1代苗进行PCR鉴定，单株收取阳性T1代苗种子，并继续继代，直到收取T3代种子。将野生型和T3代转基因种子点播在1/2MS固体培养基上进行垂直培养，培养12天后，观察根系生长情况，发现相对于野生型拟南芥，转基因拟南芥根系显著伸长(图4)。

详细操作过程为：

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。

取10μL pCAMBIA1305.1-EoSINAT5载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化拟南芥。

将带有质粒的农杆菌摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)+500μL/L的Silwet L-77培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染。将拟南芥已有的果荚剪掉，然后将拟南芥所有花序直接浸泡于农杆菌悬浮液中1分钟。侵染完后用保鲜膜完全包裹植株，放回培养室暗培养24小时，之后去掉保鲜膜正常培养，等种子成熟后收种。

将收到的T0代的种子放入1.5mL离心管中，加入75％酒精1mL，振荡灭菌15min，在超净台中用灭菌的枪头吸出75％酒精，加入1mL无水乙醇，摇匀后将种子吸出打在无菌滤纸上吹干，然后把滤纸对折，轻轻敲击滤纸，将种子均匀撒播到筛选培养基(1/2MS+25mg/L潮霉素)上。筛选培养15天左右，把阳性苗移栽到土中，用保鲜膜覆膜1周左右保湿。对长大的T1代苗进行PCR鉴定，单株收取阳性T1代苗种子，并继续继代，直到收取T3代种子。将野生型和T3代转基因种子点播在1/2MS固体培养基上进行垂直培养，培养12天后，对转基因植株表型进行观察：

选取4叶龄的野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥(OX-EoSINAT5)作为表型观察的材料，每个株系10株苗。统计每个株系的根长、根数。

本发明从假俭草‘赣北’中克隆EoSINAT5基因；构建EoSINAT5基因植物表达载体；采用农杆菌介导的花粉管通道法将其转入拟南芥中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR鉴定证实EoSINAT5外源基因已经整合到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株单株收种并继代，获得T3代纯合体株系。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的根长显著增长，根系数目显著增多。本发明通过转化外源E3泛素连接酶EoSINAT5基因并正常转录表达，从而调控了拟南芥根系生长，获得具有较强生根能力的新种质，对于优良草坪品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。

本发明所提供的假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用具有如下优点:

本发明提供的方法构建了含有促进生根的EoSINAT5基因的植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5，其中EoSINAT5基因首次报道能够促进根系发育。所构建的载体可导入植物中，提高植物的生根能力。为假俭草草坪建植过程中生根困难的问题提供了有效的解决方法和基因储备。

附图说明

图1 pCAMBIA1305.1-EoSINAT5植物载体构建图

图2为植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5构建过程的琼脂糖凝胶电泳图

M1：Marker 2000；1：EoSINAT5；M2：Marker 15000；

2：pCAMBIA1305.1质粒Xba I单酶切；

3：pCAMBIA1305.1-EoSINAT5表达载体质粒电泳图。

图3转EoSINAT5基因拟南芥特异引物检测电泳图

Col-0：野生型植株；OX-EoSINAT5：转EoSINAT5的拟南芥株系。

图4转EoSINAT5基因拟南芥表型观察

Col-0：野生型植株；OX-EoSINAT5-n：转EoSINAT5的拟南芥株系。标尺＝1cm。

图5转基因拟南芥根长数据统计

Col-0：野生型植株；OX-EoSINAT5-n：转EoSINAT5的拟南芥株系。

图6转基因拟南芥根数数据统计

Col-0：野生型植株；OX-EoSINAT5-n：转EoSINAT5的拟南芥株系。

具体实施方式

下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：

实施例1.EoSINAT5基因的克隆

以假俭草‘赣北’为材料，取根0.15g，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取叶片的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，根据菊花文库中该基因的序列信息，运用primer 5软件设计特异引物扩增EoSINAT5；

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′(SEQ ID NO.2)，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′(SEQ ID NO.3)；

以根的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，EoSINAT5-F、EoSINAT5-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，TaqDNA Polymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.8μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T₄ DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，序列测定为SEQ ID NO.1。

实施例2.植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5的构建

根据EoSINAT5全长基因序列设计引物进行PCR反应，以上述实施例1中阳性质粒为模板，在EoSINAT5基因的上游和下游分别引入同源重组臂，

上游引物1305-EoSINAT5-F：

5′-ggtacccggggatcctctagaATGGCATCAGTTACTTATATTGATGATAGC-3′(SEQ IDNO.4)，下游引物1305-EoSINAT5-R：5′-tgcctgcaggtcgactctagaCCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′(SEQ ID NO.5)；

用高保真酶(PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS PCR Buffer 5.0μL，1305-EoSINAT5-F、1305-EoSINAT5-R引物各1.0μL(20μmol·L^-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L^-1)，PrimeSTAR^TM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH₂O 37.6μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收。

取质粒pCAMBIA1305.1用Xba I单酶切，酶切体系(20μL)：10×RE Buffer 2μL，Acetylated BSA 2μL，质粒pCAMBIA1305.1 10μL，Xba I 1μL，ddH₂O 5μL；37℃反应2h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA1305.1。将PCR产物与经Xba I单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行LR重组反应，反应体系(20μL)：pCAMBIA1305.1线性化载体1μL，EoSINAT5插入片段3μL，5×CE MultiS Buffer 4μL，Exnase MultiS(诺唯赞，

MultiS One Step Cloning Kit)2μL，ddH₂O 10μL；37℃反应30min，降至4℃冷却。取10μL重组产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1305.1-EoSINAT5，电泳和测序验证。植物表达载体pCAMBIA1305.1-EoSINAT5构建成功(图1、图2)。

实施例3.农杆菌EHA105介导花粉管侵染法转化拟南芥

从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl₂(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μLpCAMBIA1305.1-EoSINAT5载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化拟南芥。

采用的农杆菌指包含EoSINAT5基因的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为OX-EoSINAT5-n，将带有质粒的农杆菌摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)+500μL/L的Silwet L-77培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染。将盛花期拟南芥已有的果荚剪掉，然后将拟南芥所有花序直接浸泡于农杆菌悬浮液中1分钟。侵染完后用保鲜膜完全包裹植株，放回培养室暗培养24小时，之后去掉保鲜膜正常培养，等种子成熟后收种。

实施例4.将转EoSINAT5基因抗性植株进行PCR鉴定，获得转基因拟南芥株系

将收到的T0代的种子放入1.5mL离心管中，加入75％酒精1mL，振荡灭菌15min，在超净台中用灭菌的枪头吸出75％酒精，加入1mL无水乙醇，摇匀后将种子吸出打在无菌滤纸上吹干，然后把滤纸对折，轻轻敲击滤纸，将种子均匀撒播到筛选培养基(1/2MS+25mg/L潮霉素)上。筛选培养15天左右，把阳性苗移栽到土中，用保鲜膜覆膜1周左右保湿。对长大的T1代苗进行PCR鉴定：取潮霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将EoSINAT5基因作为检测目标，根据EoSINAT5基因合成检测引物，扩增出的片段长为182bp，引物序列为：

上游引物EoSINAT5-RT-F：5′-CAAGCCAAGGGTTCATAATCG-3′(SEQ ID NO.6)，

下游引物EoSINAT5-RT-R：5′-GTCTGTACTGACATTGTGATTCGTG-3′(SEQ ID NO.7)。

扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图3)。图中可以看到，转EoSINAT5的植株均可扩增出阳性特异扩增带，野生型植株没有扩增出条带。

实施例5.转基因植株后代的表型观察

单株收取阳性T1代苗种子，并继续继代，直到收取T3代种子。将野生型和T3代转基因种子点播在1/2MS固体培养基上进行垂直培养，培养12天后，对转基因植株表型进行观察。选取4叶龄的野生型拟南芥(Col-0)和转基因拟南芥(OX-EoSINAT5)作为表型观察的材料，每个株系10株苗，培养于光照培养箱中。播种12天后，观察转基因株系OX-EoSINAT5-6、OX-EoSINAT5-10和OX-EoSINAT5-12的根系生长(图4)。对转基因株系的根长进行统计发现，相比于野生型植株，转基因株系OX-EoSINAT5-6、OX-EoSINAT5-10、OX-EoSINAT5-12的根长分别为4.00cm、4.88cm、4.43cm，是野生型植株的1.19倍、1.45倍、1.31倍(图5)。对转基因株系的根数进行统计发现，相比于野生型植株，转基因株系OX-EoSINAT5-6、OX-EoSINAT5-10、OX-EoSINAT5-12的根数分别为2.0、5.0、2.4，是野生型植株的2.0倍、5.0倍、2.4倍(图6)。利用SPSS软件进行独立样本T检验发现野生型植株与转基因株系的根长、根数均有显著性差异。

转基因植株表型观察实验表明转基因植株的根系显著增长，根系数目显著增多，说明假俭草中的EoSINAT5基因能够显著促进植物根系生长。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 假俭草促进生根基因EoSINAT5及其植物表达载体和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 906

<212> DNA

<213> ‘赣北’(Eremochloa ophiuroides Munro Hack.)

<400> 1

atggcatcag ttacttatat tgatgatagc catgctgagg ttattgatcc tccaaagaat 60

gaggaaatgc tggatgtcac tgaacttgtt ggcgatcata ttcagcattc accaaaacca 120

aatgtggcaa gctatggcaa cgtgcgtgag ctactggaat gccccgtgtg tttgagtgca 180

atgtatcctc caattcatca gtgctccaac gggcatactc tgtgttctgg atgcaagcca 240

agggttcata atcgctgtcc aacatgcagg catgaactgg gtaacataag atgtcttgct 300

ctagaaaagg tggctgcatc actagagctt ccatgcaagt accagaactt tgggtgcttg 360

ggcatatacc catattattg caagctgaaa cacgaatcac aatgtcagta cagaccatac 420

acttgtccat atgctggatc tgaatgcacg gttgctggtg atattccata tctagtaaat 480

cacttgaaag atgaccataa ggttgacatg cacaatggaa gcaccttcaa tcatcgttat 540

gtaaagtcaa atcctcatga agttgagaat gctacctgga tgctcacggt tttcagctgc 600

ttcggccagt acttctgcct gcacttcgag gccttccagc tgggcatggc gcccgtgtac 660

atcgccttcc tccggttcat gggcgacgac gccgaggcca agaactacag ctacagcctg 720

gaggtcgggg gcagcgggcg caagatgaca tggcagggcg tgcctcggag catcagagac 780

agccaccgga aggtcaggga cagctacgac gggctcatca tccagcgaaa catggccctc 840

ttcttctcgg gaggcgacag gaaggagctc aagctgcggg tcaccgggag gatctggaag 900

gagcgg 906

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggcatcag ttacttatat 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccgctccttc cagatcctcc 20

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtacccggg gatcctctag aatggcatca gttacttata ttgatgatag c 51

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcctgcagg tcgactctag accgctcctt ccagatcctc c 41

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caagccaagg gttcataatc g 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtctgtactg acattgtgat tcgtg 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgagcacgct cttcttgctt tca 23

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggtggtggca tccatcttgt taca 24

Claims

1.假俭草促进生根基因EoSINAT5，该基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体，其特征在于，该重组植物表达载体为将权利要求1所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5构建入植物表达载体中得到的。

3.根据权利要求2所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体，其特征在于，所述的重组植物表达载体为将带有同源重组臂的EoSINAT5基因片段与线性化后的pCAMBIA1305.1表达载体质粒进行重组反应得到的。

4.权利要求2或3所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)假俭草促进生根基因EoSINAT5的克隆：以假俭草的cDNA为模板，设计引物EoSINAT5-F和EoSINAT5-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′；

5.含有权利要求1所述假俭草促进生根基因EoSINAT5的转基因细胞系或重组菌。

6.根据权利要求5所述的转基因细胞系或重组菌，其特征在于，将权利要求2或3所述假俭草促进生根基因EoSINAT5的重组植物表达载体转入宿主菌中得到。

7.用于扩增权利要求1所述假俭草促进生根基因EoSINAT5的引物对，其特征在于，该引物对包括上游引物EoSINAT5-F和下游引物EoSINAT5-R，

上游引物EoSINAT5-F：5′-ATGGCATCAGTTACTTATAT-3′，

下游引物EoSINAT5-R：5′-CCGCTCCTTCCAGATCCTCC-3′。

8.权利要求1所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5在促进植物根系生长中的应用。

9.权利要求1所述的假俭草促进生根基因EoSINAT5在培育具有较强生根能力的植物新种质中的应用。

10.权利要求2所述的重组植物表达载体在培育具有较强生根能力的植物新种质中的应用。