CN117327712A - 一种通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法，包括以下步骤：从假俭草‘赣北’中克隆EoBBR基因；构建EoBBR基因植物抑制表达载体；采用农杆菌介导法将其转入假俭草中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR、荧光定量PCR鉴定证实转基因植株中的EoBBR基因表达量出现了显著下降。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的总根长显著增长，根尖数目显著增多。本发明通过抑制假俭草内源EoBBR基因表达，从而调控了假俭草根系生长，获得了具有较强生根能力的新种质，对于优良草坪品种的培育及在生产中的广泛应用具有重要意义。

Description

一种通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法
技术领域
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法。
背景技术
假俭草[Eremochloa ophiuroides(Munro.)Hack.]属禾本科黍亚科蜈蚣草属，是该属中唯一可用作草坪草的优良暖季型C4草本植物，也是国内外公认的起源于我国最好的暖季型草坪草(Hanna,1995)，目前已经在美国东南部及我国长江中下游地区广泛应用(Liuet al.2003)。作为本土草种，假俭草具有耐贫瘠、病虫害少和养护水平低等特点，非常符合目前国内外草坪产业的发展趋势，可作为我国生态环境建设的主要草种，具有广泛的应用前景。
假俭草的生根部位在营养体匍匐茎的节，根系生长发育缓慢，且不同节位生根能力有很大差异：新生的节生根能力较强，而节位越老越难以生根(Wang et al.,2021)。假俭草早期生根迟缓，进而降低了成坪速度；期间的维护需要大量的人力财力，大大增加了假俭草草坪建植的成本(游明鸿等,2002)，严重影响了假俭草大规模化推广与应用。因此，提高假俭草的生根速度，成为假俭草育种的重要目标之一。
现有研究表明，Barley B recombinant(BBR)基因为转录调控因子，通过特异性的结合到GAGA重复元件上，进而调控下游基因的表达，来参与植物的发育过程(Santi etal.,2003)。近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内调控特定内源基因的表达量来改良植物的发育性状已成为现代育种的重要手段，其中农杆菌介导法是应用最为广泛的方法之一，其中有效的植物表达载体至关重要。因此，通过农杆菌介导法将假俭草的内源基因EoBBR导入假俭草‘赣北’调控其根系生长是一种新的探索，为采用基因工程技术获得具有较强生根能力的新种质提供新颖而实用的方法。
发明内容
本发明的目的在于针对解决定向改良假俭草生根能力弱的问题，提供一种调控假俭草根系生长的基因EoBBR及其应用。
本发明的另一目的在于提供与所述基因EoBBR相关的生物材料及其应用，尤其是提供一种EoBBR基因植物表达载体及其应用。
本发明的又一目的在于提供一种促进假俭草根系生长或提高假俭草成坪速度的方法。技术人员将农杆菌介导遗传转化、转基因植物的分子检测及转基因植株后代表型观察用于本发明，为利用基因工程技术开展假俭草分子育种提供方法和实例。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明请求保护一种调控假俭草根系生长的基因EoBBR，该基因EoBBR的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
第二方面，本发明请求保护与上述基因EoBBR相关的生物材料，该生物材料包括含有所述基因EoBBR的生物材料，或者用于沉默、干扰或抑制所述基因EoBBR的生物材料；
所述的含有所述基因EoBBR的生物材料为如下(a)～(g)中的至少一种：
(a)含有所述基因EoBBR的表达盒；
(b)含有所述基因EoBBR的重组载体；
(c)含有(a)所述表达盒的重组载体；
(d)含有所述基因EoBBR的重组微生物；
(e)含有(a)所述表达盒的重组微生物；
(f)含有(b)所述重组载体的重组微生物；
(g)含有(c)所述重组载体的重组微生物；
所述的用于沉默、干扰或抑制所述基因EoBBR的生物材料为如下(Ⅰ)～(Ⅳ)中的至少一种：
(Ⅰ)核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的EoBBR基因干扰序列；
(Ⅱ)用于扩增(Ⅰ)所述EoBBR基因干扰序列的引物；
(Ⅲ)所述EoBBR基因的植物表达抑制载体；
(Ⅳ)含有如(Ⅲ)所述EoBBR基因的植物表达抑制载体的重组微生物。
进一步，用于扩增上述(Ⅰ)中所述EoBBR基因干扰序列的引物为；
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQID NO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)。
进一步，所述EoBBR基因的植物表达抑制载体采用包含以下步骤的方法构建：
(1)以假俭草的cDNA为模板，设计引物EoBBR-F和EoBBR-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；
(2)以提取的阳性质粒为模板，设计引物RNAi-EoBBR正义链-F和RNAi-EoBBR正义链-R，进行PCR反应，将正义链PCR产物和pFGC5941载体同时用Nco I和Swa I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941质粒和正义链PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒pFGC5941-EoBBR正义链；
(3)以(1)中提取的阳性质粒为模板，设计引物RNAi-EoBBR反义链-F和RNAi-EoBBR反义链-R，进行PCR反应，将反义链PCR产物和pFGC5941-EoBBR正义链质粒同时用BamH I和Xba I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941-EoBBR正义链质粒和反义链PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒，植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR构建成功；
所述的引物序列如下：
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)，
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQID NO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)。
在本发明的具体实施方式中，以假俭草‘赣北’为材料，提取幼嫩根的总RNA，进行反转录获得cDNA。
第三方面，本发明请求保护上述的基因EoBBR，或上述的与基因EoBBR相关的生物材料在调控假俭草根系生长或培育具有强生根能力的假俭草新种质中的应用。
进一步，通过在假俭草中抑制所述基因EoBBR的表达促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度，培育具有强生根能力的假俭草新种质。
更进一步，将上述的EoBBR基因植物表达抑制载体导入假俭草抑制所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度。
第四方面，本发明请求保护一种促进假俭草根系生长或培育具有强生根能力的假俭草新种质的方法，通过在假俭草中抑制所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度，培育具有强生根能力的假俭草新种质。
进一步，将上述的EoBBR基因植物表达抑制载体导入假俭草抑制所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度。
第五方面，本发明请求保护用于扩增上述基因EoBBR的引物对，该引物对如下所示：
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)。
在本发明的具体实施方式中，一种促进假俭草根系生长或培育具有强生根能力的假俭草新种质的方法，具体包括以下详细步骤：
(1)假俭草EoBBR基因的克隆
以假俭草‘赣北’根部为材料，提取总RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物EoBBR-F和EoBBR-R，用于结合PCR扩增目的基因的全长序列，
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)；
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒。获得目的基因的序列为SEQ ID NO.1。
(2)植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR的构建
选取EoBBR基因CDS序列约300bp作为干扰序列(干扰载体一般选择的干扰长度为300bp，然后将干扰片段分别以正方向和反方向两种顺序连接到载体上，也就是正义链和反义链，最后两者可形成茎环结构起到干扰作用)。所述的EoBBR基因干扰序列为SEQ IDNO.10。
以提取的阳性质粒为模板，设计引物RNAi-EoBBR正义链-F、RNAi-EoBBR正义链-R、RNAi-EoBBR反义链-F和RNAi-EoBBR反义链-R，用高保真酶进行PCR反应，在EoBBR基因干扰的上游和下游分别引入Nco I、Swa I和Xba I、BamH I酶切位点；
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQID NO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)；
将正义链PCR产物和pFGC5941载体同时用Nco I和Swa I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941质粒和PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒pFGC5941-EoBBR正义链。将阳性质粒pFGC5941-EoBBR正义链与反义链PCR产物同时用BamH I和Xba I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941-EoBBR正义链质粒和反义链PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒，植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR构建成功。
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)构建的EoBBR基因植物抑制表达载体转入假俭草中，进行培养初步获得抗性植株。
采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的EoBBR基因植物抑制表达载体导入假俭草，经过草胺膦抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR检测、荧光定量PCR检测验证植物抑制表达载体已经转入转基因植株并抑制了EoBBR基因表达；获得生根能力更强的转基因假俭草抗性植株。
具体过程为：制备感受态的农杆菌，将步骤(2)中构建的EoBBR基因植物抑制表达载体转入感受态的农杆菌EHA105中，挑选阳性克隆，摇菌至OD600＝0.3-0.4，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)培养液+100μmol/L的乙酰丁香酮将沉淀等体积悬浮，4℃冰箱放置3小时以上，之后倒入盛有假俭草胚性愈伤组织的灭菌培养瓶中侵染30min，将侵染后的愈伤取出放于无菌干燥滤纸上吹干，接种到共培养培养基上，暗培养3天，然后转入愈伤筛选培养基上筛选2次，之后将存活的愈伤转入分化培养基上培养，等分化出的抗性苗长至2-3cm时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。
假俭草组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa，121℃灭菌20min。
共培养培养基：MS+蔗糖30g/L+甘露醇20g/L+L-pro 0.6g/L+植物凝胶3g/L+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L；
愈伤筛选培养基：MS+蔗糖30g/L+甘露醇20g/L+L-pro 0.6g/L+植物凝胶3g/L+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+特美汀200mg/L+PPT 6mg/L；
分化培养基：MS+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+KT 2.0mg/L+NAA0.1mg/L+特美汀200mg/L；
生根培养基：MS+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+特美汀200mg/L。
更详细操作过程为：
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl2(20％甘油，v/v)溶液中，200μL/管分装，待用。
取10μL pFGC5941-EoBBR载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化假俭草愈伤组织。
将带有质粒的农杆菌摇菌至OD600＝0.3-0.4，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)培养液+100μmol/L的乙酰丁香酮将沉淀等体积悬浮，4℃冰箱放置3小时以上，倒入盛有假俭草胚性愈伤组织的灭菌培养瓶中，摇床设置200rpm，27℃摇晃浸泡30min，使菌液与愈伤组织充分接触。侵染后的愈伤取出放于无菌干燥滤纸上吹干，转入共培养培养基上，27℃暗培养3天。
将共培养后的愈伤用含特美汀(200mg/L)的无菌水清洗3遍，以除去愈伤组织表面的农杆菌菌液，然后放在无菌滤纸上沥干，转入愈伤筛选培养基于27℃暗培养30天。30天后换1次愈伤筛选培养基，再培养30天，总共筛选2次。经过2次筛选后，将存活的愈伤转入分化培养基上，光照培养直到愈伤分化，分化培养基每30天换一次。等分化苗长到2-3cm时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。
将初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量PCR检测，筛选阳性植株，获得EoBBR表达量降低的转基因假俭草株系，并对转基因植株进行表型观察：
选取第一节位的野生型假俭草(WT)和转基因假俭草(RNAi-EoBBR)匍匐茎作为表型观察的材料，每个株系10条匍匐茎。统计每个株系匍匐茎第一节位的根长、根尖数。
所述的对阳性转化植株(抗性植株)进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR检测的具体过程为：
(ⅰ)PCR检测
取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，将Bar基因作为检测目标，根据Bar基因序列设计引物，扩增出的片段长为427bp，引物序列为：
上游引物Bar-F：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′，
下游引物Bar-R：5′-AGAAACCCACGTCATGCCAGT-3′。
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以Bar-F和Bar-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
(ⅱ)荧光定量RT-PCR检测
提取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量PCR扩增体系，每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的Ct值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长度为145bp，引物序列为：
上游引物EoBBR-QF：5′-CACCGCCTCCACTGATTGA-3′(SEQ ID NO.8)，
下游引物EoBBR-QR：5′-CCATCCTCCAGTGGAACAGC-3′(SEQ ID NO.9)。
以假俭草EoActin扩增的基因片段为内标，片段长度为288bp，引物序列：
上游引物EoActin-F：5′-GCACGGAATCGTCAGCAA-3′，
下游引物EoActin-R：5′-CCCTCGTAGATGGGGACAGT-3′。
本发明所述的技术方案利用根癌农杆菌介导法，将EoBBR基因的抑制表达载体导入假俭草，并经过草胺膦筛选抗性植株；经过草胺膦抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR检测验证抑制表达载体已经转入转基因植株，并通过荧光定量PCR筛选EoBBR基因表达量下降的转基因植株，之后对转基因植株后代进行表型观察，最终获得根系发育增强的转基因假俭草植株。EoBBR基因从‘赣北’中克隆得到，该基因的序列为SEQ ID NO.1。
本发明所提供的通过转EoBBR基因调控假俭草根系生长的方法具有如下优点:
本发明提供的方法选育了转基因假俭草材料，采用转基因技术，降低了假俭草中的EoBBR基因的表达量，通过表型观察及分析获得了生根能力增强的转基因假俭草株系，并首次验证了EoBBR基因具有调控根系生长的功能。利用本方法可通过降低EoBBR基因表达量促进假俭草根系发育，为假俭草草坪建植过程中生根困难的问题提供了有效的解决方法和基因储备。
附图说明
图1pFGC5941-EoBBR植物载体构建图。
图2为植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR构建过程的琼脂糖凝胶电泳图；
M：Marker 2000；1：EoBBR；2：EoBBR干扰片段；3：EoBBR干扰片段正义链检测；4：EoBBR干扰片段反义链检测。
图3RNAi-EoBBR转基因假俭草特异引物检测电泳图；
M：Marker 2000；WT：野生型植株；RNAi-EoBBR：转RNAi-EoBBR的假俭草株系。图4RNAi-EoBBR转基因假俭草EoBBR基因相对表达量检测；
WT：野生型植株；RNAi-EoBBR-n：RNAi-EoBBR转基因的假俭草株系。
图5RNAi-EoBBR转基因假俭草表型观察；
WT：野生型植株；RNAi-EoBBR-n：RNAi-EoBBR转基因的假俭草株系。标尺＝1cm。图6RNAi-EoBBR转基因假俭草总根长数据统计；
WT：野生型植株；RNAi-EoBBR-n：RNAi-EoBBR转基因的假俭草株系。
图7RNAi-EoBBR转基因假俭草根尖数数据统计；
WT：野生型植株；RNAi-EoBBR-n：RNAi-EoBBR转基因的假俭草株系。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.EoBBR基因的克隆
以假俭草‘赣北’为材料，取根0.15g，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取叶片的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，根据假俭草基因组中该基因的序列信息，运用primer 5软件设计特异引物扩增EoBBR；
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)；
以根的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，EoBBR-F、EoBBR-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1)，Taq DNAPolymerase0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.8μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，基因EoBBR序列测定为SEQ ID NO.1。
实施例2.植物抑制表达载体pMDC83-EoBBR-RNAi的构建
根据EoBBR全长基因序列设计干扰片段引物进行PCR反应，以上述实施例1中阳性质粒为模板，在EoBBR基因干扰的上游和下游分别引入Nco I、Swa I和Xba I、BamH I酶切位点；
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQID NO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQID NO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)；
用高保真酶(PrimeSTARTM HSDNA Polymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS PCR Buffer 5.0μL，RNAi-EoBBR正义链-F和RNAi-EoBBR正义链-R(RNAi-EoBBR反义链-F和RNAi-EoBBR反义链-R)引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix4.0μL(2.5mmol·L-1)，PrimeSTARTM HSDNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O37.6μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸20sec，反应30个循环，72℃延伸10min；干扰片段PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收。
取质粒pFGC5941和干扰片段正义链PCR产物，同时用Nco I和Swa I双酶切，酶切体系(40μL)：10×QuickCut Green Buffer 4μL，质粒pFGC5941(或干扰片段PCR产物)10μL，Nco I 2μL，Swa I 2μL，ddH2O 22μL；37℃反应2h，65℃反应20min，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pFGC5941和干扰片段正义链PCR产物。将Nco I和Swa I双酶切后的干扰片段正义链PCR产物与植物抑制表达载体pFGC5941进行连接反应，反应体系(10μL)：pFGC5941载体1μL，干扰片段正义链PCR产物4μL，Solution I 5μL；16℃反应1h，降至4℃冷却。取10μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pFGC5941-EoBBR正义链，电泳和测序验证。
选择正确的pFGC5941-EoBBR正义链质粒，与干扰片段反义链PCR产物同时用BamHI和Xba I双酶切，酶切体系(40μL)：10×QuickCut Green Buffer 4μL，质粒pFGC5941-EoBBR正义链(或干扰片段反义链PCR产物)10μL，BamH I 2μL，Xba I 2μL，ddH2O 22μL；37℃反应2h，65℃反应20min，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pFGC5941-EoBBR正义链和干扰片段反义链PCR产物。将BamH I和Xba I双酶切后的干扰片段反义链PCR产物与植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR正义链进行连接反应，反应体系(10μL)：pFGC5941-EoBBR正义链载体1μL，干扰片段反义链PCR产物4μL，Solution I 5μL；16℃反应1h，降至4℃冷却。取10μL连接产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pFGC5941-EoBBR，电泳和测序验证。植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR构建成功(图1、图2)。
实施例3.农杆菌EHA105介导愈伤组织侵染法转化假俭草
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。取10μL pFGC5941-EoBBR载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μLYEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于侵染假俭草愈伤组织。
采用的农杆菌指包含EoBBR基因的植物抑制表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为RNAi-EoBBR-n。将带有质粒的农杆菌摇菌至OD600＝0.3-0.4，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)培养液+100μmol/L的乙酰丁香酮将沉淀等体积悬浮，4℃冰箱放置3小时以上，倒入盛有假俭草胚性愈伤组织的灭菌培养瓶中，摇床设置200rpm，27℃摇晃浸泡30min，使菌液与愈伤组织充分接触。侵染后的愈伤取出放于无菌干燥滤纸上吹干，转入共培养培养基上，27℃暗培养3天。
将共培养后的愈伤用含特美汀(200mg/L)的无菌水清洗3遍，以除去愈伤组织表面的农杆菌菌液，然后放在无菌滤纸上沥干，转入愈伤筛选培养基于27℃暗培养30天。30天后换1次愈伤筛选培养基，再培养30天，总共筛选2次。经过2次筛选后，将存活的愈伤转入分化培养基上，光照培养直到愈伤分化，分化培养基每30天换一次。等分化苗长到2-3cm时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。
假俭草组织培养基以MS培养基为基础，pH5.8，100Kpa，121℃灭菌20min。共培养培养基：MS+蔗糖30g/L+甘露醇20g/L+L-pro 0.6g/L+植物凝胶3g/L+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+乙酰丁香酮100μmol/L；愈伤筛选培养基：MS+蔗糖30g/L+甘露醇20g/L+L-pro0.6g/L+植物凝胶3g/L+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+特美汀200mg/L+PPT 6mg/L；分化培养基：MS+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+KT 2.0mg/L+NAA0.1mg/L+特美汀200mg/L；生根培养基：MS+蔗糖30g/L+植物凝胶3g/L+特美汀200mg/L。
实施例4.将RNAi-EoBBR转基因抗性植株进行分子检测(PCR、荧光定量PCR)鉴定，获得转基因假俭草株系
(1)PCR检测
取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株嫩叶及未转化植株嫩叶，提取基因组DNA，将Bar基因作为检测目标，根据Bar基因序列设计引物，扩增出的片段长为427bp，引物序列为：
上游引物Bar-F：5′-TGCACCATCGTCAACCACTACAT-3′，
下游引物Bar-R：5′-AGAAACCCACGTCATGCCAGT-3′。
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以Bar-F和Bar-R为引物，进行PCR检测，扩增体系为：1μL DNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，1.5μL 2.5mmol/LMgCl2，0.2μL rTaq酶，Bar-F和Bar-R引物各1μL，ddH2O补足体积至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火30sec，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图3)。图中可以看到，RNAi-EoBBR转基因植株均可扩增出Bar基因的特异性条带，而野生型植株则没有扩增出条带。
(2)荧光定量RT-PCR检测
提取潮霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量PCR对EoBBR基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(Green Real time PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件为：95℃1min，95℃15sec，60℃15sec，72℃45sec，40个循环。每个样品重复3次，根据数据分析得到各个样品的Ct值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长度为145bp，引物序列为：
上游引物EoBBR-QF：5′-CACCGCCTCCACTGATTGA-3′(SEQ ID NO.8)，
下游引物EoBBR-QR：5′-CCATCCTCCAGTGGAACAGC-3′(SEQ ID NO.9)。
以假俭草EoActin扩增的基因片段为内标，片段长度为288bp，引物序列：
上游引物EoActin-F：5′-GCACGGAATCGTCAGCAA-3′，
下游引物EoActin-R：5′-CCCTCGTAGATGGGGACAGT-3′。
荧光定量PCR检测结果显示，与野生型相比，RNAi-EoBBR转基因植株株系的EoBBR基因表达量均显著下降(图4)。
实施例5.转基因植株后代的表型观察
选取野生型假俭草(WT)和转基因假俭草(RNAi-EoBBR)匍匐茎的第一节位作为表型观察的材料，每个株系10条匍匐茎，置于光照培养箱30℃水培5天后，观察到转基因株系RNAi-EoBBR-6、RNAi-EoBBR-25和RNAi-EoBBR-30的根系生长明显强于野生型植株(图5)。对转基因株系的总根长进行统计发现，相比于野生型植株，转基因株系OX-EoSINAT5-6、RNAi-EoBBR-6、RNAi-EoBBR-25和RNAi-EoBBR-30的总根长分别为4.86cm、4.38cm、6.39cm，是野生型植株的3.92倍、3.54倍、5.16倍(图6)。对转基因株系的根尖数进行统计发现，相比于野生型植株，转基因株系RNAi-EoBBR-6、RNAi-EoBBR-25和RNAi-EoBBR-30的根尖数分别为23.67、17.5、38.92，是野生型植株的4.58倍、3.39倍、7.53倍(图7)。利用SPSS软件进行独立样本T检验发现野生型植株与转基因株系的总根长、根尖数均有显著性差异。
转基因植株表型观察实验表明转基因植株的根系显著增长，根系数目显著增多，说明假俭草中的EoBBR基因对假俭草根系生长具有明显的调控作用。

Claims (10)

1.一种调控假俭草根系生长的基因EoBBR，其特征在于，该基因EoBBR的核苷酸序列为如下(1)或(2)：
(1)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
(2)与(1)所述的核苷酸序列具有90％以上的同源性且具有同等功能的核苷酸序列。
2.与权利要求1所述基因EoBBR相关的生物材料，其特征在于，该生物材料包括含有所述基因EoBBR的生物材料，或者用于沉默、干扰或抑制所述基因EoBBR的生物材料；
所述的含有所述基因EoBBR的生物材料为如下(a)～(g)中的至少一种：
(a)含有所述基因EoBBR的表达盒；
(b)含有所述基因EoBBR的重组载体；
(c)含有(a)所述表达盒的重组载体；
(d)含有所述基因EoBBR的重组微生物；
(e)含有(a)所述表达盒的重组微生物；
(f)含有(b)所述重组载体的重组微生物；
(g)含有(c)所述重组载体的重组微生物；
所述的用于沉默、干扰或抑制所述基因EoBBR的生物材料为如下(Ⅰ)～(Ⅳ)中的至少一种：
(Ⅰ)核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的EoBBR基因干扰序列；
(Ⅱ)用于扩增(Ⅰ)所述EoBBR基因干扰序列的引物；
(Ⅲ)所述EoBBR基因的植物表达抑制载体；
(Ⅳ)含有如(Ⅲ)所述EoBBR基因的植物表达抑制载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，用于扩增(Ⅰ)中所述EoBBR基因干扰序列的引物为；
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQ IDNO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQ IDNO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)。
4.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于，所述EoBBR基因的植物表达抑制载体采用包含以下步骤的方法构建：
(1)以假俭草的cDNA为模板，设计引物EoBBR-F和EoBBR-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；
(2)以提取的阳性质粒为模板，设计引物RNAi-EoBBR正义链-F和RNAi-EoBBR正义链-R，进行PCR反应，将正义链PCR产物和pFGC5941载体同时用Nco I和Swa I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941质粒和正义链PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒pFGC5941-EoBBR正义链；
(3)以(1)中提取的阳性质粒为模板，设计引物RNAi-EoBBR反义链-F和RNAi-EoBBR反义链-R，进行PCR反应，将反义链PCR产物和pFGC5941-EoBBR正义链质粒同时用BamH I和Xba I双酶切，酶切完成后分别切胶回收pFGC5941-EoBBR正义链质粒和反义链PCR酶切产物并连接，转化，提取阳性质粒，植物抑制表达载体pFGC5941-EoBBR构建成功；
所述的引物序列如下：
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)，
上游引物RNAi-EoBBR正义链-F：5′-catgccatggGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQ IDNO.4)，
下游引物RNAi-EoBBR正义链-R：5′-tccatttaaatTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.5)，
上游引物RNAi-EoBBR反义链-F：5′-gctctagaGCGGACACATTGTGCAGCACCA-3′(SEQ IDNO.6)，
下游引物RNAi-EoBBR反义链-R：5′-cgcggatccTTCGGGGCGCATGCCCATT-3′(SEQ IDNO.7)。
5.权利要求1所述的基因EoBBR，或权利要求2～4中任一所述的与基因EoBBR相关的生物材料在调控假俭草根系生长或培育具有强生根能力的假俭草新种质中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，通过在假俭草中抑制所述基因EoBBR的表达促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度，培育具有强生根能力的假俭草新种质。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将权利要求2或4中所述的EoBBR基因植物表达抑制载体导入假俭草抑制所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度。
8.一种促进假俭草根系生长或培育具有强生根能力的假俭草新种质的方法，其特征在于，通过在假俭草中抑制权利要求1所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度，培育具有强生根能力的假俭草新种质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将权利要求2或4中所述的EoBBR基因植物表达抑制载体导入假俭草抑制所述基因EoBBR的表达，促进假俭草根系生长，提高假俭草成坪速度。
10.用于扩增权利要求1所述基因EoBBR的引物对，其特征在于，该引物对如下所示：
上游引物EoBBR-F：5′-ATGGACGACGACGATGGCAGC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物EoBBR-R：5′-TTACCTGATCGTTACAAACTTA-3′(SEQ ID NO.3)。
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