CN111808873A

CN111808873A - 一种产生长果型番茄果实的方法

Info

Publication number: CN111808873A
Application number: CN202010736795.8A
Authority: CN
Inventors: 吴双; 华兵; 许智晶; 韩晓倩
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-07-28
Filing date: 2020-07-28
Publication date: 2020-10-23

Abstract

本发明提供了一种使番茄由圆果型果实变为长果型果实的方法，属于农业生物技术领域。利用突变体筛选，产生一个长果型果实的突变体pat1，并定位于PAT1。利用CRIPSR/Cas9技术获得PAT1基因编辑植株，当番茄PAT1功能丧失后，番茄由圆形果实变为了长果形果实。利用基因编辑手段、突变体筛选、基因沉默等手段使番茄中PAT1功能丧失，使番茄的果实由圆果形果实变为长果形果实，使番茄的果实变长。该方法在改良果实形状方面具有重要意义，在未来各种作物生物技术改良种具有很大潜力。

Description

一种产生长果型番茄果实的方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种产生长果型番茄果实的方法。

背景技术

果实是高度特化的花器官，是人类和许多动物的食物来源。果实的大小、质量、形状决定了果实的产量、品质及消费习惯。茄科作物作为重要的园艺作物对人类贡献巨大，马铃薯被作为主食食用了上千年，而番茄作为世界范围内的主要蔬菜在日常生活中扮演重要角色。番茄是非常重要的蔬菜作物，也是研究果实发育、成熟和形状的模式植物。果实形状作为番茄的重要外观品质, 直接影响果实的商品价值。随着番茄酱的日益被人类接受、水果番茄逐渐被人类所喜爱，番茄的内在品质及外在品质越来越受到人类的重视。番茄的的果实发育可以分为四个阶段:花发育、细胞分裂阶段、细胞增大阶段、成熟。果实的形状主要由前三个阶段决定。人类在选育合适的果实形状的新品种时，常规育种需要耗费几年的时间。在栽培过程中，为了产生合适形状的果实，种植者通过大量施用激素等手段，在改变果实形状的同时对果实的风味等性状产生了极大的破坏。通过基因工程定点改良植物，从而创造出符合育种目标的果实形状的新品种，是未来农业生物技术的重要发展方向之一。

人们在挑选番茄果实时，首先根据番茄的外在品质进行挑选，形状作为番茄果实重要的外在性状，在育种家的育种目标中是重要的指标。因此，改技术改良番茄果实形状、缩短育种周期等生物技术改良种具有很大潜力。

发明内容

本发明的目的是针对番茄的果实形状的重要性、育种周期长的问题，提供了一种快速获得一个长果型果实番茄的方法。通过基因工程技术、杂交等手段，在番茄中使PAT1功能丧失，使番茄果实由圆果型变为长果型，从而达到改良果实形状的效果。该方法对快速改良果实形状和品质有重要意义。

为实现上述目的，提供以下技术方案：

一个使番茄由圆果型果实变为长果型果实的棕榈酰转移酶，PAT1（Solyc05g012790），其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种含有上述PAT1的突变体。

一个含有上述PAT1的基因编辑载体。

一种含有上述PAT1的基因编辑载体的宿主菌。

一种使番茄由圆果型果实变为长果型果实的方法：通过在番茄中通过敲除等手段使PAT1功能缺失，使番茄果实由圆果型果实变为长果型果实。

一种使番茄由圆果型果实变为长果型果实的方法：通过与pat1突变体杂交使将隐性pat1基因导入到目标品种中，使番茄果实伸长的方法。

本发明使用番茄PAT1，但是PAT1在作物中的直系同源基因功能较保守，因此使用其他高等植物来源的PAT1也涵盖在本发明中。

本发明的有益效果：本发明通过基因工程技术、杂交等手段，在番茄植物中使PAT1功能丧失，促进果实的伸长，对植物的生长发育无明显影响。本发明对利用生物技术、杂交等手段快速获得长果型果实番茄品种具有重要意义。

附图说明

图1 突变体pat1的鉴定

A：pat1突变体的果实的表型；

B：pat1突变体的果实的表型数据统计；

C：pat1突变体的BSA结果；

D： pat1突变体与WT的突变位点的桑格测序验证；

其中WT为对照组野生型亲本番茄植株；pat1为pat1突变体。

图2 CR-PAT1植株的表型

A：WT、CR-PAT1和OE-PAT1（pat1）植株的果实表型；

B：WT及CR-PAT1植株的果实形状的数据比较。

C：CR-PAT1的基因编辑植株测序结果；

其中WT为对照组野生型亲本番茄植株；pat1为pat1突变体；OE-PAT1为超量表达PAT1转基因植株；CR-PAT1为PAT1基因功能丧失的番茄植株。

具体实施方式

实施例一：筛选并克隆影响果实形状基因PAT1

pat1突变体的鉴定。对EMS突变体库进行筛选，鉴定到一个稳定遗传的长果型突变体。以长果突变体为母本，以MT为父本，将长果突变体与MT杂交。通过观察F1代表型，发现F1为MT表型，所以突变基因为隐性突变。将F1扩繁，获得大量F2后代。将超过200株的F2植株种植下去，通过表型筛选，获得了一批突变体表型的F2代和MT表型的F2代。从中挑选超过30株的突变体类似表型的单株和超过30株的MT类似表型的单株，利用改良CTAB法提取单株DNA。每个单株的DNA吸取2μg，将两种表型的单株DNA混在一起用于高通量测序。将混的两个池用HiseqXten- PE150 (Novogene)进行测序，测序深度大于30个番茄的基因组。测序后，将序列拼接并与番茄的参考基因组进行比对。通过比对，发现突变频率为1的SNP，通过分析SNP的位置确定候选基因Solyc05g012790。经过桑格测序确定了高通量测序结果。

实例二：建立植物突变体系构建

根据网站http://www.genome.arizona.edu/crispr/CRISPRsearch.html设计了PAT1的靶点，并进一步设计引物SEQ ID NO.2 PAT1(+)：5’-GAATCTAACAGTGTAGTTTG ACTTCCCTATCATCCTCTCCGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’，SEQ ID NO.3 PAT1(-)：5’-GCTATTTCTAGCTCTAAAACAGTGCCAGAAACACAGCAACCAAACTACACTGTTAGATT C-3’。以番茄的cDNA为模板，PCR扩增目的片段，回收目的片段，通过in-fusion反应将回收片段连接到中间载体pTX （Ye J, Wang,X, Hu TX, Zhang FX, Ye, ZB, 2017. An indel in the promoter of ai-activatedmalate transporter9 selected during tomato domestication determines fruitmalate contents and aluminum tolerance. Plant Cell, 29(9): 2249–2268.）上。制备大肠杆菌DH5α感受态，用热激法将连接产物转入DH5α中，在含有终浓度为100mg/L卡那霉素的LB平板上涂布均匀，放在37℃培养箱中过夜。第二天挑取单菌落，在含有终浓度为100mg/L卡那霉素LB液体培养基中，转速为200rpm，温度为37℃活化菌16小时后，提取质粒，PCR验证，阳性质粒送公司测序。将测序正确的克隆进行质粒提取。最终获得质粒pTX-PAT1。

实例三：建立植物基因编辑体系

（1）制备C58农杆菌感受态细胞，将pTX-PAT1载体转入C58农杆菌感受态细胞中，涂布于含有终浓度为100 mg/L卡纳霉素、50 mg/L利福平和15mg/L庆大霉素的LB平板筛选阳性菌落；

（2）番茄种子灭菌后，待发芽后准备转化；

（3）准备携带目的基因的农杆菌，用含有终浓度为100mg/L的壮观霉素、50mg/L利福平和15mg/L庆大霉素的液体LB培养基在 28℃下大批量摇菌，摇至OD₆₀₀=1.2~1.6。将农杆菌2000 r/min离心10 min，收集菌体，用MS溶液重悬农杆菌 (OD₆₀₀=0.8)，获得农杆菌悬液。

（4）以步骤（3）制备好的农杆菌悬液侵染番茄子叶切成的外植体；

（5）室温条件下，分别在诱导愈伤培养基、诱导芽培养基以及生根培养基培养后获得再生番茄植株。

实例四： pat1突变体表型鉴定

之前并未报道PAT1及在其他物种中的关于果型方面的功能，我们通过筛选突变体并获得了pat1突变体(图1C-D)及基因编辑植株，这些PAT1功能丧失的植株的果实形状都由圆形变为了长果形，因此当番茄中PAT1功能丧失后，果实会由圆果型变为长果型，能够有效增加果实的纵横比。

首先对EMS诱变突变体库进行大范围筛选，获得了一个长果突变体，进一步繁殖，发现

突变体可以稳定遗传（图1A）。图中结果表明，pat1突变体的果实长度大于WT植物，但是果实的宽度小于WT植物；pat1突变体的果实的果型指数（纵横比）大于WT（图1B），通过BSA测序及桑格测序，确定了候选基因PAT1（图1C-D）。

实例五：pat1突变体的进一步验证

为了进一步验证突变体是有PAT1功能丧失后引起的，我们进行了回补实验。

按照OMEGA公司的E.Z.N.A.® Plant RNA Kit试剂盒说明书提取番茄RNA。再按照TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(TRANS)说明书将其反转录获得大豆cDNA。在番茄基因组网站（https://solgenomics.net/）查找PAT1的cDNA序列，设计引物：SEQ ID NO.4 PAT1 (+)：5’-CATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATGAGGAAGCATG GATGGCAAC-3’和SEQ ID NO.5 PAT1(-)：5’-TCGCCCTTGCTCACCATGAATTCATGCTTCCTGATGTTAGCCTGG-’3；以番茄cDNA为模板，以引物SEQ ID NO.4 和SEQ ID NO.5 为引物，PCR扩增PAT1的cDNA目的片段，所得目的片段大小为1893 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。回收目的片段，通过BP反应将回收片段连接到中间载体pHELLSGATE8上。制备大肠杆菌DH5α感受态，用热激法将连接产物转入DH5α中，在含有终浓度为100mg/L壮观霉素的LB平板上涂布均匀，放在37℃培养箱中过夜。第二天挑取单菌落，在含有终浓度为100mg/L壮观霉素LB液体培养基中，转速为200rpm，温度为37℃活化菌16小时后，提取质粒，PCR验证，阳性质粒送公司测序，获得检测正确的质粒，最终获得表达载体pHELLSGATE8-PAT1。

（1）制备C58农杆菌感受态细胞，将pHELLSGATE8-PAT1表达载体转入C58农杆菌感受态细胞中，涂布于含有终浓度为100 mg/L壮‎观霉素、50 mg/L利福平和15mg/L庆大霉素的平板筛选阳性菌落；

（2）番茄种子灭菌后，待发芽后准备转化；

（4）以步骤（3）制备好的农杆菌悬液侵染pat1突变体番茄子叶切成的外植体；

（5）分别在诱导芽培养基、诱导苗培养基以及诱导根培养基培养后获得再生番茄植株；

培养基配方如下：

诱导芽培养基配方：

MS盐 PH=5.8

IAA（1 mg / mL） 50μL

玉米素（ZT）（1 mg / mL） 1 mL

卡那（Kan）（100mg / mL） 1000μL

特美汀（300mg / mL） 500μL

诱导苗培养基配方：

MS盐 PH=5.8

玉米素（ZT）（1 mg / mL） 100μL

卡那（Kan）（100mg / mL） 500μL

特美汀（300mg / mL） 500μL

诱导根培养基配方：

MS盐 PH=5.8

IBA（1 mg / mL） 2 mL

卡那（Kan）（100mg / mL） 250μL

头孢（300mg / mL） 600μL

对转化T1代植株进行分析，T1代植株的果实形状由长果型变为了圆果型（图2 A）。

实例六： PAT1基因编辑植株的表型鉴定

为了进一步验证PAT1的功能，我们对CR-PAT1后代进行表型观察。首先我们对后代的基因编辑结果进行验证，发现了PAT1基因编辑植株的PAT1发生了基因编辑（图2 C）。进一步对其果实形状进行观察，图中结果表明，CR-PAT1植株的果实长度大于WT植物，但是果实的宽度小于WT植物；CR-PAT1植株的果实的果型指数（纵横比）大于WT（图2 A, B）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 一种产生长果型番茄果实的方法

<120> 一种产生长果型番茄果实的方法

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1893

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaggaagc atggatggca acttccctat catcctctcc aggtggtagc tgttgctgtg 60

tttctggcac tgggatttgc tttctatgtc ttctttgcac cttttgtggg aaagaaattg 120

tttcagtata ttgtgatggg gctttatact cctcttataa ttagtgcatt tggcttgtat 180

atctggtgcg ctgctgctga tcctgctgat ccaggagttt ttagatccaa gaagtatatt 240

aagaagctag accacgaaaa gcaagttcaa cttaaagaat ctaaattagg gtgcgagacg 300

aattcttcta tacaagatgc taatgctgca tcgattgggg aaaatgcatc tggaaaaagc 360

aacaaaggag ctgaaccagc tgcagatcac aatgaaactg aacagaaaat tacagctact 420

cgtgaacgat ctttctcttc cggattgttg gctctactac cttgtgctct tatcagcaac 480

tgcacaggca gacatgagga gtcttctcag caacagttga gtgaagatgg catgttctac 540

tgcagtttgt gtgaagtaga ggtatttaaa tacagcaagc attgcagagt atgtgacaag 600

tgcgtcgatc agtttgacca tcattgcagg tggataaaca actgtatagg gaaaaggaac 660

tatcgcaagt tctttgcgct catggtttca gccctcctgc tgcttatact tcagtggtca 720

actggaattc ttgtactaat ctgctgcttt atcgagaaga agaaattttc tgcggaaatc 780

acctccaaat taggaagcag tttctccatt gttccttttg ttattgtagt ggctgtctgt 840

accatcttgg ccatgatagc aaccctgcca ctagctcaac ttttcttctt tcacatactt 900

ctcataaaga agggaattag cacctatgac tacatcattg ctctcagaga tcaagagcaa 960

caaggagttg caggtcagca aagtccacaa atgtctactg ttagctccct aactggatta 1020

agcagtgcaa gctccttcaa tactttccat cgagcagcat ggtgcacacc acctcgcctt 1080

tttgttgagg atcagtatga tgtagttcct cctgatacag tatcggtcag ttcacttggg 1140

aaaaggtcaa tggcggatga acctatcaag aaaaagaatc cagctgccgt gaagattagc 1200

ccatggacac tagcacgatt aaatgcggag gatgtttcaa aagctgctgc tgaagcaagg 1260

aaaaaatcga aaattcttca gccagtggtg agaaacaaag aaccttacat tcttgaaaca 1320

aatagcagtt taggaagtag cgggcgtcgc atggtgccta ggcttgataa caatagaagg 1380

agagctagta aacgagttag actccctgca gagttaccct ttgaaaccat gagtaaaatt 1440

cccaatgata tagctcaaaa cagcagaaga cccatgctaa ctgagtcatc aagcagttta 1500

gctccccttc agcttgaagc acggagtgat ttccgaacaa cccgaggact gtccacctca 1560

ggtgttgttg ttgcttcttc acctgagagt agtttggact ctcctgacat tcacccactc 1620

cggatgtcat cctcaggagt tgaagatgct gcacgtcttg taggtcacct atcatctgga 1680

atgactcttc aaaaggatac accattgtct agatcaacta gtgatggata cgaggcatct 1740

ggtggggagg atagtgatcg tgtgcctacc cgaattgtgc aaaggtcaac aaggtggagt 1800

agcattcttt ttggttctga tcaacaagat gatagagtca gaagattgat ggtcccgtct 1860

tcatcaaccc aggctaacat caggaagcat taa 1893

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<212> DNA

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<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgcccttgc tcaccatgaa ttcatgcttc ctgatgttag cctgg 45

Claims

1.一个使番茄产生长果型果实的棕榈酰转移酶基因PAT1，其特征在于：所述棕榈酰转移酶基因PAT1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的一个使番茄产生长果型果实的棕榈酰转移酶基因PAT1，其特征在于，所述基因来源于番茄。

3.一种含有权利要求1所述棕榈酰转移酶基因PAT1的突变体。

4.一个含有权利要求1所述棕榈酰转移酶基因PAT1的基因编辑载体。

5.一种含有权利要求1所述棕榈酰转移酶基因PAT1的基因编辑载体的宿主菌。

6.一种产生长果型番茄果实的方法，其特征在于：通过基因编辑使番茄中的PAT1功能缺失，从而获得长果型果实的番茄。

7.根据权利要求6所述一种产生长果型番茄果实的方法，其特征在于：通过杂交使PAT1功能丧失，使番茄果实由圆果型果实变为长果型果实。

8.如权利要求6-7任一所述方法在改良番茄果实形状，培育适合育种要求的果实形状的育种目标中的应用。