CN111808833B - Cdc42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CDC42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用；其中，一种CDC42蛋白片段的构建的序列，其包括，多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1；cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2；一种CDC42蛋白片段的表达方法，其包括，提取人胰腺癌细胞的总mRNA，反转录获得所述cDNA，经限制性内切酶酶切后与pcDNA3.1(+)真核表达载体在T4连接酶作用下连接，获得重组质粒；将所述重组质粒转染胰腺癌细胞；用异丙肾上腺素激活剂β2‑AR处理，即可。本发明利用多种功能手段分析其对胰腺癌迁移和侵袭的抑制作用。在细胞生物学层面证明了此多肽具有阻断神经递质通路和胰腺癌侵袭的重要抑癌功能。

Description

CDC42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，涉及CDC42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用，具体是明确一段重组多肽构建、生物活性及潜在抑胰腺癌嗜神经侵袭作用。

背景技术

胰腺癌是预后最为不良的恶性肿瘤之一，患者平均生存率生存期约为15-19个月，5年生存率不足5％。在发达国家胰腺癌是发病率第四位的恶性肿瘤，由于生活水平的提高，我国的胰腺癌发病率在过去20年增长了3倍，主要特大城市如北京、上海和杭州等地的胰腺癌发病率与发达国家非常接近。胰腺癌拥有非常独特的恶性侵袭特性，其存在明显的神经递质趋化性和嗜神经侵袭能力。胰腺神经纤维释放的神经递质如去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)和乙酰胆碱(acetylcholine)可特异性引导胰腺癌向神经纤维进行性侵袭，这在胰腺癌的恶性病变及导致患者难以忍受的癌痛过程中扮演关键的角色。因此明确胰腺癌嗜神经侵袭机制并寻找相应的治疗靶点具有重要的意义。

在胰腺癌的嗜神经侵袭过程中，β2前列腺素受体(β2-adrenergic receptor，β2-AR)通路在其中发挥关键功能。β2-AR是肿瘤细胞广泛表达的神经受体之一，其可受去甲肾上腺素和乙酰胆碱活化，进而促进胰腺癌的增殖和侵袭，β2-AR可在肿瘤细胞中活化多种下游促癌通路，包括STAT3、HIF-1α和AKT通路。本发明中，我们发现GTP酶CDC42是胰腺癌中β2-AR重要的下游信号传递蛋白，可在β2-AR活化后被募集并发生活化，进而促进下游信号蛋白的活化及胰腺癌细胞骨架的重塑，进而促进胰腺癌细胞的迁移及侵袭。所以，在此发明中我们利用基因重组技术，构建出阻断CDC42与β2-AR结合的抑制性多肽，并验证其对β2-AR介导的细胞骨架重塑和胰腺癌侵袭的拮抗作用。本发明可为胰腺癌的嗜神经侵袭提供有效的靶向多肽，对于胰腺癌的临床治疗具有非常广阔的应用开发前景。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供CDC42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种CDC42蛋白片段的构建的序列，其包括，多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1；cDNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2。

作为本发明的另一方面，本发明提供一种CDC42蛋白片段的表达方法，其包括，提取人胰腺癌细胞的总mRNA，反转录获得所述cDNA，经限制性内切酶酶切后与pcDNA3.1(+)真核表达载体在T4连接酶作用下连接，获得重组质粒；将所述重组质粒转染胰腺癌细胞；用异丙肾上腺素激活剂β2-AR处理，即可。

作为本发明所述的CDC42蛋白片段的表达方法的优选方案，其中：所述限制性内切酶包括ECOR1、HindIII中的一种或几种。

作为本发明所述的CDC42蛋白片段的表达方法的优选方案，其中：所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3细胞的一种或几种。

作为本发明所述的CDC42蛋白片段的表达方法的优选方案，其中：所述转染，其为将胰腺癌细胞接种入6孔板中，保证细胞融合度为50-60％左右，在接种24小时后，转染CDC42多肽表达载体，转染6～24h。

作为本发明所述的CDC42蛋白片段的表达方法的优选方案，其中：所述异丙肾上腺素激活剂β2-AR的浓度为10μM。

作为本发明所述的CDC42蛋白片段的表达方法的优选方案，其中：所述用异丙肾上腺素激活剂β2-AR处理，处理时间为6～24h。

本发明的有益效果：

本发明利用生物工程技术，将一段多肽对应的cDNA编码序列克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体中。通过PCR和DNA测序分析证明重组克隆构建成功，并将此真核表达载体转染到胰腺癌细胞，通过免疫印迹明确多肽的表达，证明了多肽可在胰腺癌中发货功能。进而利用多种功能手段分析其对胰腺癌迁移和侵袭的抑制作用。在细胞生物学层面证明了此多肽具有阻断神经递质通路和胰腺癌侵袭的重要抑癌功能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为β2-AR募集CDC42调控胰腺癌细胞骨架的重塑；

图2为检测多肽的表达，大小为10KD；

图3为CDC42多肽抑制β2-AR通路诱导的胰腺癌细胞的迁移；

图4为CDC42多肽抑制β2-AR通路诱导的胰腺癌细胞的侵袭。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明是基于胰腺癌的嗜神经侵袭特性和β2-AR神经通路异常活化的特征，通过发明阻断性多肽以进行抗胰腺癌嗜神经特性进行基因治疗，本多肽的特异性核酸序列如下：

本发明的是将此多肽的编码cDNA利用PCR扩增，并连接至pcDNA3.1(+)

真核表达载体中，多肽的氨基酸序列和对应cDNA序列如下：

多肽序列：

对应编码cDNA序列：

第一步，重组多肽的表达载体构建

提取人胰腺癌细胞的总mRNA，并反转录成cDNA，进而利用PCR方法扩增获得目的片段编码序列，经限制性内切酶酶切后与pcDNA3.1(+)真核表达载体在T4连接酶作用下连接，经转化、挑选克隆和质粒提取等步骤后获得重组克隆质粒后，PCR鉴定并测序验证重组克隆的构建成功。

第二步：重组多肽表达载体的转染及表达检测

将克隆成功的重组质粒利用脂质体转染试剂转染至胰腺癌细胞中，转染36小时，收集细胞样品并利用免疫印迹实验分析此重组多肽的表达。

第三步：CDC42多肽抗胰腺癌侵袭功能的检测

细胞学实验

1.免疫荧光实验检测CDC42多肽对β2-AR通路诱导的细胞骨架重塑的抑制作用

将CDC42多肽重组表达载体转染PANC-1胰腺癌细胞，36小时后，利用异丙肾上腺素激活β2-AR，6h后利用罗丹明标记的鬼笔环肽检测细胞骨架的分布变化。

2.细胞划痕实验分析细胞的迁移能力改变

将CDC42多肽重组表达载体转染PANC-1胰腺癌细胞，36小时后，利用异丙肾上腺素激活β2-AR，利用无菌枪头划痕细胞，在划痕结束和培养24h检测细胞迁移能力的改变。

3.Mitrigel侵袭实验明确细胞侵袭能力的改变

将CDC42多肽重组表达载体转染PANC-1胰腺癌细胞，将细胞接种于Mitrogel的小室上层并利用异丙肾上腺素激活β2-AR，刺激结束24h后，取出小室利用结晶紫染色细胞，分析细胞侵袭通过Mitrogel小室的水平变化。

实施例1：β2-AR通过募集活化CDC42促进胰腺癌细胞骨架的重塑

1.β2-AR和CDC42相互作用

培养人胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC-3细胞，分别不以或以10μMβ2-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO)处理细胞，并将处理后的细胞收集后以免疫沉淀裂解液(25mMTris-Cl pH7.5,150mMNaCl,1mM EDTA,1％NP-40)冰上裂解30分钟后，在13 000rpm,4℃条件下离心15分钟，收集上清液以4μg的β2-AR抗体进行免疫沉淀过夜孵育，利用蛋白A+G琼脂糖凝珠沉淀免疫复合物，以免疫沉淀裂解液洗涤4次后加入30μl SDS上样缓冲液，煮沸5分钟后进行免疫印迹检测β2-AR和CDC42的相互作用。结果显示β2-AR在受激动剂激活后可迅速结合CDC42[图1]。

2.β2-AR活化可促进细胞骨架的重构

培养人胰腺癌细胞系PANC-1和BxPC-3细胞，分别不以或以10μMβ2-AR激动剂异丙肾上腺素(ISO)处理细胞。处理结束后，迅速以4％多聚甲醛溶液固定细胞10分钟，进而以含1％Triton X-100的PBS溶液透化细胞20分钟。对细胞染色罗丹明标记的鬼笔环肽15分钟后，以5μg/ml的DAPI染色细胞核5分钟，将细胞以50％甘油的PBS封片，在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的变化[图1],结果表明ISO处理可以促进细胞内F-actin压力纤维明显增加，而F-actin纤维的水平升高与细胞迁移和侵袭能力存在正相关性。

实施例2：CDC42多肽重组DNA的构建和在胰腺癌细胞中的表达检测

1.多肽的真核表达载体构建

将表达此多肽的核酸序列经纯化后取32ul样品加入NEB ECOR1和HindIII限制性核酸内切酶各2ul，以及4ul的10×缓冲液置于37℃水浴箱中进行双酶切12h；同时将1ugpcDNA3.1也置于同样的反应体系中进行双酶切12h。将双酶切好的CDC42片段编码DNA和质粒利用2％琼脂糖凝胶电泳进行分离，然后切下相应的目的条带并利用Qiagen凝胶DNA回收试剂盒回收该片段。然后将回收获得的多肽核酸DNA和质粒DNA以10:1的比例混合后以加入1ul的NEB T4 DNA连接酶，2ul的10×缓冲液并加水补充至20ul反应体系，孵育16℃过夜。将获得的重组质粒转化入DH5α感受态大肠杆菌后，挑取单克隆菌落进行菌液PCR鉴定，将获得的重组质粒测序验证。

2.重组肽的表达鉴定

将鉴定获得序列正确的重组质粒转染入PANC-1细胞，48小时后收集细胞，以RIPA细胞裂解液裂解细胞，免疫印迹结果显示此多肽存在很明显的表达[图2]。

实施例3：多肽抑制胰腺癌细胞迁移能力的证明

1.细胞划痕实验证明CDC42多肽对肿瘤细胞迁移的抑制作用

将PANC-1细胞接种入6孔板中，保证细胞融合度为50-60％左右，在接种24小时后，转染CDC42多肽表达载体，在转染6h后以10μMβ2-AR激动剂ISO处理并将细胞用无菌枪头进行划痕后，拍摄细胞的划痕距离。进而孵育48h，分析细胞在表达CDC42多肽后迁移能力的改变。结果表明CDC42多肽可明显阻断PANC-1细胞的迁移[图3]。

实施例4：多肽抑制胰腺癌细胞侵袭能力的证明

将PANC-1和BxPC-3细胞接种入6孔板中，保证细胞融合度为50-60％左右，在接种24小时后，转染CDC42多肽表达载体，在转染24h后将细胞接种于Matrigel Transwell小室的上层，在下层以ISO处理的条件培养基诱导细胞转移，培养24h后，将小室取下，用0.5％结晶紫染色穿透Matrigel小室的细胞，分析细胞穿透小室能力的变化。结果表明CDC多肽表达后，结晶紫染色得到的侵袭细胞在CDC42多肽处理组明显下降，这表明胰腺癌细胞侵袭穿透含Matrigel小室的能力显著下降，定量分析表明CDC42多肽处理后，PANC-1和BxPC-3细胞的侵袭能力越下降50％，统计存在显著性差异(**,P<0.01)[图4]。

本发明是基于胰腺癌的受神经递质趋化行及嗜神经侵袭的特点以及治疗难点，发明一段抗肿瘤抑制性蛋白多肽以拮抗神经递质通路对胰腺癌的侵袭促进作用，拟在体外证明其抗肿瘤侵袭的活性，并公开这段抗胰腺癌侵袭多肽的蛋白序列及编码核酸序列。在细胞层面研究表明，改抑侵袭多肽具有阻断β2前列腺素受体通路活化CDC42及下游PAK1活性的能力，并阻断胰腺癌细胞的迁移和侵袭。本发明提供临床前活性多肽以进行胰腺癌的抗神经侵袭治疗，在胰腺癌的临床治疗及靶向药物开发具有重要的应用前景。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 南通大学

<120> CDC42蛋白片段的构建及其抗胰腺癌侵袭的活性应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 71

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Asp Pro Ser Thr Ile Glu Lys Leu Ala Lys Asn Lys Gln Lys Pro

1 5 10 15

Ile Thr Pro Glu Thr Ala Glu Lys Leu Ala Arg Asp Leu Lys Ala Val

20 25 30

Lys Tyr Val Glu Cys Ser Ala Leu Thr Gln Lys Gly Leu Lys Asn Val

35 40 45

Phe Asp Glu Ala Ile Leu Ala Ala Leu Glu Pro Pro Glu Pro Lys Lys

50 55 60

Ser Arg Arg Cys Val Leu Leu

65 70

<210> 2

<211> 213

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatgatccaa gcacaatcga aaaattggct aaaaacaagc aaaagccgat tacacccgag 60

acagccgaaa agctcgcgcg ggatcttaaa gcggtcaaat atgtagagtg ctcagcattg 120

acgcagaaag gcttgaaaaa tgttttcgat gaggctatct tggcggcact tgagccgcca 180

gaaccgaaaa aatccaggcg gtgcgttttg cta 213

Claims (8)

1.一种CDC42多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;

2.一种如权利要求1所述的CDC42多肽，其特征在于：编码所述多肽的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种如权利要求1所述的CDC42多肽的表达方法，其特征在于：包括，

提取人胰腺癌细胞的总mRNA，反转录获得所述cDNA，经限制性内切酶酶切后与pcDNA3.1(+)真核表达载体在T4连接酶作用下连接，获得重组质粒；

将所述重组质粒转染胰腺癌细胞；

用异丙肾上腺素激活剂β2-AR处理。

4.如权利要求3所述的一种CDC42多肽的表达方法，其特征在于：所述限制性内切酶包括ECOR1、HindIII。

5.如权利要求3所述的一种CDC42多肽的表达方法，其特征在于：所述胰腺癌细胞包括PANC-1、BxPC-3细胞。

6.如权利要求3所述的一种CDC42多肽的表达方法，其特征在于：所述转染，其为将胰腺癌细胞接种入6孔板中，保证细胞融合度为50-60%，在接种24小时后，转染CDC42多肽表达载体，转染6~24h。

7.如权利要求3所述的一种CDC42多肽的表达方法，其特征在于：所述异丙肾上腺素激活剂β2-AR的浓度为10 μM。

8.如权利要求3所述的一种CDC42多肽的表达方法，其特征在于：所述用异丙肾上腺素激活剂β2-AR处理，处理时间为6~24h。

Images