CN111793031B - 芳香胺类化合物及其在制备ar和brd4双重抑制剂和调控剂中的用途 - Google Patents

芳香胺类化合物及其在制备ar和brd4双重抑制剂和调控剂中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种芳香胺类化合物及其在制备AR和BRD4双重抑制剂和调控剂中的用途。具体提供了式I所示化合物，该化合物对AR和BRD4具有双重抑制作用。本发明化合物不仅能够抑制雄激素受体AR多表达的前列腺癌细胞系LNCaP/AR的增殖，而且对上市的前列腺癌药物(恩杂鲁胺)耐药的前列腺癌细胞系VCaP及22RV1也显示了良好的抑制作用。本发明化合物本身作为能同时识别AR和BRD4双靶点的化合物，能够用作AR/BRD4双重抑制剂，还能用于制备诱导AR/BRD4双靶点降解的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)，在制备治疗AR及BRD4相关疾病的药物中具有良好的应用前景。

Description

芳香胺类化合物及其在制备AR和BRD4双重抑制剂和调控剂中 的用途
技术领域
本发明涉及药物合成领域，具体涉及芳香胺类化合物及其在制备AR和BRD4双重抑制剂及调控剂中的用途。
背景技术
在全球人口不断增长和老龄化的情况下，前列腺癌发病率持续地增长，目前，前列腺癌主要的治疗手段为雄激素剥夺治疗。雄激素受体(androgen receptor,AR)属于核受体家族，是一类配体依赖的转录因子。AR信号通路的异常调节对前列腺癌的发生、发展有重要作用，研究表明去势抵抗型前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)仍然依赖AR的作用。雄激素受体包含918个氨基酸，与其他核受体具有相似的结构和功能，它由三个重要的结构域组成，分别是DNA结合域(DNA binding domain,DBD)、配体结合域(ligand binding domain,LBD)和氮端结合域(N-terminal domain,NTD),DBD和LBD之间通过一个铰链区(Hinge)相连。存在于AR碳端的LBD是AR与配体结合的位点，决定了配体与AR结合的特异性，配体与LBD结合从而激活AR。目前，在AR中已确定了两个转录激活功能区，即NTD结构域中的激活功能区1(activation function 1,AF1)和LBD结构域中高度保守的疏水口袋激活功能区2(AF2)。在2010年以前，以多西紫杉醇为基础的化疗是唯一能延长转移性CRPC患者生存期的治疗方法。从2011年起，FDA陆续批准了三个AR信号通路的抑制剂，分别是于2011和2012批准的用于转移性去势抵抗型前列腺癌的醋酸阿比特龙(AbirateroneAcetate)和恩杂鲁胺(Enzalutamide)，以及2018年刚刚批准用于非转移性CRPC的阿帕鲁胺(Apalutamide)。
尽管第二代AR信号通路的抑制剂阿比特龙和恩杂鲁胺在临床治疗中取得了一些成功，但是临床上已经出现了耐药性。而配体结合区F876L突变就是对恩杂鲁胺产生耐药，使其从拮抗剂转变为激动剂的一种错义突变。此外，AR剪接突变体，尤其是缺少配体结合区的AR-v7突变是介导第二代耐药性产生的重要原因。因此，目前临床上迫切需要新型AR信号通路的抑制剂来治疗CRPC。
BET(bromodomain and extra-terminal domain)是一类表观遗传调节因子，通过BD1和BD2结构域识别DNA上乙酰化的组蛋白来调控基因的表达。BET蛋白家族由BRD2,BRD3,BRD4和BRDT组成，其中除了BRDT只存在于睾丸中，其他三种蛋白亚型在各种组织细胞中广泛表达。研究表明BRD2\3\4直接与AR结合可调控其下游基因的表达，而AR和BD1的这种相互作用能被BET抑制剂所阻断，从而阻断AR介导的基因转录，抑制CRPC肿瘤的生长；研究还发现，这种相互作用对AR-v7阳性且雄激素非依赖的22Rv1肿瘤模型也具有很好的抑制作用。近年来多个BRD蛋白的抑制剂已进入临床研究、用于CRPC的治疗，这些抑制剂包括OTX-105,ZEN003694和GS-5829等，其中GS-5829还可以用于淋巴瘤。
研究还发现，在晚期前列腺癌中，AR的上调增强了溴结构域介导的染色质开放，而且AR过表达的细胞对BET抑制剂更加敏感。此外，有研究表明对恩杂鲁胺耐药的CRPC细胞依然对BET抑制剂(如JQ1)敏感。所以，与单独使用抗雄激素类药物相比，抗AR和BET抑制剂联用能够更好的抑制前列腺癌肿瘤生长。
传统的小分子抑制剂是通过与靶蛋白结合来抑制靶蛋白的功能，但小分子药物的长期使用不可避免的会产生耐药性，而且为了达到所需的效果，小分子化合物需要在细胞内保持一定的浓度，而较高浓度的小分子会因为脱靶而产生不良反应，因此，寻找能够克服这些缺陷的小分子化合物在新药研发中有重要意义。
近年来，蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)作为能够诱导靶蛋白降解的小分子而受到广泛关注。PROTACs作为双功能分子，包括一个能够与靶蛋白(protein of interest，POI)结合的小分子化合物、在其合适位置上引入的连接基团、以及一个能够与E3泛素化酶结合的小分子化合物。PROTACs作为小分子探针可以同时与靶蛋白和E3泛素化酶结合，从而促使靶蛋白泛素化，并被蛋白酶体识别并降解。
在过去10年间，许多与肿瘤相关的目标蛋白(包括AR，ER，BRD4，ERRa，RIPK2等)已经被证实能够基于PROTACs得到调控和降解。并且最新的研究证实了PROTACs的催化性质，表明嵌合体分子浓度低于单一抑制剂所需的浓度即可达到同等的治疗效果。因此，利用PROTACs诱导蛋白降解的新型肿瘤治疗策略能够通过细胞内泛素-蛋白酶体降解系统来调控靶蛋白水平，从而克服传统小分子抑制剂的缺陷。
所以，制备出对AR和BET具有双重抑制效果的抑制剂，在制备双重靶向降解AR和BET的PROTACs以及在治疗恶性肿瘤(特别是前列腺癌)中具有重大的意义。
发明内容：
本发明的目的是提供一种对AR和BET具有双重抑制效果的化合物。
本发明提供了式Ⅰ所示化合物、或其光学异构体、或其溶剂合物、或其药学上可接受的盐、或其前体药物、或其互变异构体、或其内消旋体、或其外消旋体、或其对映异构体、或其非对映异构体、或其混合物形式、或其代谢产物、或其代谢前体、或其同位素替代形式：
Figure BDA0002434197220000031
其中，
环A、B、C各自独立地选自无、取代或未取代的不饱和杂环、取代或未取代的不饱和碳环、取代或未取代的稠环；优选为无、取代或未取代的单环芳环、取代或未取代的单环杂芳环、取代或未取代的稠环；更优选为无、取代或未取代的3～8元单环芳环、取代或未取代的3～8元单环杂芳环、取代或未取代的杂芳环并杂芳环、取代或未取代的苯并芳环、取代或未取代的苯并杂芳环、取代或未取代的苯并饱和碳环、取代或未取代的苯并饱和杂环；环A、B、C不同时为无；
上述A、B、C环上的取代基各自独立地选自氘、卤素、-CN、羟基、硝基、氨基、
Figure BDA0002434197220000032
-L0-OH、-L3-C(O)R7、-L4-CO(O)R8、-L5-(O)COR9、-L6-NHC(O)R10、-L7-C(O)NHR11、-L8-CN、被一个或多个R12取代的烯基、被一个或多个R13取代的炔基、被一个或多个R1取代的烷基、被一个或多个R2取代的烷氧基、被一个或多个R3取代的芳基或杂芳基、被一个或多个R5取代的环烷基、被一个或多个R6取代的杂环基，所述RX、R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13各自独立地选自H、氘、卤素、-CN、羟基、硝基、氨基、烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH，其中L0、L3、L4、L5、L6、L7、L8各自独立地选自无、C1-C8烷基、环烷基；
R4选自氢、氘、卤素、-CN、羟基、硝基、氨基、
Figure BDA0002434197220000033
-L0-OH、-L3-C(O)R7、-L4-CO(O)R8、-L5-(O)COR9、-L6-NHC(O)R10、-L7-C(O)NHR11、被一个或多个R12取代的烯基、被一个或多个R13取代的炔基、被一个或多个R1取代的烷基、被一个或多个R2取代的烷氧基、被一个或多个R3取代的芳基或杂芳基、被一个或多个R5取代的环烷基、被一个或多个R6取代的杂环基，所述RX、R1、R2、R3、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11、R12、R13各自独立地选自H、氘、卤素、-CN、羟基、硝基、氨基、烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH，其中L0、L3、L4、L5、L6、L7各自独立地选自0-8个亚甲基；
或，上述A、B、C环上的取代基、R4中的任意两个基团与其连接的被取代原子一起连接成环。
进一步地，
所述化合物具有如式II所示的结构：
Figure BDA0002434197220000041
B1、B2、B3、B4、B5、B6、A1、A2、A3、A4、A5、A6各自独立地选自CR0或N，R0选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、-L0-OH、
Figure BDA0002434197220000042
-C(O)NHR11、C1～C5烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C5烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元环烷基、取代或未取代的3～6元环烷基，或，环上相邻的两个取代基与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的3～6元杂环；其中，所述3～6元环烷基、3～6元环烷基上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C3烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，所述L0、L1各自独立地选自0-5个亚甲基，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C3烷基；
C环、R4如上所述。
进一步地，
所述化合物具有如式III-A所示的结构：
Figure BDA0002434197220000051
其中，Ra4、Ra6各自独立地选自氢、卤素、取代或未取代的五元不饱和杂环；其中所述五元不饱和杂环上的取代基选自氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基；
R4选自氢、氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
B1选自CH、N；
Rb2选自氘代或未氘代的甲基；
Rb3、Rb6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000052
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元饱和环烷基、取代或未取代的5元不饱和杂环基，或，Rb3、Rb6、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的五元不饱和杂环；其中，所述5元不饱和杂环基、五元不饱和杂环上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述3～6元饱和环烷基上的取代基选自-CN。
进一步地，
所述化合物具有如式III-B所示的结构：
Figure BDA0002434197220000053
Figure BDA0002434197220000061
其中，C环选自
Figure BDA0002434197220000062
Figure BDA0002434197220000063
C3选自O、S或NRc3，Rc2、Rc3、Rc5各自独立地选自氢、卤素、C1～C3烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH，L0选自0-5个亚甲基；B1、B3、B5各自独立地选自CH、N；
Rb0选自氢、卤素、C1～C3烷基或其氘代或卤代物；
R4选自氢、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
A1、A2、A3、A4各自独立地选自N、CRa0，A5为C，A6选自N、CRa6，其中，Ra0、Ra6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000064
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元环烷基、取代或未取代的5元杂环基，或，Ra6、Ra6邻位的取代基、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的5元杂环；其中，所述5元杂环、3～6元环烷基、5元杂环基上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C2烷基；
优选地，上述5元杂环为5元不饱和杂环，5元杂环基为5元不饱和杂环基，杂原子选自N、S、O；上述3～6元环烷基为3～6元饱和环烷基。
进一步地，
所述化合物具有如式III-B1所示的结构：
Figure BDA0002434197220000071
其中，C3选自O、S或NRc3，Rc2、Rc5、Rc3各自独立地选自氢、卤素、C1～C3烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH，L0选自0-5个亚甲基；
B1、B3、B5各自独立地选自CH、N；
Rb2选自氘代或未氘代的甲基；
R4选自氢、氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
A1、A2、A3、A4各自独立地选自N、CRa0，其中，Ra0、Ra6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000072
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元饱和环烷基、取代或未取代的5元不饱和杂环基，或，Ra6、Ra6邻位的取代基、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的五元不饱和杂环；其中，所述5元不饱和杂环基、五元不饱和杂环上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述3～6元饱和环烷基上的取代基选自-CN，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C2烷基。
进一步地，
所述化合物具有如式III-B1a所示的结构：
Figure BDA0002434197220000073
其中，C3选自O或S；
Rc2、Rc5各自独立地选自氢、C1～C3烷基或其氘代或卤代物，优选地，Rc2、Rc5选自甲基；
B1、B3、B5各自独立地选自CH、N；
Rb2选自氘代或未氘代的甲基；
R4选自氢、氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
A1、A2、A3、A4各自独立地选自N、CRa0，其中，Ra0、Ra6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000081
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元饱和环烷基、取代或未取代的5元不饱和杂环基，或，Ra6、Ra6邻位的取代基、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的五元不饱和杂环；其中，所述5元不饱和杂环基、五元不饱和杂环上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述3～6元饱和环烷基上的取代基选自-CN，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C2烷基；
或，所述化合物具有如式III-B1b所示的结构：
Figure BDA0002434197220000082
其中，Rc2、Rc3、Rc5各自独立地选自氢、C1～C3烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH；优选地，Rc3选自氢、C1～C3烷基或其氘代或卤代物、-L0-OH，Rc2、Rc5选自甲基；其中L0选自0-5个亚甲基；
R4选自氢、氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
Rb2选自氘代或未氘代的甲基；
A2选自N或CH；
Ra4、Ra6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000083
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元饱和环烷基、取代或未取代的5元不饱和杂环基，或，Ra6、Ra6邻位的取代基、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的五元不饱和杂环；其中，所述5元不饱和杂环基、五元不饱和杂环上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述3～6元饱和环烷基上的取代基选自-CN，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C2烷基。
进一步地，
所述化合物具有如式III-B2所示的结构：
Figure BDA0002434197220000091
其中，C环选自
Figure BDA0002434197220000092
Rc2、Rc3、Rc5各自独立地选自氢、C1～C3烷基或其氘代或卤代物，优选为氢、甲基；
R4选自氢、氘代或未氘代的C1～C2烷基、-L2-OH，L2选自0-5个亚甲基；
Rb2选自氘代或未氘代的甲基；
Ra4、Ra6各自独立地选自H、-CN、氨基、硝基、卤素、
Figure BDA0002434197220000093
-C(O)NHR11、C1～C3烷基或其氘代或卤代物或氰基取代物、C1～C3烷氧基或其氘代或卤代物或氰基取代物、取代或未取代的3～6元饱和环烷基、取代或未取代的5元不饱和杂环基，或，Ra6、Ra6邻位的取代基、与其连接的被取代原子一起形成取代或未取代的五元不饱和杂环；其中，所述5元不饱和杂环基、五元不饱和杂环上的取代基各自独立地选自-CN、氨基、硝基、卤素、C1～C2烷基或其氘代或卤代物、-L1-OH，L1选自0-2个亚甲基，所述3～6元饱和环烷基上的取代基选自-CN，所述Rx、R11各自独立地选自H、C1～C2烷基。
进一步地，
所述化合物的结构选自：
Figure BDA0002434197220000101
Figure BDA0002434197220000111
Figure BDA0002434197220000121
Figure BDA0002434197220000131
Figure BDA0002434197220000141
Figure BDA0002434197220000151
Figure BDA0002434197220000161
Figure BDA0002434197220000171
实验结果表明，本发明提供的化合物对AR和BRD4具有双重抑制作用。本发明化合物不仅能够抑制雄激素受体AR多表达的前列腺癌细胞系LNCaP/AR的增殖，而且对上市的前列腺癌药物(恩杂鲁胺)耐药的前列腺癌细胞系VCaP及22RV1也显示了良好的抑制作用。本发明化合物本身作为能同时识别AR和BRD4双靶点的化合物，能够用作AR/BRD4双重抑制剂，还能用于制备诱导AR/BRD4双靶点降解的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)，在制备治疗AR及BRD4相关疾病的药物中具有良好的应用前景。
本发明中，“取代”是指分子中的1个、2个或多个氢原子被其它不同的原子或分子所替换，包括该分子中同位原子或异位原子上的1个、2个或多个取代。
本发明中，所述C1～C5烷基是指C1、C2、C3、C4、C5的烷基，即具有1～5个碳原子的直链或支链的烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基等。类似的，C1～C3烷氧基是指C1、C2、C3的烷氧基。
本发明中，“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
本发明中，“盐”是将化合物或其立体异构体，与无机和/或有机酸和/或碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将化合物，或其立体异构体，与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明中，“芳环”指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环，例如苯和萘。所述芳环可以稠合于其它环状结构(包括饱和、不饱和环)，但不能含有杂原子如氮、氧或硫，同时连接母体的点必须在具有共轭的π电子体系的环上的碳原子上；“单环芳环”指具有共轭的π电子体系的全碳单环。
“杂芳环”指包含一个到多个杂原子的具有共轭的π电子体系的单环或稠合多环。含有至少一个选自N、O或S的环杂原子，其余环原子是C，另外具有完全共轭的π电子系统。例如呋喃、吡咯、喹啉、噻吩、吡啶、吡唑、N-烷基吡咯、嘧啶、吡嗪、咪唑、四唑、噻吩并吡啶基等。所述杂芳环可以稠合于芳环、杂环或烷烃环上；“单环杂芳环”指包含一个到多个杂原子的、有共轭的π电子体系的单环。
本发明中，所述“A、B、C环上的取代基、R4中的任意两个基团与其连接的被取代原子一起连接成环”是指在所述A、B、C环上的取代基、R4中任意选择两个基团，这两个基团与其各自相连的被取代原子一起，连接形成另一个环，比如
Figure BDA0002434197220000181
结构中两个取代基Ra4、Ra6与该取代基各自相连的碳原子一起，连接形成以下结构
Figure BDA0002434197220000182
本发明中，“Ra6邻位的取代基”是指与被Ra6取代的原子相邻的、另一原子上的取代基，比如
Figure BDA0002434197220000183
结构中“Ra6邻位的取代基”即指A1或A4上的取代基。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
具体实施方式
本发明所用原料、设备均为已知产品，均为购买市售产品所得。
实施例1合成N-(3-溴-4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基苯胺(化合物31)
Figure BDA0002434197220000191
第一步：
将2-溴-1-氟-4-碘苯(3.0g，10mmol)，咪唑(680mg，10mmol)和碳酸铯(4.9g，15mmol)依次加入到50mL的DMA中，氮气保护下加热至120℃反应过夜，TLC监测反应完全后，自然冷却至室温，用100mL乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗(3*50mL)，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱分离纯化(PE/EA＝4/1)得3.4g化合物1-(2-溴-4-碘苯)-1H-咪唑，收率：95％。
第二步：
(1)合成原料5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺(即化合物31-2)：将(3,5-二甲基异恶唑-4-基)硼酸(16.9g，120mmol)、5-溴-2-甲基苯胺(22.3g，120mmol)溶于240ml1,4-二氧六环，加入80ml水，加入碳酸钾(41.5g，300mmol)，加入四三苯基膦钯(4.16g，3.6mmol)，氩气保护，85℃反应过夜，分去水层，有机层浓缩干，300ml水洗，300ml乙酸乙酯萃取，水层反萃一次，合并有机层，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得13.5g化合物5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺，收率56％。
(2)将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺(606mg，3mmol)，溶于20ml1,4-二氧六环，加入1-(2-溴-4-碘苯)-1H-咪唑(1.06g，3mmol)，加入碳酸铯(2.45g，7.5mmol)，BINAP(93mg，0.15mmol)，醋酸钯(36mg，0.15mmol)，氩气保护，110℃反应过夜。过滤，滤液50ml水洗，50ml乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得790mg化合物N-(3-溴-4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺，收率：62％。
第三步：
将60％氢化钠(40mg，1.0mmol)溶于3ml二甲基亚砜，加入N-(3-溴-4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺(213mg，0.5mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(273mg，2.5mmol)，室温反应1小时，10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得183mg化合物N-(3-溴-4-(1H-咪唑-1-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-N-乙基-2-甲基苯胺，收率：81％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(s,1H),7.43(d,J＝7.8Hz,1H),7.18(dd,J＝7.7,1.8Hz,2H),7.10–7.04(m,2H),7.03(d,J＝1.7Hz,1H),6.80(d,J＝2.7Hz,1H),6.45(dd,J＝8.8,2.7Hz,1H),3.70(q,J＝7.1Hz,2H),2.43(s,3H),2.27(s,3H),2.21(s,3H),1.27(dt,J＝9.7,7.1Hz,3H).LC/MS(ESI+)calcd forC23H23FN4O([M+H]+)m/z:451.1；found 451.1。
实施例2合成5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺(化合物97)
Figure BDA0002434197220000201
第一步：
将60％氢化钠(80mg，2mmol)溶于10ml N,N-二甲基甲酰胺，加入3-(4-溴苯基)-5-甲基-1H-吡唑(236mg，1mmol)，室温搅拌10min，加入2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(182mg，1.1mmol)，室温反应3小时，10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得341mg化合物3-(4-溴苯基)-5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑，收率：93％。
第二步：
将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯胺(202mg，1mmol)，溶于5ml 1,4-二氧六环，加入3-(4-溴苯基)-5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑(341mg，0.93mmol)，加入碳酸铯(650mg，2mmol)，BINAP(62mg，0.1mmol)，醋酸钯(11mg，0.05mmol)，氩气保护，110℃反应过夜。过滤，滤液10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得308mg 5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺，收率：68％。
第三步：
将60％氢化钠(8mg，0.2mmol)溶于3ml N,N-二甲基甲酰胺，加入5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺(49mg，0.1mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(22mg，0.2mmol)，室温反应1小时，5ml水洗，5ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得43mg化合物5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺，收率：84％。
第四步：
将化合物5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1-((2-(三甲基硅基)乙氧基)甲基)-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺(43mg，0.084mmol)溶于2ml二氯甲烷中，加入2ml三氟乙酸。室温下搅拌1个小时。减压浓缩掉反应体系中的二氯甲烷和三氟乙酸，加入5ml二氯甲烷，加入碳酸钾(28mg，0.2mmol)，室温下搅拌半小时。过滤，减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得28mg化合物5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(5-甲基-1H-吡唑-3-)苯基)苯胺，收率：88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.54(m,2H),7.38(dd,J＝8.0,2.4Hz,1H),7.12(m,1H),7.04(d,J＝2.0Hz,1H),6.56(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.24(d,J＝7.2Hz,1H),3.71(q,J＝7.2Hz,2H),2.40(s,3H),2.32(s,3H),2.27(s,3H),2.15(s,3H),1.26(td,J＝7.2,2.0Hz,3H).LC/MS(ESI+)calcd for C24H27N4O([M+H]+)m/z:387.2；found387.2。
实施例3合成4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯基)噻唑-2-胺(化合物98)
Figure BDA0002434197220000211
第一步：
将4-(4-溴苯基)噻唑-2-胺(254mg，1mmol)溶于10ml二氯甲烷，加入邻苯二甲酸酐(140mg，0.96mmol)，加入三乙胺(202mg，2mmo)回流搅拌6小时，10ml 1N盐酸洗，10ml乙酸乙酯萃取，10ml饱和碳酸氢钠洗，10ml饱和食盐水洗。有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得360mg化合物2-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮，收率：94％。
第二步：
将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯胺(202mg，1mmol)，溶于5ml 1,4-二氧六环，加入2-(4-(4-溴苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮(360mg，0.94mmol)，加入碳酸铯(650mg，2mmol)，BINAP(62mg，0.1mmol)，醋酸钯(11mg，0.05mmol)，氩气保护，110℃反应过夜。过滤，滤液10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得261mg 2-(4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)氨基)苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮，收率：55％。
第三步：
将60％氢化钠(8mg，0.2mmol)溶于3ml N,N-二甲基甲酰胺，加入2-(4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)氨基)苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.1mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(22mg，0.2mmol)，室温反应1小时，5ml水洗，5ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得41mg化合物2-(4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮，收率：77％。
第四步：
将化合物2-(4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯基)噻唑-2-)异吲哚啉-1,3-二酮(41mg，0.077mmol)溶于2ml四氢呋喃中，加入39mg四丁基氟化铵(41mg，1.5mmol)。室温下搅拌2个小时。减压浓缩掉反应体系中四氢呋喃，薄层色谱层析分离纯化得25mg化合物4-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯基)噻唑-2-胺，收率：80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.69(m,2H),7.20(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),7.11(m,1H),6.96(m,2H),6.81(m,2H),3.70(q,J＝7.2Hz,2H),2.32(s,3H),2.29(s,3H),2.25(s,3H),1.26(t,J＝6.4Hz,3H).LC/MS(ESI+)calcd for C23H25N4OS([M+H]+)m/z:405.2；found 405.2。
实施例4合成N-(4-(1,2,3-噻唑-4-)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-)-N-乙基-2-甲基苯胺(化合物108)
Figure BDA0002434197220000221
第一步：
将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯胺(202mg，1mmol)，溶于5ml 1,4-二氧六环，加入4-(4-溴苯基)1,2,3-噻唑，加入碳酸铯(650mg，2mmol)，BINAP(62mg，0.1mmol)，醋酸钯(11mg，0.05mmol)，氩气保护，110℃反应过夜。过滤，滤液10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得260mg化合物N-(4-(1,2,3-噻唑-4-)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-)-2-甲基苯胺，收率：72％。
第二步：
将60％氢化钠(8mg，0.2mmol)溶于3ml N,N-二甲基甲酰胺，加入N-(4-(1,2,3-噻唑-4-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-)-2-甲基苯胺(36mg，0.1mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(22mg，0.2mmol)，室温反应1小时，5ml水洗，5ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得30mg化合物N-(4-(1,2,3-噻唑-4-)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-)-N-乙基-2-甲基苯胺，收率：77％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.19(d,J＝1.6Hz,1H),7.73(d,J＝8.8Hz,2H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),7.23(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),6.99(d,J＝1.6Hz,1H),6.57(m,2H),3.63(q,J＝6.8Hz,2H),2.48(s,3H),2.25(s,3H),2.17(s,3H),1.24(t,J＝6.8Hz,3H).LC/MS(ESI+)calcd for C22H23N4OS([M+H]+)m/z:391.2；found391.2。
实施例5合成N-1-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-N1-乙苯-1,4-二胺(100)
Figure BDA0002434197220000231
将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-N-乙基-2-甲基-N-(4-硝基苯基)苯胺(30mg，0.085mmol)溶于3ml乙酸，加入铁粉(15mg，0.27mmol)，65℃反应4h，冷却至室温，过滤，滤液减压浓缩干。加入5ml乙酸乙酯，饱和碳酸钠水溶液洗涤1次，再用饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩干，薄层色谱层析分离，得到产品N1-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-N1-乙苯-1,4-二胺8mg，收率：29.3％，MS(ESI)m/e 322.1(M+H)+。
实施例6合成5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺(102)
Figure BDA0002434197220000241
第一步：化合物4-(4-溴苯基)-1H-1,2,3-三氮唑的合成
称取对溴苯乙炔(815mg，4.50mmol)，碘化亚铜(44mg，0.23mmol)置于封管中，并加入9mL DMF和甲醇的混合溶液(9:1)，室温搅拌均匀，随后，向体系中加入三甲基硅叠氮(778mg，6.75mmol)，完毕，对体系进行抽真空通氩气操作，反复5次，确保体系中的惰性气体氛围。然后，将体系移置于100℃的油浴中，加热搅拌反应。12h后，TLC检测反应结束。待冷却至室温，将体系转入装有乙酸乙酯(30mL)和水(15mL)的圆底烧瓶中，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，后经柱层析分离纯化得化合物4-(4-溴苯基)-1H-1,2,3-三氮唑(631mg)。收率：63％。
LC/MS(ESI+)calcd for C8H6BrN3 +(M+H+)m/z,224.1；found,224.0.
第二步：化合物4-(4-溴苯基)-1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑的合成
称取4-(4-溴苯基)-1H-1,2,3-三氮唑(224mg,1.00mmol)置于25mL单颈圆底烧瓶中，并向其中加入DMF(4mL)，室温搅拌溶解澄清。再将体系置于冰水浴中降温冷却搅拌，待体系内温降至约0℃时，向体系中加入氢化钠(60mg，1.50mmol)，完毕，任体系保温搅拌反应。15min后，向体系中滴加溶有碘甲烷(170mg，1.20mmol)的DMF(1mL)溶液，滴毕，撤去冰水浴，任体系于室温反应。1.5h后，TLC显示原料基本消耗完全，停止反应。向体系中加入乙酸乙酯(15mL)和水(15mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，经Pre-TLC分离纯化得化合物4-(4-溴苯基)-1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑(86mg)。收率：36％。
LC/MS(ESI+)calcd for C9H8BrN3 +(M+H+)m/z,238.1；found,238.1.
第三步：化合物5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺的合成
依次称取5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯胺(73mg，0.36mmol)，4-(4-溴苯基)-1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑(86mg，0.36mmol)，Binap(12mg，0.02mmol)，醋酸钯(5mg，0.02mmol)和碳酸铯(293mg，0.90mmol)置于25mL单颈圆底烧瓶中，并加入5mL二氧六环，完毕，对体系进行抽真空通氩气操作，反复5次，确保体系中的惰性气体氛围。然后，将体系移置于110℃的油浴中，加热搅拌反应。翌日，TLC检测反应结束。停止加热，待体系冷却至室温，向体系中加入乙酸乙酯(30mL)和水(15mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，后经柱层析分离纯化得化合物5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺(40mg)。收率：31％。LC/MS(ESI+)calcd for C21H21N5O+(M+H+)m/z,359.4；found,360.2.
第四步：化合物5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺的合成
称取5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺(40mg,0.11mmol)置于25mL单颈圆底烧瓶中，并向其中加入DMF(4mL)，室温搅拌溶解澄清。再将体系置于冰水浴中降温冷却搅拌，待体系内温降至约0℃时，向体系中加入氢化钠(7mg，0.17mmol)，完毕，任体系保温搅拌反应。15min后，向体系中滴加溶有溴乙烷(14mg，0.13mmol)的DMF(1mL)溶液，滴毕，撤去冰水浴，任体系于室温反应。30min后，TLC显示原料基本消耗完全，停止反应。向体系中加入乙酸乙酯(15mL)和水(15mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，经Pre-TLC分离纯化得化合物5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基-N-(4-(1-甲基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)苯基)苯胺(33mg)。收率：77％。
LC/MS(ESI+)calcd for C23H25N5O+(M+H+)m/z,387.5；found,388.2.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.66(d,J＝8.7Hz,2H),7.39(d,J＝7.8Hz,1H),7.13(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.05(d,J＝1.7Hz,1H),6.59(d,J＝8.5Hz,2H),4.14(s,3H),3.72(q,J＝7.1Hz,2H),2.41(s,3H),2.28(s,3H),2.18(s,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).
实施例7合成N-(4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基苯胺(105)
Figure BDA0002434197220000261
第一步：化合物4-((5-(3,5-二甲基-2,3-二氢异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)氨基)苯腈的合成
依次称取5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯胺(500mg，2.47mmol)，对溴苯腈(450mg，2.47mmol)，Binap(75mg，0.12mmol)，醋酸钯(27mg，0.12mmol)和碳酸铯(2.01g，6.18mmol)置于50mL单颈圆底烧瓶中，并加入15mL二氧六环，完毕，对体系进行抽真空通氩气操作，反复5次，确保体系中的惰性气体氛围。然后，将体系移置于110℃的油浴中，加热搅拌反应。翌日，TLC检测反应结束。停止加热，待体系冷却至室温，向体系中加入乙酸乙酯(30mL)和水(15mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*2)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，后经柱层析分离纯化得化合物4-((5-(3,5-二甲基-2,3-二氢异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)氨基)苯腈(690mg)。收率：91％。
LC/MS(ESI+)calcd for C19H17N3O+(M+H+)m/z,303.4；found,304.1.
第二步：化合物4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯腈的合成
称取4-((5-(3,5-二甲基-2,3-二氢异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)氨基)苯腈(100mg,0.33mmol)置于25mL单颈圆底烧瓶中，并向其中加入DMF(4mL)，室温搅拌溶解澄清。再将体系置于冰水浴中降温冷却搅拌，待体系内温降至约0℃时，向体系中加入氢化钠(40mg，0.99mmol)，完毕，任体系保温搅拌反应。15min后，向体系中滴加溶有溴乙烷(108mg，0.99mmol)的DMF(1mL)溶液，滴毕，撤去冰水浴，任体系于室温反应。1.5h后，TLC显示原料基本消耗完全，停止反应。向体系中加入乙酸乙酯(15mL)和水(15mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*2)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，经Pre-TLC分离纯化得化合物4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯腈(95mg)。收率：87％。LC/MS(ESI+)calcd forC21H21N3O+(M+H+)m/z,331.4；found,332.3.
第三步：化合物4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)-N'-羟基苯甲脒的合成
称取4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯腈(95mg,0.29mmol)，盐酸羟胺(44mg，0.64mmol)置于50mL单颈圆底烧瓶中，并向其中加入乙醇(10mL)，室温搅拌均匀。接着向体系中加入溶有氢氧化钠(26mg，0.64mmol)的水溶液(1mL)，完毕，将体系移至于油浴中搅拌回流反应。翌日，TLC监测反应结束。撤去油浴，体系恢复至室温。向体系中加入乙酸乙酯(25mL)和水(10mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(15mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，经Pre-TLC分离纯化得化合物4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)-N'-羟基苯甲脒(68mg)。收率：65％。
LC/MS(ESI+)calcd for C21H24N4O2 +(M+H+)m/z,364.4；found,365.2.
第四步：化合物N-(4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基苯胺的合成
称取4-((5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)-N'-羟基苯甲脒(68mg,0.19mmol)置于25mL单颈圆底烧瓶中，并向其中加入原甲酸三乙酯(5mL)，室温搅拌均匀。随后向体系中加入一滴三氟醋酸，完毕，将体系移至于110度的油浴中加热搅拌反应。4h后，取样点板，TLC显示原料消失。撤去油浴，恢复至室温。向体系中加入乙酸乙酯(20mL)和水(10mL)，剧烈搅拌，后静置分层。水相用乙酸乙酯(10mL*3)反萃，合并有机相，依次用水(10mL*3)，饱和食盐水(15mL)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋蒸除去溶剂，得粗品，经Pre-TLC分离纯化得化合物N-(4-(1,2,4-噁二唑-3-基)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-基)-N-乙基-2-甲基苯胺(18mg)。收率：26％。
LC/MS(ESI+)calcd for C22H22N4O2 +(M+H+)m/z,374.4；found,375.1.1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.65(s,1H),7.91(d,J＝9.0Hz,2H),7.41(d,J＝7.9Hz,1H),7.16(dd,J＝7.8,1.7Hz,1H),7.05(d,J＝1.7Hz,1H),6.59(d,J＝9.0Hz,2H),3.74(q,J＝7.1Hz,2H),2.42(s,3H),2.28(s,3H),2.18(s,3H),1.29(t,J＝7.1Hz,3H).
实施例8合成N-(4-(1,2,3-噻唑-4-)苯基)-5-(3,5-二甲基异噁唑-4-)-N-乙基-2-甲基苯胺(化合物111)
Figure BDA0002434197220000281
第一步：
将5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯胺(202mg，1mmol)，溶于5ml 1,4-二氧六环，加入1-(4-溴苯基)环丙烷甲腈(221mg，1mmol)，加入碳酸铯(650mg，2mmol)，BINAP(62mg，0.1mmol)，醋酸钯(11mg，0.05mmol)，氩气保护，110℃反应过夜。过滤，滤液10ml水洗，10ml乙酸乙酯萃取，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，色谱柱纯化，得274mg化合物1-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)氨基)苯基)环丙烷甲腈，收率：80％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.26(d,J＝8.0Hz,1H),7.20(m,2H),7.07(d,J＝2.0Hz,1H),6.95(m,2H),6.83(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),2.38(s,3H),2.29(s,3H),2.25(s,3H),1.66(q,J＝4.0Hz,2H),1.35(q,J＝4.0Hz,2H).LC/MS(ESI+)calcd for C22H22N3O([M+H]+)m/z:344.2；found 344.2。
第二步：
将60％氢化钠(8mg，0.2mmol)溶于3ml N,N-二甲基甲酰胺，加入1-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)氨基)苯基)环丙烷甲腈(34mg，0.1mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(22mg，0.2mmol)，室温反应1小时，5ml水洗，5ml乙酸乙酯萃取，有机层减压浓缩，薄层色谱层析分离纯化得35mg化合物1-(4-((5-(3,5-二甲基异恶唑-4-)-2-甲基苯基)(乙基)氨基)苯基)环丙烷甲腈，收率：94％。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.38(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(m,3H),7.00(d,J＝2.0Hz,1H),6.48(m,2H),3.66(q,J＝6.8Hz,2H),2.40(s,3H),2.26(s,3H),2.15(s,3H),1.59(m,2H),1.28(m,2H),1.25(t,J＝6.8Hz,3H).LC/MS(ESI+)calcd for C24H25N3O([M+H]+)m/z:371.2；found 371.2。
实施例9合成N-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-N-乙基-1H-苯并[d]咪唑-6-胺(115)
Figure BDA0002434197220000291
第一步：
将6-溴-1H-苯并咪唑(788mg，4.0mmol)溶于10mlDMF，加入氢化钠(320mg，8.0mmol)，室温搅拌10min，滴加SEM-Cl(1.0g，6.0mmol)，滴加完毕后，室温反应3h，加入20ml水，20ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩干，色谱柱层析分离，得到产品6-溴-1-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-1H-苯并咪唑700mg，收率：53.5％，MS(ESI)m/e 327.0(M+H)+。
第二步：
6-溴-1-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-1H-苯并咪唑(164mg，0.5mmol)、5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯胺(101mg，0.5mmol)溶解于5ml 1,4-二氧六环中，加入碳酸铯(406mg，1.25mmol)、BINAP(16mg，0.025mmol)、醋酸钯(6mg，0.025mmol)，氩气置换3次，110℃反应过夜，冷却至室温，加入20ml水，20ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩干，薄层色谱层析分离，得到产品N-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-1-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺50mg，收率：22.3％，MS(ESI)m/e 449.2(M+H)+。
第三步：
将N-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-1-((2-(三甲硅基)乙氧基)甲基)-1H-苯并[d]咪唑-6-胺(45mg，0.1mmol)溶解于3mlDMF，加入氢化钠(20mg，0.5mmol)，室温搅拌10min，加入溴乙烷(55mg，0.5mmol)，室温反应2h，加入10ml水，10ml乙酸乙酯萃取，有机层分别用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩干，得到化合物115-3。
第四步：
将步骤三得到的化合物115-3溶解于3ml二氯甲烷，加入3ml三氟乙酸，室温搅拌过夜，减压浓缩干，加入10ml乙酸乙酯，饱和碳酸钠水溶解洗涤一次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥，减压浓缩干，薄层色谱层析分离，得到产品N-(5-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)-2-甲基苯基)-N-乙基-1H-苯并[d]咪唑-6-胺13mg，收率37.5％，MS(ESI)m/e 347.2(M+H)+，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.17(s,1H),7.46(d,J＝7.8Hz,1H),7.37(d,J＝7.8Hz,1H),7.10(d,J＝7.5Hz,1H),7.04(s,1H),6.80(s,1H),6.60(d,J＝8.4Hz,1H),3.73(d,J＝6.9Hz,2H),2.40(s,3H),2.26(s,3H),2.15(s,3H),1.29–1.25(m,3H).
参照上述实施例的方法，合成本发明中的其余化合物，合成时所用原料均为市售产品。各化合物的结构、质谱和核磁表征数据如表1所示。
表1本发明化合物的结构表征
Figure BDA0002434197220000301
Figure BDA0002434197220000311
Figure BDA0002434197220000321
Figure BDA0002434197220000331
Figure BDA0002434197220000341
Figure BDA0002434197220000351
Figure BDA0002434197220000361
Figure BDA0002434197220000371
Figure BDA0002434197220000381
Figure BDA0002434197220000391
Figure BDA0002434197220000401
Figure BDA0002434197220000411
以下通过试验例证明本发明化合物的有益效果。
试验例1、本发明化合物对前列腺癌细胞的增殖抑制活性
实验方法：
1、对前列腺癌细胞LNCaP/AR增殖抑制作用的生物学测定
(1)实验材料和仪器：
LNCaP/AR cell line(由四川康城生物科技有限公司提供)
胎牛血清FBS(Gibco,Cat.No.10099-141)
0.01M PBS(Biosharp,Cat.No.162262)
RIPM1640培养基(Hyclone,Cat.No.308090.01)
青-链霉素Penicillin-Streptomycin(Hyclone,Cat.No.SV30010)
Cell counting kit-8试剂盒(Signalway Antibody,Cat.No.CP002)
二甲基亚砜DMSO(Sigma,Cat.No.D5879)
离心管Centrifuge Tube,15ml(Excell Bio,Cat.No.CS015-0001)
细胞培养皿Cell Culture Dish,(Excell Bio,Cat.No.CS016-0128)
细胞培养板96-well cell culture cluster(Corning,Cat.No.3599)
酶标仪(Thermo Multiskan MK3型)
(2)实验方法：
a.缓冲液配制
细胞培养液：RIPM1640培养基，10％FBS，1％Pen Strep；
PBS缓冲液：PBS粉剂溶于2L超纯水中，灭菌。
b.实验步骤：
1)LNCaP/AR细胞用细胞培养液传代培养，取生长状态良好的细胞接种于96孔板，每孔80μL，每孔细胞数为1000，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中培养过夜。
2)将药物用二甲基亚砜(DMSO)配置成10mM的储存液。临用前再用DMSO稀释3倍，再按3倍梯度稀释，得到9个浓度梯度，再用培养液将各浓度的化合物稀释200倍(以此保证培养体系中DMSO浓度为0.1％)，每个浓度做2个孔重复。取20μL稀释好的化合物加到细胞培养孔(终浓度为10μM,3.3μM,1.1μM…)，轻轻振荡混匀。另外设置3个只加细胞的阴性对照孔和3个只加培养液的空白对照孔(6孔各加20μL培养液稀释200倍的DMSO)。
c.结果检测：
1)培养6天后，每孔加10μL CCK-8，于37℃，5％CO2细胞孵育箱中继续培养1小时。
2)用多功能酶标仪在450nm处测定吸光度(OD值)。
3)数据用软件GraphPad Prism5中Dose-response-inhibition方程分析，得出IC50值。
2、对其他前列腺癌细胞增殖抑制作用的生物学测定
本发明化合物对其他耐药性前列腺癌细胞的抑制活性用上述相同的方法测得，其中VCaP,22RV1细胞为市售所得。
结果分析：
本发明化合物对各前列腺癌细胞的增殖抑制活性结果如表2、表3所示，可以看出，本发明化合物不仅能够抑制雄激素受体AR多表达的前列腺癌细胞系LNCaP/AR的增殖，而且对上市前列腺癌药物(恩杂鲁胺)耐药的前列腺癌细胞系VCaP及22RV1也显示了良好的抑制作用。
表2为本发明化合物对前列腺癌细胞LNCap/AR的抑制活性
Figure BDA0002434197220000421
Figure BDA0002434197220000431
表3为本发明化合物对其他前列腺癌细胞的抑制活性
Figure BDA0002434197220000432
表3中，“-”表示没有进行测试。
试验例2、本发明化合物对雄激素受体(AR)的功能抑制活性实验材料：
HEK293 cell line
DMEM含phenol red(Invitrogen,Cat.No.11960051)
DMEM不含phenol red(Gibco,Cat.No.31053028)
FBS(Hyclone,Cat.No.SV30087.03)
Dialyzed FBS(Biological Industries,Cat.No.04-011-1A)
Fugene(Promega,Cat.No.E2311)
Opti-MEM(Gibco,Cat.No.11058021)
Androgen receptor clone(Origene,Cat.No.RC235415)
pGL4.36 vector(Promega,Cat.No.E1360)
Steady-Glo(Promega,Cat.No.E2550)
Assay plate(Greiner,Cat.No.655098)
实验方法：
1.试剂配制
Figure BDA0002434197220000441
2.实验步骤：
1)用接种细胞的培养基稀释细胞悬液，浓度达到每毫升4.0×105个细胞，以备后面铺板并加转染试剂用。
2)将稀释好的细胞悬液接种到细胞培养板中，每孔100uL，放入细胞培养箱过夜培养。
3)按每孔10uL准备好转染试剂，室温放置15分钟后加入到细胞培养板，放入细胞培养箱过夜培养。
4)用TECAN加样仪按3倍梯度稀释化合物，得到8个浓度梯度，最终DMSO浓度为0.25％，稀释好的化合物放在37℃培养箱中孵育30分钟。
5)用EC80加样仪在对照孔中加入终浓度为2nM的睾酮250nL，并放入细胞培养箱过夜培养。
6)将Steady-Glo按每孔100uL加入细胞培养板中，室温放置15分钟，在Envision上读板。
结果分析：
使用XL-fit软件(由Business Solutions Ltd.提供，版本号XL fit5.0)，按照公式％Effect＝(Sample value-LC)/(HC-LC)*100来分析数据，计算得到各化合物对雄激素受体(AR)的抑制率，进一步计算出各化合物对雄激素受体(AR)的半抑制浓度IC50。
表4：本发明化合物对雄激素受体(AR)的功能抑制活性
Figure BDA0002434197220000442
Figure BDA0002434197220000451
可以看出，本发明的化合能够有效抑制雄激素受体(AR)的活性。
试验例3、本发明化合物对BRD4的抑制活性
用均相时间分辨荧光技术(HTRF)检测化合物对BRD4(D1+D2)蛋白的结合作用。
实验材料：
BRD4(1,2)(BPS,Cat.No.31044)，
I-CBP 112(MCE,Cat.No.HY-19541)，
(+)-JQ1(BPS,Cat.No.27402)。
实验方法：
采用均相时间分辨荧光法，检测步骤如下：
1.按照检测板的布局在Echo板上梯度稀释待测化合物，DMSO的最终稀释浓度为0.1％。
2.用Echo自动加样仪将化合物或DMSO转移到384孔检测板里。
3.将2倍浓度的蛋白质和多肽混合物加入检测板中。
4.将2倍浓度的检测混合液加入测定板中，并震荡30秒。
5.在室温下孵育2个小时。
6.在Envision多功能酶标仪上读取荧光信号(激发光波长为340nm,发射光波长为615nm和665m)。
结果分析：
曲线拟合
1.将实验数据输入Excel文档中并使用方程(1)得到抑制率
方程(1):Inh％＝(Max-Signal)/(Max-Min)*100
2.将得出的数据输入GraphPad软件中并使用方程(2)得到IC50的值。
方程(2):Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*Hill Slope))
其中Y轴是抑制率，X轴是化合物浓度。
本发明化合物对BRD4的半抑制浓度IC50如表5所示。可以看出，本发明的化合能够有效抑制BRD4的活性。结合上述本发明化合物能够有效抑制雄激素受体(AR)的活性的结论，可以得出，本发明的化合物能够同时识别AR和BRD4，并同时对AR和BRD4发挥有效的抑制作用。
表5：本发明化合物对BRD4的抑制活性
化合物 IC<sub>50</sub>(μM)
27 4.1
31 6.3
45 1.9
83 6.7
综上，本发明提供了式I所示的化合物，该化合物对AR和BRD4具有双重抑制作用。本发明化合物不仅能够抑制雄激素受体AR多表达的前列腺癌细胞系LNCaP/AR的增殖，而且对上市的前列腺癌药物(恩杂鲁胺)耐药的前列腺癌细胞系VCaP及22RV1也显示了良好的抑制作用。本发明化合物本身作为能同时识别AR和BRD4双靶点的化合物，能够用作AR/BRD4双重抑制剂，还能用于制备诱导AR/BRD4双靶点降解的蛋白降解靶向嵌合体(PROTACs)，在制备治疗AR及BRD4相关疾病的药物中具有良好的应用前景。

Claims (16)

1.以下化合物或其药学上可接受的盐：
Figure 450414DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备AR抑制剂中的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述AR抑制剂为蛋白降解靶向嵌合体。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述蛋白降解靶向嵌合体能够靶向降解AR，和/或下调全长雄激素受体和/或变异雄激素受体表达。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述AR抑制剂为治疗与AR相关疾病的药物。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗前列腺癌的药物。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述前列腺癌为对恩杂鲁胺耐药的前列腺癌。
8.以下化合物或其药学上可接受的盐：
Figure 48886DEST_PATH_IMAGE002
Figure 128837DEST_PATH_IMAGE003
Figure 154562DEST_PATH_IMAGE004
Figure 890437DEST_PATH_IMAGE005
。
9.权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备AR和BRD4抑制剂中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述AR和BRD4抑制剂为蛋白降解靶向嵌合体。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于：所述蛋白降解靶向嵌合体能够靶向降解AR和BRD4，和/或下调全长雄激素受体和/或变异雄激素受体表达。
12.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述AR和BRD4抑制剂为治疗与AR和BRD4相关疾病的药物。
13.根据权利要求12所述的用途，其特征在于：所述药物为治疗前列腺癌的药物。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：所述前列腺癌为对恩杂鲁胺耐药的前列腺癌。
15.权利要求8所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备BRD4抑制剂中的用途。
16.根据权利要求15所述的用途，其特征在于：所述BRD4抑制剂为治疗与BRD4相关疾病的药物。
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