CN111763761A - 一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法 - Google Patents

一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，具体步骤如下：（1）选取不同的野生丹参种群，对每株野生丹参幼嫩茎叶进行基因组总DNA的提取；采用引物YCF1–RPS15对野生丹参种群个体进行PCR扩增，获得YCF1–RPS15序列的扩增产物；引物序列为：YCF1：5´CTTGTATGRATCGTTATTGKTTTG 3´；RPS15：5´CAATTYCAAATGTGAAGTAAGTCTCC 3´；根据序列比对和生物信息学分析，获得野生丹参不同地理种群的遗传多样性水平和群体遗传结构。本发明提供的方法能分析野生丹参种群的遗传变异，了解河南省野生丹参群体的遗传多样性和遗传结构情况，结果可为野生丹参资源的合理利用和保护提供科学依据。

Description

一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构 的方法
技术领域
本发明涉及生物遗传技术领域，尤其涉及一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，尤其是利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参不同地理种群遗传结构方法。
背景技术
遗传结构指群体遗传变异分布的时空格局。群体是物种进化的基本单位，遗传结构则是一个物种最基本的特征之一。群体的遗传结构受物种的繁育系统、花粉和种子的传播机制及地理隔离等多种因素的影响。种子传播能力强，种群一般不会形成显著的谱系地理结构，遗传变异主要存在于居群内；种子传播能力弱，种群间一般存在中度或高度的遗传分化及低水平的基因流，地理隔离和片段化则可能是导致物种群体遗传结构形成的主要原因。
丹参（Salvia miltiorrhiza Bunge）为唇形科鼠尾草属多年生草本植物，又名红根、赤参、血参。丹参在我国的地理分布范围较广，《中国植物志》中记载，山西、陕西、河南、山东、浙江、安徽等地均有野生丹参的分布，生于山坡、林下草丛中。河南地处亚热带与暖温带过渡区域，是我国野生丹参的分布区之一，随着我国心脑血管疾病发病率的逐年提高，丹参的市场需求量也越来越大，野生丹参因有效成分含量较栽培种高，采挖现象严重，导致野生丹参资源越来越少。YCF1–RPS15是叶绿体基因组的一段基因间隔区，具有进化速率较快的特点，利用该基因间隔区对野生丹参进行群体遗传学方面的研究鲜见报道。
发明内容
本发明提供一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，本发明提供的方法能分析野生丹参种群的遗传变异，了解河南省野生丹参群体的遗传多样性和遗传结构情况，结果可为野生丹参资源的合理利用和保护提供科学依据。
本发明的目的是以下述方式实现的：一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，具体步骤如下：
（1）选取不同的野生丹参种群，每个种群采集至少3株野生丹参幼嫩茎叶；
（2）对每株野生丹参幼嫩茎叶进行基因组总DNA的提取；
（3）采用通用引物YCF1–RPS15对野生丹参种群个体进行PCR扩增，获得YCF1–RPS15序列的扩增产物；对PCR产物纯化后进行双向测序，获得所有丹参个体YCF1–RPS15序列的核苷酸序列；其中，PCR扩增采用的通用引物序列为：
YCF1：5´ CTTGTATGRATCGTTATTGKTTTG 3´；
RPS15：5´ CAATTYCAAATGTGAAGTAAGTCTCC 3´；
（4）用DNAStar中的SeqMan软件对双向测序后的序列进行拼接；
用ClustalX2软件对拼接后的序列进行比对；
用DnaSP5软件统计cpDNA单倍型，计算种群的核苷酸多态性和单倍型多态性，并根据岐点分布图追溯种群历史动态变化；
用Arlequin ver3.5软件进行分子方差AMOVA分析，计算种群内和种群间的遗传变异；
用MEGA6.0 构建野生丹参群体的亲缘关系；
（5）根据序列比对和生物信息学分析，获得野生丹参不同地理种群的遗传多样性水平和群体遗传结构。
PCR反应体系：20μL反应体系：包括10×buffer 2μL，dNTP mix 1.6μL，Taq酶0.1μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13.3μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1min10s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
所述步骤（1）中，对采集的野生丹参幼嫩茎叶，硅胶干燥保存。
所述步骤（2）中采用植物基因组DNA提取试剂盒对硅胶干燥后的样品进行基因组总DNA的提取；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性。
本发明提供的方法能分析野生丹参种群的遗传变异，了解种群的核苷酸多态性和单倍型多态性、追溯种群历史动态变化、群内和种群间的遗传变异、野生丹参群体的亲缘关系，了解野生丹参群体的遗传多样性、群体遗传结构和种群历史动态分析，结果可为野生丹参资源的合理利用和保护提供科学依据。
附图说明
图1为本发明实施例提供的野生丹参YCF1–RPS15片段扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图，1–11表示11个丹参样品，M表示Marker；
图2为追溯种群历史动态变化的野生丹参种群的岐点分布图，实线表示期望值曲线，虚线表示观测值曲线；
图3为基于双参数模型构建的野生丹参系统发育树；
图4为本发明中基于cpDNA基因间隔区YCF1–RPS15构建的河南省3个野生丹参群体间亲缘关系图。
具体实施方式
一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，具体步骤如下：
（1）选取不同的野生丹参种群，每个种群采集至少3株野生丹参幼嫩茎叶；
（2）对每株野生丹参幼嫩茎叶进行基因组总DNA的提取；
（3）采用通用引物YCF1–RPS15对野生丹参种群个体进行PCR扩增，获得YCF1–RPS15序列的扩增产物；对PCR产物纯化后进行双向测序，获得所有丹参个体YCF1–RPS15序列的核苷酸序列；其中，PCR扩增采用的通用引物序列为：
YCF1：5´ CTTGTATGRATCGTTATTGKTTTG 3´；
RPS15：5´ CAATTYCAAATGTGAAGTAAGTCTCC 3´；
（4）用DNAStar中的SeqMan软件对双向测序后的序列进行拼接；
用ClustalX2软件对拼接后的序列进行比对；
用DnaSP5软件统计cpDNA单倍型，计算种群的核苷酸多态性和单倍型多态性，并根据岐点分布图追溯种群历史动态变化；
用Arlequin ver3.5软件进行分子方差AMOVA分析，计算种群内和种群间的遗传变异；
用MEGA6.0 构建野生丹参群体的亲缘关系；
（5）根据序列比对和生物信息学分析，获得野生丹参不同地理种群的遗传多样性水平和群体遗传结构。
PCR反应体系：20μL反应体系：包括10×buffer 2μL，dNTP mix 1.6μL，Taq酶0.1μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13.3μL。
PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1min10s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
所述步骤（1）中，对采集的野生丹参幼嫩茎叶，硅胶干燥保存。
所述步骤（2）中采用植物基因组DNA提取试剂盒对硅胶干燥后的样品进行基因组总DNA的提取；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性。
下面结合具体实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容做出一些非本质的改进和调整。
1材料与方法
1.1试验材料
2019年7月，在河南卢氏桦栎村（简称LHL群体）、双龙镇土桥岗（简称XSL群体）和高庄（简称NGZ群体）采集55个野生丹参个体的无病虫害、幼嫩茎叶，装入硅胶干燥袋中密封保存后带回实验室。
1.2试验方法
1.2.1 丹参基因组总DNA提取
丹参基因组总DNA采用植物基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，货号DP305）进行提取，具体操作步骤：
a)称取干燥后的丹参幼嫩枝叶约30mg，加入液氮充分研磨至粉状，将研磨好的粉末迅速转移至预先装有700μl预热缓冲液的GP1的离心管中；
b)迅速颠倒混匀后将离心管放在60℃恒温水浴锅中水浴20分钟，水浴过程中间隔摇匀；
c) 20分钟后加入700μl氯仿充分混匀，12000转/分的转速离心约10分钟；
d)将上层水相转移至新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2充分混匀；
e)将混匀的液体转移至吸附柱中，12000转/分离心2分钟，弃掉废液；
f)向吸附柱中加入500μl缓冲液GD，12000转/分离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；
g)向吸附柱中加入600μl漂洗液，12000转/分离心2分钟；
h)倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复清洗步骤，倒掉废液，离心5 分钟；
i)将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；
j)将晾干后的吸附柱放入一个新的1.5ml离心管中，70μl 双蒸水溶解后离心5分钟，将溶液收集到离心管中。
使用1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性，北京君意公司生产的JY-600C型电泳仪上进行琼脂糖凝胶电泳，Alpha Imager凝胶成像分析系统检测和拍照。
1.2.2 PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳检测和测序
通用引物YCF1–RPS15由北京六合华大基因科技有限公司合成。
上、下游引物为YCF1：5´ CTTGTATGRATCGTTATTGKTTTG 3´；
RPS15：5´ CAATTYCAAATGTGAAGTAAGTCTCC 3´。
PCR反应体系：20μL反应体系：包括10×buffer 2μL，dNTP mix 1.6μL，Taq酶0.1μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13.3μL。这里的DNA模板为不同的丹参样品DNA，如前所述，共有55个丹参样品，所以PCR反应体系是用55个PCR小管来配制的，每个管中加1μL不同丹参样品的DNA，其余的都一样，然后进行PCR扩增。
德国Biometra公司生产的T1型梯度PCR仪上进行PCR扩增。PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1min10s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。北京君意公司生产的JY-600C型电泳仪上进行琼脂糖凝胶电泳，Alpha Imager凝胶成像分析系统检测和拍照，这里使用的为1%琼脂糖凝胶。
对PCR产物纯化后进行双向测序，获得所有丹参个体YCF1–RPS15序列的核苷酸序列。PCR扩增产物纯化和双向测序由北京六合华大基因科技有限公司完成。
1.2.3数据分析
用DNAStar中的SeqMan软件对双向测序后的序列进行拼接，获得所有丹参个体YCF1–RPS15序列的核苷酸序列；
用ClustalX2软件对拼接后的序列进行比对；
用DnaSP5软件统计cpDNA单倍型，计算种群的核苷酸多态性和单倍型多态性，并根据岐点分布图追溯种群历史动态变化；
用Arlequin ver3.5软件进行分子方差AMOVA分析，计算种群内和种群间的遗传变异系数Fst；
MEGA6.0中最大似然法构建野生丹参个体的系统发育树，模型采用Kimura-2-parameter model进行计算，1000次bootstrap重复。并根据种群间遗传距离，以云南鼠尾草Salvia yunnanensis的YCF1–RPS15序列（GenBank：MG824164.1）为外类群，用UPGMA法构建3个野生丹参群体的亲缘关系。
2 结果及分析
2.1电泳和测序结果
部分野生丹参样品YCF1–RPS15片段扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图1，YCF1–RPS15片段大小约750bp。110条测序序列经拼接、比对后，共获得55条555bp的YCF1–RPS15序列。序列A+T含量为71.7%，高于G+C含量（28.3%），单倍型多态性Hd=0.368，核苷酸多态性Pi=0.00066。NGZ群体在375bp处发生了碱基T到碱基G的突变。共检测到2种单倍型H1和H2，LHL群体和XSL群体均为单倍型H1，NGZ群体均为单倍型H2。
H1序列为：
CAGACCCTTTATTTTCTTCGTTTTCTTTTTGAGAAATAATCGAAATTACTGAATTTTTTACCATAAAAAAATGCTCCTTTTTCCTTGTCCAGATATGGATTTTACCGATCAGTAATAATAATGCTATTAGTTTTTATGTGGTATATACAATAATTTAATGCAAATAACTCCTAATTTTCTGAATTCAGACCAATCAATCAAATTTGAAATTCTATTTAGATAGGAATAGAAAACGATTGGTACATTTTCGCATCGAAAAATTTAGACCTAAAATTCAGAAGTTTCTGTTAATTCATTTCGAGATTTAATTGAGATATTAGTCAAAGTCATTTCATATTGGATACTCGAATGAGATGTGAGATAAGAAAAGCGCATGATCTGTCTATTTGTTTACTTTCATATACCCTAGAAATTATATTTTCTATTCTAGGGTATATAGAAATAGGATCTAGGATATATAGAAAAAGTGTATTATTCACAGAATTTCAATCACGGATACAGATCTATTCTTAACATACTGAAACGACTGCCATTATTGGTATCAAACCAATAACG
H2序列为：
CAGACCCTTTATTTTCTTCGTTTTCTTTTTGAGAAATAATCGAAATTACTGAATTTTTTACCATAAAAAAATGCTCCTTTTTCCTTGTCCAGATATGGATTTTACCGATCAGTAATAATAATGCTATTAGTTTTTATGTGGTATATACAATAATTTAATGCAAATAACTCCTAATTTTCTGAATTCAGACCAATCAATCAAATTTGAAATTCTATTTAGATAGGAATAGAAAACGATTGGTACATTTTCGCATCGAAAAATTTAGACCTAAAATTCAGAAGTTTCTGTTAATTCATTTCGAGATTTAATTGAGATATTAGTCAAAGTCATTTCATATTGGATACTCGAATGAGATGTGAGATAAGAAAAGCGCAGGATCTGTCTATTTGTTTACTTTCATATACCCTAGAAATTATATTTTCTATTCTAGGGTATATAGAAATAGGATCTAGGATATATAGAAAAAGTGTATTATTCACAGAATTTCAATCACGGATACAGATCTATTCTTAACATACTGAAACGACTGCCATTATTGGTATCAAACCAATAACG
2.2种群历史动态
利用DnaSP5软件绘制岐点分布图，追溯河南省野生丹参种群历史动态变化。岐点分布为以横、纵坐标显示单倍型之间碱基差异数目的频率分布。一般经历过近期扩张的种群呈现单峰分布模式，而平衡种群往往表现为多峰分布。追溯种群历史动态变化的野生丹参种群的岐点分布图为图2，野生丹参种群的岐点分布图呈现单峰分布模式，表明种群经历了近期的扩张。
2.3群体遗传结构
用Arlequin ver3.5软件进行分子方差分析，并计算种群内和种群间的遗传变异系数Fst。分子方差分析结果为表1，结果表明：野生丹参的遗传变异发生在种群间，种群间的遗传变异为100%，其中河南卢氏桦栎村（LHL）和南召高庄（NGZ）、西峡双龙镇土桥岗（XSL）和南召高庄（NGZ）种群间遗传分化程度很大，遗传分化系数Fst=1（p ≤0.05），而种群内的遗传变异为零，表明种群间遗传变异是河南省野生丹参种群遗传变异的主要来源。
Figure 131024DEST_PATH_IMAGE001
2.4种群间系统发育关系
双参数模型Kimura-2-parameter model构建的野生丹参系统发育树为图3，图3显示，LHL和XSL群体的丹参聚为一支，NGZ群体的丹参聚为一支，获得63%的Bootstrap支持。根据种群间遗传距离，以云南鼠尾草Salvia yunnanensis的YCF1–RPS15序列（GenBank：MG824164.1）为外类群，用UPGMA法构建3个野生丹参群体间的亲缘关系图为图4，图4表明，LHL和XSL群体的亲缘关系较近，均与NGZ群体的亲缘关系较远，在LHL和XSL群体间存在频繁的基因交流。
本发明利用cpDNA分子标记方法，对野生丹参群体进行了遗传多样性和群体遗传结构分析，准确获取了河南省野生丹参群体的遗传变异信息。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，应当指出，对于本领域的及任何熟悉本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明整体构思前提下，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，及作出的若干改变和改进，这些也应该视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 三门峡职业技术学院
<120> 一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法
<130> 2020-07-29
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
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cagacccttt attttcttcg ttttcttttt gagaaataat cgaaattact gaatttttta 60
ccataaaaaa atgctccttt ttccttgtcc agatatggat tttaccgatc agtaataata 120
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gaattcagac caatcaatca aatttgaaat tctatttaga taggaataga aaacgattgg 240
tacattttcg catcgaaaaa tttagaccta aaattcagaa gtttctgtta attcatttcg 300
agatttaatt gagatattag tcaaagtcat ttcatattgg atactcgaat gagatgtgag 360
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tctattctag ggtatataga aataggatct aggatatata gaaaaagtgt attattcaca 480
gaatttcaat cacggataca gatctattct taacatactg aaacgactgc cattattggt 540
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Claims (5)

1.一种利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）选取不同的野生丹参种群，每个种群采集至少3株野生丹参幼嫩茎叶；
（2）对每株野生丹参幼嫩茎叶进行基因组总DNA的提取；
（3）采用通用引物YCF1–RPS15对野生丹参种群个体进行PCR扩增，获得YCF1–RPS15序列的扩增产物；对PCR产物纯化后进行双向测序，获得所有丹参个体YCF1–RPS15序列的核苷酸序列；其中，PCR扩增采用的通用引物序列为：
YCF1：5´ CTTGTATGRATCGTTATTGKTTTG 3´；
RPS15：5´ CAATTYCAAATGTGAAGTAAGTCTCC 3´；
（4）用DNAStar中的SeqMan软件对双向测序后的序列进行拼接；
用ClustalX2软件对拼接后的序列进行比对；
用DnaSP5软件统计cpDNA单倍型，计算种群的核苷酸多态性和单倍型多态性，并根据岐点分布图追溯种群历史动态变化；
用Arlequin ver3.5软件进行分子方差AMOVA分析，计算种群内和种群间的遗传变异；
用MEGA6.0 构建野生丹参群体的亲缘关系；
（5）根据序列比对和生物信息学分析，获得野生丹参不同地理种群的遗传多样性水平和群体遗传结构。
2. 如权利要求1所述的利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，其特征在于：PCR反应体系：20μL反应体系：包括10×buffer 2μL，dNTP mix 1.6μL，Taq酶0.1μL，上、下游引物各1μL，DNA模板1μL，ddH2O 13.3μL。
3.如权利要求1所述的利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，其特征在于：PCR扩增程序为：95℃预变性5min，95℃变性30s，49℃退火30s，72℃延伸1min10s，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
4.如权利要求1所述的利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，对采集的野生丹参幼嫩茎叶，硅胶干燥保存。
5.如权利要求1所述的利用cpDNA序列YCF1–RPS15分析野生丹参群体遗传结构的方法，其特征在于：所述步骤（2）中采用植物基因组DNA提取试剂盒对硅胶干燥后的样品进行基因组总DNA的提取；通过1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA的完整性。
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