CN111748588B - 一种提高Haloferax mediterranei发酵聚羟基脂肪酸酯产量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种提高Haloferax mediterranei发酵聚羟基脂肪酸酯产量的方法。本发明中,通过建立电磁场装置,并在施加在以H.mediterranei菌为接种物的发酵系统外部,电磁场的大小为110mT,刺激了H.mediterranei对底物的吸收和对PHA的代谢,实现H.mediterranei对底物碳源的利用率提高22.4%,H.mediterranei细胞中PHA的含量达到76.7%,提高了20.8%。本发明可以提高H.mediterranei的PHA产率,降低PHA的生产成本。
Description
技术领域
本发明提出一种提升地中海富盐菌Haloferax mediterranei(H.mediterranei)发酵生产聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHAs)产量的方法。本发明属于生物发酵领域,具体涉及聚羟基脂肪酸酯的生产。
背景技术
PHA是一种微生物在生长代谢不平衡条件下在细胞内合成的一种高分子聚合物。PHA具有的生物可降解性、生物相容性等特殊性质,使其在食品、医药、工业、农业等领域有着广阔的应用前景,尤其是可以作为石油基塑料的理想替代品。
作为一种极端嗜盐古菌,H.mediterranei有较好的PHA积累能力。在发酵中,工业优化发酵条件提升PHA细胞含量,从而提高PHA的生产效率,降低PHA的生产成本。例如,专利申请号CN108103114A,通过改变发酵液中NaCl的浓度,促进了H.mediterranei对PHA的生产,将PHA的含量由57%提高到71%。此外,专利申请号CN103451201A通过基因编辑的手段,将H.mediterranei基因组中的胞外多糖合成基因敲除,使胞外多糖合成基因簇表达的一种蛋白功能缺失,减少EPS的分泌,使得H.mediterranei胞内的PHA含量提高了20%。专利申请号TW1395814B1通过基因编辑合成了PHA合成酶基因maoCH13,使PHA合成酶活性提高,促进了极端嗜盐古菌的PHA生产。但是,通过基因编辑的方法提高H.mediterranei的PHA细胞含量具有操作精密度高、难度大,药剂成本和菌种维持成本高等问题。
为了提升野生H.mediterranei的PHA生产能力,本发明提供了一种通过施加电磁场的方式来促进H.mediterranei生产PHA的方法。本方法不用改变发酵液组分,不进行基因工程的操作。只是通过构建发酵的物理环境可以提高H.mediterranei中PHA的含量,提高PHA的产率,进而降低PHA的生产成本。
发明内容
本发明提供的嗜盐古菌为地中海富盐菌Haloferax mediterranei,购置于中国普通微生物菌种保藏管理中心,其保藏编号为CGMCC 1.3716。
本发明的目的是提高地中海富盐菌H.mediterranei的发酵产PHA产量。
本发明调控地中海富盐菌H.mediterranei的PHA产量,其特征在于:在开放发酵的环境下,通过在外部施加特定强度的磁场,提高PHA产量。即利用磁场生物作用提高H.mediterranei的PHA产量。
本发明提出一种利用电磁场强化地中海富盐菌H.mediterranei发酵产PHA的装置,包括:
(1)发酵罐,(1.1)控温装置,(1.2)磁场检测装置高斯计,(2)pH自动控制系统,(2.1)氢氧化钠调节液,(3)曝气泵,(3.1)气体流量计,(3.2)曝气盘,(4)电磁铁主体装置,包含:(4.1)电磁铁水槽,(4.2)电磁铁螺旋线圈,(4.3)低温循环水箱,(4.4)稳压直流电源。
装置连接流程为依次连接发酵罐(1)与控温装置(1.1)、高斯计(1.2);连接pH自动控制系统(2)与氢氧化钠调节液(2.1),并与发酵罐(1)连接;通过曝气泵(3)、气体流量计(3.1)、曝气盘(3.2)向发酵罐(1)内进行曝气;连接电磁铁水槽(4.1)与低温循环水箱(4.2),连接螺旋线圈(4.3)与稳压直流电源(4.4)。将发酵罐(1)放置于电磁铁主体装置(4)内。
基于上述的装置,以外源磁场作用提高H.mediterranei发酵PHA产量的技术方法,主要步骤如下:
(1)将活化、富集后的H.mediterranei接种在发酵罐(1)中,并加入发酵液;
(2)打开控制电磁铁主体装置(4)的稳压直流电源(4.4),打开低温循环水箱(4.2)向电磁铁水槽(4.1)供水,维持磁设备的温度在4-10℃;
(3)调节稳压直流电源(4.4)的电流强度,用高斯计测量磁场中发酵罐内部的磁场强度,使发酵罐内部的磁场强度控制在100mT-120mT之间;
(4)调节控温装置(1.1),将温度恒定在预设的发酵最优温度37℃;
(5)打开pH自动控制系统(2),向发酵罐内供给浓度为1-2mlo/L的氢氧化钠溶液(2.1),将发酵液的pH恒定在7.0-7.2之间;
(6)打开曝气泵(3),调节流量计(3.1),将溶解氧控制在2-4mg/L;
(7)连续发酵使H.mediterranei积累PHA。
(8)磁场作用时间控制在60-72h,之后停止磁设备。
(9)发酵72h后停止曝气,完成发酵周期,提取发酵产物PHA。
所述的发酵特征在于开放式发酵,具体为发酵底物不经过灭菌,且发酵可以在不灭菌的环境中进行。
所述的电磁场特征在于螺旋线圈通电所产生的均匀磁场,具体为螺旋线圈在接通直流电源后,在磁设备内部产生的磁场强度和方向处处相同的磁场。
本发明的技术原理:
外加磁场首先作用在H.mediterranei的细胞膜和细胞壁上,在磁场作用下,磷脂双分子层的抗磁各向异性的增加,导致细胞膜的电导率和渗透率增加,促进了较大的亲水性颗粒的渗透,例如二价阳离子(Ca2+,Mg2+);在发酵液中,许多H.mediterranei必需的物质都是带电粒子(例如离子)的形式,这些带点粒子也都受到外部电磁场的影响。所以,磁场促进了细胞膜的物质运输与能量传递,增加了H.mediterranei对底物的消耗,进而在提高了碳源在PHA的流向上的分配;磁场也被认为促进了H.mediterranei生产PHA代谢路径中的TCA循环,并且对路径上的关键酶,尤其是酶的活性位点产生了刺激作用,提高了酶活性,进而促进了代谢产物PHA的生产。
本发明的优势:
(1)本发明中使用的磁场强化装置,并不改变原有发酵方式,无需对原有发酵程序进行修改;
(2)在中低强度的电磁场下,即低耗能的条件下,就可以显示出较为突出的磁生物作用。相较于基因编辑在药剂以及后续处理中的费用,本发明的实现成本较低。
(3)提高了PHA的生产率,进而降低了PHA的生产成本;
(4)磁场的发生较为简单,适用范围广,物理性的设施不会产生二次污染。
附图说明
图1为施加电磁场条件下,H.mediterranei,发酵生产PHA的装置结构示意图。(1)发酵罐,(1.1)控温装置,(1.2)磁场检测装置高斯计,(2)pH自动控制系统,(2.1)2mol/L氢氧化钠调节液,(3)曝气泵,(3.1)气体流量计,(3.2)曝气盘,(4)电磁铁主体装置,包含:(4.1)电磁铁水槽,(4.2)低温循环水箱,(4.3)电磁铁螺旋线圈,(4.4)稳压直流电源。
图2为本发明实施例中无磁场条件下和110mT磁场条件下,H.mediterranei对碳源底物的利用率以及PHA胞内含量的对比图;其中,CODC代表无磁场时发酵液的生化需氧量,CODM代表110mT磁场时发酵液的生化需氧量,PHAC代表无磁场时H.mediterranei的胞内PHA含量,PHAM代表110mT磁场时H.mediterranei的胞内PHA含量。
具体实施方式:
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明,但本发明并不限于以下实施例。
在实施例中,所用菌种为地中海富盐菌Haloferax mediterranei,菌种编号ATCC33500。
该菌株活化和富集培养基的配方为:氯化钠20.0g,氯化钾0.2g,七水合硫酸镁2.0g,硫酸亚铁1.0mg,柠檬酸钠0.3g,酪蛋白氨基酸0.75g,酵母提取物1.0g,用去离子水补足至100ml。同时,用氢氧化钠溶液调节培养基的pH值为7.2。
活化的方法为:用接种环挑取H.mediterranei,以划线的方式,接种至固体培养基平板,将培养皿放入37℃恒温箱中培养,直至形成粉红色菌落;
富集的方法为:挑取培养基上单个H.mediterranei菌株,接种至液体培养基中,将培养基放入37℃恒温摇床中培养,直至菌液的光浓度(optical density,OD600)为1.0。
该菌株的发酵培养液配方为:氯化钠240.0g,氯化钾4.8g,氯化钙0.66g,氯化铵2.28g,六水合氯化镁15.6g,七水合硫酸镁24.0g,碳酸氢钠0.3g,溴化钠0.6g,磷酸二氢钾0.58g,硫酸亚铁12.0mg,葡萄糖12g,SL-6微量元素1.2ml,用1.2L去离子水补足,(SL-6微量元素溶液按公知方法配备:每100ml含七水合硫酸锌0.1g,四水合氯化镁0.03g,硼酸0.3g,六水合氯化钻0.2g,二水合氯化铜0.01g,六水合氯化镍0.02g,一水合钼酸钠0.03g),用氢氧化钠溶液调节发酵液的pH值为7.2。
(1)将活化、富集后的H.mediterranei菌液接种在发酵罐(1)中,并加入发酵液;
(2)打开控制电磁铁主体装置(4)的稳压直流电源(4.4),打开低温循环水箱(4.2)向电磁铁水槽(4.1)供水,维持磁设备的温度在4℃;
(3)调节稳压直流电源(4.4)的电流强度,用高斯计测量磁场中发酵罐内部的磁场强度,使发酵罐内部的磁场强度控制在120mT;
(4)调节控温装置(1.1),将温度恒定在预设的发酵最优温度37℃;
(5)打开pH自动控制系统(2),向发酵罐内供给浓度为2mlo/L的氢氧化钠溶液(2.1),将发酵液的pH恒定在7.0;
(6)打开曝气泵(3),调节流量计(3.1),将溶解氧控制在2mg/L;
(7)磁场作用时间控制在72h,之后停止磁设备。
(8)发酵72h后停止曝气,完成发酵周期,提取发酵产物PHA。
对比实施例1
(1)将H.mediterranei按照以上方法进行活化和富集培养;
(2)配备发酵用培养液1.2L,以菌液:发酵液=1:20(v/v)的比值混合,倒入上述装置的发酵罐中,初始混合液中生化需氧量(COD)浓度为10000mg/L;
(3)不打开直流电源,无磁场产生;
(4)通过温控装置将发酵液温度维持在37℃,通过pH自动控制系统将发酵液的pH值控制在7.2,通过流量计将曝气量控制在1.0L/min,连续曝气发酵72h;
(5)发酵开始后计时,依次在发周期的0h、12h、24h、36h、48h、60h,72h进行取样,检测发酵液的COD和H.mediterranei的胞内PHA含量;
(6)该发酵中共消耗6135mgCOD,生产的PHA为共聚物PHBV,其胞内的PHA含量占细胞干重的63.5%。
对比实施例2
(1)将H.mediterranei按照以上的方法进行活化和富集培养;
(2)配备发酵用培养液1.2L,以菌液:发酵液=1:20(v/v)的比值混合,倒入发酵罐中,初始混合液中生化需氧量(COD)浓度为10000mg/L;
(3)打开直流电源给线圈通电,调节电源的电流大小为11A,所获得的场强度大小为110mT,打开低温循环水箱,维持电磁铁温度在4℃,保持磁场作用的状态72h,直至发酵结束;
(4)通过温控装置将发酵液温度维持在37℃,通过pH自动控制系统将发酵液的pH值控制在7.2,通过流量计将曝气量控制在1.0L/min,连续曝气发酵72h;
(5)发酵开始后计时,依次在发周期的0h、12h、24h、36h、48h、60h,72h进行取样,检测发酵液的COD和H.mediterranei的胞内PHA含量;
(6)该发酵中共消耗7509mgCOD,生产的PHA为共聚物PHBV,其胞内的PHA含量占细胞干重的76.7%。
通过两个对比实施例可以发现,本发明可以提高地中海富盐菌H.mediterranei对底物碳源的吸收,同时提高H.mediterranei的胞内PHA含量。相比于无磁场时,110mT磁场下发酵所消耗的COD提高了22.4%,H.mediterranei的胞内PHA含量增加了20.8%,提高了PHA的产量,降低了成本。
Claims (1)
1.一种提高Haloferax mediterranei发酵聚羟基脂肪酸酯产量的方法,其特征在于,所用装置包括与发酵罐(1)连接的控温装置(1.1)、高斯计(1.2);pH自动控制系统(2)连接氢氧化钠调节液(2.1),并与发酵罐(1)连接;通过曝气泵(3)、气体流量计(3.1)、曝气盘(3.2)向发酵罐(1)内进行曝气;将发酵罐(1)放置于电磁铁主体装置(4)内;电磁铁主体装置(4)内有电磁铁水槽(4.1)、低温循环水箱(4.2)、螺旋线圈(4.3)与稳压直流电源(4.4);
步骤如下:
1)将活化和富集后的H.mediterranei菌液接种在发酵罐(1)中,并加入发酵液;
2)打开控制电磁铁主体装置(4)的稳压直流电源(4.4),打开低温循环水箱(4.2)向电磁铁水槽(4.1)供水,维持磁设备的温度在4-10℃;
3)调节稳压直流电源(4.4)的电流强度,用高斯计测量磁场中发酵罐内部的磁场强度,使发酵罐内部的磁场强度控制在100mT-120mT之间;
4)调节控温装置(1.1),将温度恒定在预设的发酵最优温度37℃;
5)打开pH自动控制系统(2),向发酵罐内供给浓度为1-2mlo/L的氢氧化钠溶液(2.1),将发酵液的pH恒定在7.0-7.2之间;
6)打开曝气泵(3),调节流量计(3.1),将溶解氧控制在2-4mg/L;
7)磁场作用时间控制在60-72h,之后停止磁设备;
8)发酵完成后停止曝气,提取发酵产物PHA。
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GR01 | Patent grant | ||
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