CN111747851B - 络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了络石藤中具有抗炎活性的甘油酯类化合物及其制备方法，所述的甘油酯类化合物有两个，分别为1‑hexadecanoyl propan‑2,3‑diol化合物1和1‑heptadecanoyl propan‑2,3‑diol化合物2。其中化合物2为新化合物，并通过Griess法、ELISA等实验进一步研究化合物1的抗炎效果，结果显示化合物1对NO抑制作用的IC50值为15.76μM，对炎症因子TNF‑α和IL‑6也均具有一定的抑制作用，其中对IL‑6的抑制作用强于TNF‑α。实验还通过Western Blot考察了化合物1对RAW 264.7细胞中诱导型iNOS的蛋白表达，结果显示化合物1能够明显抑制RAW 264.7细胞中诱导型iNOS的蛋白表达，表明化合物1通过抑制炎症相关的iNOS的表达，从而抑制炎症的发生。本发明从络石藤中发现结构新颖的、具有抗炎活性的甘油酯类化合物，为制备抗炎新药奠定基础。

Description

络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及甘油酯类化合物，具体是一种从络石藤中提取分离出来的具抗炎活性的甘油酯类化合物。
背景技术
络石藤来源为夹竹桃科植物络石（Trachelospermum jasminoides（Lindl）Lem）的干燥带叶藤茎。在古代，络石藤主治风湿热痹、筋脉拘挛、腰膝酸痛、咽肿喉痹、诸疮肿毒、跌打损伤，外用出血等症；当前络石藤主要用于治疗风湿关节炎、肌肉痛，特别是伴有四肢拘挛，屈伸不便者，疗效显著。
据文献报道，络石藤抗炎成分主要为木脂素类成分，尤其是二苄基丁内酯类木脂素，络石藤中关于甘油酯类化合物的报道极少，而具有抗炎活性的甘油酯类化合物未见报道。
为了进一步从络石藤中发现新的抗炎活性成分，为新药开发奠定基础，发明人对络石藤进行了化学成分的深入研究。结合抗炎药效活性筛选，从络石藤中分离提取，并鉴定了具有抗炎活性的甘油酯类化合物。
发明内容
本发明公开一种从络石藤中提取分离出来的两个甘油酯类化合物，并公开了提取分离方法、结构鉴定，并对其中一个化合物抗炎活性进行了实验。
实现本发明目的的技术方案是：
络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物，所述的甘油酯类化合物有两个，分别为1-hexadecanoyl propan-2,3-diol化合物1和1-heptadecanoyl propan-2,3-diol化合物2，具有下述式所示结构：
。
上述络石藤的甘油酯类化合物的提取分离方法，包括如下步骤：
（1）将络石藤晒干之后粉碎，取粉碎后的络石藤20kg，加入95%乙醇水溶液没过络石藤表面，浸泡7-10天，减压浓缩回收乙醇得到总浸膏，将总浸膏悬浮于水置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂得乙酸乙酯部位479.8 g；
（2）将乙酸乙酯部位经正相硅胶柱，设置浓度梯度进行洗脱，依次得到洗脱流份I–XIII；
（3）将流份VI经MCI色谱柱层析，甲醇水梯度洗脱，得VI-1至VI-9 九个流份，VI-3经Sephadex LH-20凝胶柱，甲醇洗脱，重结晶得到1-heptadecanoyl propan-2,3-diol化合物2（20.0 mg）；
VI-9经Sephadex LH-20凝胶柱，50%甲醇水洗脱，再经ODS C18反相柱得到1-hexadecanoyl propan-2,3-diol化合物1（1.0 mg）。
步骤（2）所述的正相硅胶柱，洗脱剂采用体积比为，石油醚:丙酮=10:1，至氯仿:甲醇=1: 1梯度洗脱。
步骤（3）所述甲醇水梯度洗脱，其中甲醇水的浓度按30%、50%、70%、90%、100%梯度洗脱。
化合物1结构鉴定，根据质谱 (ESI-MS m/z 353 [M+Na]+)推测其分子式为C19H38O4；
1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ H : 0.87 (3H, t, J = 6.0 Hz, H-16'), 1.26 (24H,sbr, H-4' to H-15'), 1.62 (2H, t, J = 6.5Hz, H-3'), 2.33 (2H, t, J = 6.5 HzH-2'), 4.16 (1H, dd, J = 6.0,10.0Hz H-l), 3.93 (1H, p, J = 5.5 Hz, H-2), 3.63(dd, J = 6.0, 10.0 Hz, H-3); 13CNMR (100 MHz, CD3OD)δ C : 14.45 (C-16'), 23.75(C-15'), 33.09 (C-14'), 30.22, 30.43, 30.49, 30.61, 30.73, 30.79, 30.81 (C-4'to C-13'), 26.00 (C-3'), 34.94 (C-2'), 175.49 (C-l'), 66.47 (C-l), 71.15 (C-2), 64.06 (C-3)；以上数据与文献(Misra L, Siddiqi SA. n-Alkanes and α-Palmitinfrom Paspalum scrobiculatum Seeds. Zeitschrift für Naturforschung C, 2000, 55(c):500-502. )报道相一致，故鉴定为1-hexadecanoyl propan-2,3-diol。
化合物2结构鉴定，根据高分辨质谱 (HR-ESI-MS m/z: 389 [M + COOH]-)推测其分子式为C20H40O4，有2个不饱和度；
1HNMR (400 MHz, CD3OD) δ H : 0.87 (3H, t, J = 6.0 Hz, H-17'), 1.25 (26H,sbr, H-4' to H-16'), 1.62 (2H, t, J = 6.5Hz, H-3'), 2.34 (2H, t, J = 6.5 HzH-2'), 4.16 (2H, dd, J = 6.0, 10.0 Hz H-l), 3.92 (1H, p, J = 5.5Hz,H-2), 3.62(2H, dd, J = 6.0,10.0Hz, H-3); 13CNMR (100 MHz, CD3OD) δ C : 14.44 (C-17'),23.75 (C-16'), 33.09 (C-15'), 30.22, 30.42, 30.48, 30.61, 30.72, 30.76,30.79, 30.80 (C-4' to C-14'), 26.00 (C-3'), 34.95 (C-2'), 175.51 (C-l'),66.47 (C-l), 71.15 (C-2), 64.07 (C-3)。
化合物2与化合物1相比，化合物2的1H NMR和13C NMR数据与化合物1相似，只是H谱中在δ=1.62处有26H的强峰(CH2)，比化合物1多2个H，再结合高分辨质谱可知化合物2比化合物1分子量多14，可判定化合物2比化合物1的长链处多了1个亚甲基，故化合物2命名为1-heptadecanoyl propan-2,3-diol，该化合物为新化合物。
本发明从络石藤中发现结构新颖的、具有抗炎活性的络石藤的甘油酯类化合物，为制备抗炎新药奠定基础。
附图说明
图1 为化合物1（简称HPD）对LPS诱导RAW264.7细胞生成NO的抑制作用，注：与模型组相比，**P < 0.01；
图2为HPD作用24 h后对RAW 264.7细胞存活力的影响；
图3为HPD作用24 h后对LPS诱导RAW264.7细胞生成TNF-α抑制作用，注：与正常组相比，##P < 0.01；与模型组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；
图4为HPD作用24 h后对LPS诱导RAW 264.7细胞生成IL-6抑制作用，注：与正常组相比，##P < 0.01；与模型组相比，*P < 0.05，**P < 0.01；
图5为 HPD作用24 h后对LPS诱导RAW 264.7细胞iNOS表达量的影响，注：与正常组相比，##P < 0.01；与模型组相比，**P < 0.01。
具体实施方式
下面结合实验进一步说明络石藤的甘油酯类化合物1的抗炎效果。
使用Griess法测定络石藤中化合物1的抗炎活性，分别设置200、100、50、25、12.5、6.25 μM 6个浓度梯度，NO抑制率如图1所示，从图中可以看出，与阳性对照药吲哚美辛（IC50为26.36 μM）相比较，化合物1对LPS诱导RAW 264.7细胞生成NO有明显的抑制作用，IC50值为15.76 μM，因而对HPD进行进一步研究。
采用MTT比色法检测化合物HPD对细胞存活率的影响，如图2所示，分别设置200、100、50、25、12.5、6.25 μM 6个浓度梯度，孵育24 h，化合物各剂量组药物浓度时细胞均表现为无毒，细胞存活率均大于90%。
化合物HPD对RAW 264.7细胞中TNF-α 和IL-6的生成抑制作用结果，从表1 、图3和图4可以看出，正常组TNF-α 和IL-6表达量分别为285.00和41.72 Pg/mL，而模型组TNF-α和IL-6表达量达到了4414.46和2130.86 Pg/mL，说明炎症模型造模成功；其次与正常组和模型组比较，随着样品浓度增加TNF-α 和IL-6表达量都呈现出不同程度的下降，表明HPD对LPS诱导RAW 264.7细胞生成TNF-α 和IL-6均有一定的抑制作用，但相比之下，HPD对炎症因子IL-6的抑制作用更明显于TNF-α；
表1： HPD作用24 h后对LPS诱导RAW 264.7细胞生成TNF-α 和IL-6抑制作用
注：与正常组相比，##P < 0.01；与模型组相比，**P < 0.01
化合物HPD对RAW 264.7细胞中iNOS 蛋白表达结果，如图5所示，与正常组相比，模型组RAW 264.7 细胞iNOS相对蛋白表达量显著性升高（P＜0.01）；与模型组相比，随着浓度的增加HPD使RAW264.7 细胞iNOS相对蛋白表达量显著性降低（P＜0.01）。
一氧化氮（NO）是具有生物活性的气体分子，是细胞间信息传递的重要调节因子，并有介导细胞免疫和炎症毒性的功能。NO的过量生成与炎症密切相关，在急性炎症部位，致炎物质和炎症介质可诱导或增加NO的合成和释放，NO本身具有细胞毒性，还能与游离基团反应生成如ONOO-等的离子，导致毒性增加，从而促进炎症部位产生水肿和脓包。本实验通过NO抑制活性对络石藤化合物1进行筛选，与阳性对照药吲哚美辛相比，HPD能显著抑制NO的生成，表明HPD有不错的抗炎作用。通过ELISA实验对炎症因子TNF-α 和IL-6表达量进行了测定，结果表明HPD对LPS诱导RAW 264.7细胞生成TNF-α 和IL-6均有一定的抑制作用，其中HPD对炎症因子IL-6的抑制作用要优于TNF-α。
一氧化氮合酶（NOS）是催化NO合成的关键酶，主要有神经型（nNOS）、内皮型（eNOS）与诱导型（iNOS），前两者合称为构成型NOS（cNOS），产生的正常浓度极低；正常生理状态下诱导型（iNOS）几乎不表达，在受到脂多糖（LPS）、干扰素-α、白介素-1、肿瘤坏死因子-β等诱导而激活，可以以L-精氨酸为底物，在iNOS作用下，转化为L-瓜氨酸同时释放大量的NO，从而产生炎症反应。本实验中通过Western Blot考察了HPD对RAW 264.7细胞中诱导型iNOS的蛋白表达，结果显示HPD能够明显抑制RAW 264.7细胞中诱导型iNOS的蛋白表达，表明HPD可能是抑制炎症相关的iNOS的活性，从而抑制炎症的发生。

Claims (3)

1.络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物的提取分离方法，包括如下步骤：
（1）将络石藤晒干之后粉碎，加入95%乙醇水溶液，浸泡7-10天，减压浓缩回收乙醇得到总浸膏，将总浸膏悬浮于水置于分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂得乙酸乙酯部位；
（2）将乙酸乙酯部位经正相硅胶柱，设置浓度梯度进行洗脱，依次得到洗脱流份I–XIII；
（3）将流份VI经MCI色谱柱层析，甲醇水梯度洗脱，得VI-1至VI-9 九个流份，VI-3经Sephadex LH-20凝胶柱，甲醇洗脱，重结晶得到1-heptadecanoyl propan-2,3-diol化合物2，其结构式为：；
VI-9经Sephadex LH-20凝胶柱，50%甲醇水洗脱，再经ODS C18反相柱得到1-hexadecanoyl propan-2,3-diol化合物1，其结构式为：。
2.根据权利要求1所述的络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物的提取分离方法，其特征在于：步骤（2）所述的正相硅胶柱，洗脱剂采用体积比为，石油醚:丙酮=10: 1，至氯仿:甲醇=1: 1梯度洗脱。
3.根据权利要求1所述的络石藤中具抗炎活性的甘油酯类化合物的提取分离方法，其特征在于：步骤（3）所述甲醇水梯度洗脱，其中甲醇水的浓度按30%、50%、70%、90%、100%梯度洗脱。
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