CN111733097A

CN111733097A - 一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111733097A
Application number: CN202010558550.0A
Authority: CN
Inventors: 王楠; 徐磊; 孙浩杰; 毛开荣; 辛凌翔; 丁家波; 蒋卉; 任小侠
Original assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Current assignee: China Institute of Veterinary Drug Control
Priority date: 2020-06-18
Filing date: 2020-06-18
Publication date: 2020-10-02
Anticipated expiration: 2040-06-18
Also published as: CN111733097B

Abstract

本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。本发明诱导S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得具有良好遗传稳定性的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227；采用同源重组缺失技术从S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得了缺少wadC基因、具有良好遗传稳定性的光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1‑ΔwadC。本发明还提供一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，包含一定浓度配比的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1‑ΔwadC，免疫小鼠实验证明，本发明RS双价疫苗既具有较好的免疫保护和安全性，又可以实现自然感染抗体与免疫所涉及的脂多糖(LPS)抗体的鉴别诊断。

Description

一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及布鲁氏菌病保护菌株技术领域，尤其涉及一种布鲁氏菌病保护菌株及其制备方法与应用。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌细菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为多种动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

我国与人类布病有关的传染源主要是患病羊、牛。感染动物可从乳汁、粪便和尿液中排出病原菌，长期或终身带菌，当患病母畜流产时，大量病菌随着流产胎儿、胎衣和子宫分泌物一起排出，成为最危险的传染源。

布病疫苗是实施控制动物布病的重要手段。

我国现有的动物布病疫苗有：猪、牛、羊均可使用的布鲁氏菌活菌苗(S2 株)，主要用于羊的布鲁氏菌活菌苗(M5株)，以及从国外引进用于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)。其中，S2株应用最为广泛，据2011-2013年中国兽医药品监察所生物制品产品批签发的统计数据，我国每年使用S2株疫苗达1.5 亿头份以上，占动物布病疫苗的98％以上。

国际上，目前在使用的动物布病疫苗有：用于羊的布鲁氏菌活菌苗(Rev.1 株)，用于牛的布鲁氏菌活疫苗(A19株)及极少数地方在使用的布鲁氏菌活疫苗(RB51株)。

根据菌株表型的不同，布鲁氏菌病疫苗可分为光滑(Smooth，S)型疫苗和粗糙(Rough，R)型疫苗。普遍使用的为S型疫苗，但历史上曾经短暂使用过R型灭活疫苗45/20，上世纪90年代，美国批准了另一种R型布鲁氏菌病活疫苗RB51，但至今只有极少数地方使用。

S型活疫苗有较好的免疫效果，但免疫抗体会干扰对野毒感染的抗体诊断，并且存在一定的安全性问题；R型活疫苗能区分感染与免疫的涉及LPS抗体的诊断且安全性有所提高，但是其免疫保护弱于S型活疫苗。

本发明通过用诱变剂诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得粗糙(R)型布鲁氏菌RM227，通过同源重组由S型羊种布鲁氏菌Rev.1获得光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，两种菌株经优选配比，制备成布鲁氏菌病RS双价疫苗，本发明的RS双价疫苗既具有S型布鲁氏菌病活疫苗的良好免疫保护力，又兼具 R型布鲁氏菌病活疫苗能区分自然感染抗体与免疫所涉及的脂多糖(LPS)抗体的诊断，还具有与R型布鲁氏菌病活疫苗近似的安全性，为预防布鲁氏菌病提供一种新型疫苗。

发明内容

本发明公开一种布鲁氏菌病保护菌株，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌 Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。

所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌株，获得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19808。

所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养基中配制成R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌株，37℃恒温摇床培养3天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁氏菌RM227。

所述R型布鲁氏菌诱变培养基的制备方法为：取0.1克诱导剂吖啶黄溶于 100mL灭菌蒸馏水中，此为原液；取15g TSB溶于500mL蒸馏水中，121℃15min 高压灭菌，待其冷却至室温，加入上述配制原液0.5μL，置于37℃恒温摇床， 1天后取出备用，即为诱变培养基。

所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组基因获得菌株，获得的菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，于020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19807。

所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为：

(1)扩增羊种布鲁氏菌Rev.1的wadC基因上、下游同源臂，获得目的基因片段wadC-U和wadC-D；

(2)融合羊种布鲁氏菌的wadC基因上、下游同源臂，获得融合后目的片段wadC-UD；

(3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC 19-SacB，构建重组质粒pUC 19-SacB-wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1 感受态细胞中，再接种到氨苄平板培养基上，长出菌落后，将菌落原位复制接种到氨苄平板培养基和蔗糖平板培养基上，挑取氨苄板上长出而同时蔗糖板没有长出的菌落为单交换菌；挑取单交换菌菌落同时划线接种到氨苄板，蔗糖板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即为双交换菌；对双交换菌进行PCR鉴定，对确定获得的wadC缺失菌株，命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。

本发明还公开上述布鲁氏菌保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

本发明还公开一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，所述RS双价疫苗的生产菌株包含权利要求2或3所述的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和权利要求4或5所述的光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。

所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 的配比浓度为10^6-7:1；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑 (S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的配比浓度为10⁷:1。

所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为10¹¹CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC浓度为10⁴CFU/mL-10⁶CFU/mL；优选地，所述粗糙(R) 型布鲁氏菌RM227浓度为10¹¹CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 浓度为10⁴CFU/mL。

所述RS双价疫苗中还包括疫苗保护剂；优选地，所述疫苗保护剂为明胶蔗糖疫苗保护剂。

所述布鲁氏菌病RS双价疫苗采用冻干工艺制备，所述冻干工艺为已批注的布鲁氏菌病活疫苗常规冻干工艺。

本发明具有有益效果如下：

1、本实验通过诱导剂成功诱导了一株具有良好遗传稳定性的减毒株粗糙 (R)型布鲁氏菌RM227,诱导株RM227缺失基因中包含wboA和wboB基因，影响细菌的生长繁殖，较亲本株对小鼠巨噬细胞的增殖能力有着明显的下降。

2、本发明通过同源重组基因技术获得一株具有良好遗传稳定性的减毒株光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，缺失wadC基因，对细菌的生长繁殖无影响，其在胞内存活率低于亲本株。

3、将粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC 混合成双价疫苗，用其免疫小鼠，在一定浓度配比范围内，两者间既存在协同作用提高免疫保护，又可区分自然感染抗体与免疫所涉及脂多糖(LPS)抗体的诊断，而且安全性良好。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1.诱变剂诱导菌株结晶紫染色鉴定。

图2.PCR检测布鲁氏菌LPS合成相关基因，M：DNA marker 5000；1： manAoAg；2-3：manBoAg；4：Gmd；5：Pmm；6：Pgm；7：wbkA；8：wbkB；9： wbkC；10：wbkD；11：wbkE；12：wbkF；13：wboA；14：wboB；15：Wa**；16： Per；17：Wzm；18：Wzt；19：man Bcore；20：man Ccore。

图3.诱导株RM227布鲁氏菌R型特性检测，A热凝集试验:1.犬种布鲁氏菌RM6/66；2,羊种布鲁氏菌M111；3,诱导株RM227；4,亲本株Rev.1；B菌落结晶紫染色(左：Rev.1，右：RM227)；C吖啶黄凝集试验(1：Rev.1，2： RM227)。

图4.诱导株RM227和亲本株Rev.1生长曲线。

图5.巨噬细胞内存活测定(**,p≤0.01)。

图6.PCR扩增wadC基因上、下游同源臂，M：DNA Marker 2000；1：wadC-U 引物的PCR产物；2：wadC-D引物的PCR产物。

图7.wadC-UD融合PCR扩增，M：DNA Marker 2000；1：融合PCR扩增产物。

图8.转化菌落PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1-4：阴性质粒；5：阳性质粒。

图9.单交换子筛选结果。

图10.第一次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：Rev.1；3-5：检测菌。

图11.双交换子筛选结果。

图12.第二次同源重组PCR扩增鉴定，M：DNA Marker 2000；1：阴性对照；2：Rev.1；3-10：检测菌。

图13.内部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因缺失株。

图14.外部检测引物PCR鉴定Rev.1-ΔwadC传代30代遗传稳定性，M： DNA Marker1000；1：空白阴性对照；2：Rev.1；3-10：Rev.1-ΔwadC基因缺失株。

图15.亲本株Rev.1及其缺失株Rev.1-ΔwadC的生长曲线。

图16.Rev.1和Rev.1-ΔwadC在BMDC、RAW264.7细胞中的存活能力。

图17.RS双价苗各组抗体变化水平：虚线表示阳性判定标准；①-⑤：RS 双价苗①-⑤组。

图18.各组小鼠脾脏重：注：RS双价苗1-5组表示RS双价苗各组(免疫剂量由低到高)；S单价苗1-5组代表S单价苗各组(免疫剂量由低到高)；S 代表光滑型缺失株Rev.1-ΔwadC；R代表粗糙型诱导株M227。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

粗糙(R)型布鲁氏菌RM227于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19808，分类命名为Brucellamelitensis，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，于2020年5月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.19807，分类命名为Brucellamelitensis，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

实施例1、布鲁氏病菌RS双价疫苗的制备

一、布鲁氏菌RM227的制备

1、诱导剂诱导实验

(1)R型布鲁氏菌诱变培养基

取0.1克诱导剂吖啶黄(购自sigma)溶于100mL灭菌蒸馏水中(1mg/mL)，此为原液，常温保存备用。取15g TSB溶于500mL蒸馏水中，121℃15min高压灭菌，待其冷却至室温，加入上述配制原液0.5μL，置于37℃恒温摇床，1 天后取出备用，即为R型布鲁氏菌诱变培养基。

(2)诱导剂诱导菌株

取10mL R型布鲁氏菌诱变培养基，接种羊种布鲁氏菌Rev.1单菌落，置于37℃恒温摇床3天，倍比稀释涂板，培养单菌落，进行菌落结晶紫染色初步鉴定。

结果如图1所示，用放大镜观察菌落边缘着色情况:1号菌落边缘着色，界限不清晰；2号菌落边缘不着色，整齐，圆润。参照OIE手册及国内外报道进行对比，确定1号菌落染色特征与R型菌一致，表明1号菌落为R型布鲁氏菌，即使用诱导剂诱导成功。将此诱导的R型菌命名为RM227。对RM227挑取单菌落扩大培养，甘油保存于-80℃冰箱备用。

2、PCR检测布鲁氏菌LPS合成相关基因

根据GeneBank中目前已知与布鲁氏菌LPS合成相关的基因序列设计PCR 引物，引物序列见表1，用于扩增布鲁氏菌LPS合成相关基因的PCR引物序列。

表1布鲁氏菌LPS合成相关基因PCR引物

按照基因提取试剂盒方法提取布鲁氏菌诱导株基因组，并以此基因组为模板，表1序列为引物进行PCR扩增，PCR产物进行凝胶电泳，检测布鲁氏菌LPS 合成相关基因，结果如图2所示，亲本株Rev.1和诱导株RM227各基因都能得到良好的扩增。

3、表型(生物学特性)鉴定

(1)粗糙型特性

取诱导株制备成抗原分别进行热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色，同时亲本株作对照。

对诱导株进行R型特性鉴定试验，结果显示：热凝集试验(图3-A)中亲本株Rev.1其菌液不产生沉淀依旧混浊，诱导株RM227其菌液出现絮状沉淀而液体清亮，对照组犬种布鲁氏菌RM6/66、M111均显示出与R型特性一致。其次在菌落结晶紫染色试验中(图3-B)：亲本株Rev.1菌落不能被染成紫色，依然表面有光泽，而诱导株RM227菌落被染成紫色。吖啶黄凝集试验中(图3-C)： S型亲本株Rev.1菌体保持悬浮状态，无凝集现象；诱导株RM227出现肉眼可见凝集小颗粒。因此，诱导株RM227符合R型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，能被结晶紫染色，吖啶黄凝集试验阳性。

诱导株经热凝集试验，菌落结晶紫染色，吖啶黄凝集试验，结果显示均与 R型菌株特性一致，即成功诱导出一株R型菌株，命名为布鲁氏菌RM227。

(2)生长曲线测定

分别将亲本株Rev.1与诱导剂诱导菌株在相同的起始浓度(OD₆₀₀＝0.1)下，于37℃恒温摇床，180r/min条件下培养。每隔4小时取菌液一次，检测 OD₆₀₀的变化，直到细菌进入平台期即可，绘制亲本株和诱导株的生长曲线。

汇总所测OD值，绘得诱导株RM227和亲本株Rev.1生长曲线。见图4可知：RM227和Rev.1在0-12h生长趋势基本一致，之后亲本株生长速度明显快于RM227；在12-40h亲本株处于快速生长期，40h后即到达平台期；而诱导株在36-60h处于快速生长期，60h时即到达平台期；另外我们还可以看出，两者在16h和20h，差异显著(p≤0.05)；在24h、28h、32h、40h、44h、48h、 52h、56h、60h、64h、68h和72h，差异中度显著(p≤0.01)；在36h，差异极其显著(p≤0.001)。

(3)胞内存活试验

将诱导株RM227、亲本株Rev.1按100：1MOI(侵染比例)侵染RAW264.7 细胞，侵染后5个时间点计算胞内RM227、Rev.1各组的CFU，比较它们在巨噬细胞内存活能力的差异。结果如图5所示：0-24h，RM227组感染后的细胞内细菌CFU显著高于Rev.1组；24h，两者感染量相当；24-72h，RM227组与 Rev.1组计数结果相比，RM227组感染后的细胞内细菌CFU显著降低。

对诱导株RM227进行胞内存活实验结果显示：诱导株相较于亲本株对小鼠巨噬细胞的增殖能力有着明显的下降。

二、布鲁氏S型菌Rev.1-ΔwadC的构建

1、引物设计与合成

根据GenBank中公布的羊种布鲁氏菌Rev.1的wadC基因(登陆号： CUC12_03960)序列，使用Primer Premier 6软件分别设计wadC基因的上、下游同源臂扩增引物以及最终鉴定引物，设计的引物如表2所示。

表2引物和序列

2、wadC基因上、下游同源臂的扩增

以Rev.1基因组为模板，分别用wadC-UF/wadC-UR和wadC-DF/wadC-DR 引物对wadC基因上、下游同源臂进行PCR扩增。PCR扩增反应体系50μL：基因组模板1μL，F、R引物各1μL，Premix Taq(Ex Taq Version)25μL，ddH₂O 22μL。反应程序：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸 30s，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测正确片段大小后，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的基因片段回收。扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果如图6所示，符合预期的585bp和676bp 目的条带大小。

3、wadC基因上、下游同源臂的融合

wadC基因为模板，以wadC-UF/wadC-DR为引物进行PCR扩增。PCR扩增反应体系50μL：DNA模板2μL，上、下游引物各1μL，Premix Taq(Ex Taq Version) 25μL，ddH₂O 21μL。反应程序：95℃预变性1min；95℃变性30s，56℃退火 30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。1％琼脂糖凝胶电泳，回收目的基因片段，即可获得融合后目的片段wadC-UD。

对上述步骤2扩增产物凝胶电泳的2段目的基因进行回收融合PCR扩增，如图7所示，符合预期的1261bp融合基因片段大小。因此，成功扩增出wadC 基因上、下游同源臂，并融合成功。

4、重组质粒的构建及鉴定

质粒pUC 19-SacB：含有启动子序列的蔗糖敏感基因(SacBR)通过NdeⅠ 酶克隆入pUC18载体中，构建重组质粒pUC-SacB。

将融合片段wadC-UD插入pUC 19-SacB载体质粒，构建pUC 19-SacB-wadC 重组质粒。获得的质粒转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞之后，长出菌落以 M13-F和M13-R为引物进行菌落PCR鉴定。检测的阳性菌落扩大培养并测序比对。

如图8所示，经菌落PCR鉴定与预期片段1365bp大小相同，并且测序结果与目的片段一致，表明同源重组载体pUC19-SacB-ΔwadC构建完成。

5、布鲁氏S型菌株Rev.1-ΔwadC的构建及筛选

(1)单交换菌的筛选

将测序正确的菌液提取质粒后电转化到布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中，涂布于氨苄抗性的TSA固体培养基上培养单菌落。挑取培养的单菌落同时在含氨苄抗性固体培养基(以下简称氨苄板)和含5％蔗糖的固体培养基(一下简称蔗糖板)上划线，置于37℃恒温培养箱1-2天，氨苄板上长出菌落、同时蔗糖板完全没有长出菌落的电转菌即为单交换菌。使用wadC-UF和wadC-DR上、下游引物进行PCR扩增，对氨苄板上的菌落进行鉴定。

结果发现氨苄板上全部长菌、蔗糖板部分未长菌(图9)；挑取氨苄板长菌而蔗糖板不长菌所对应的菌落进行PCR：亲本株Rev.1阳性对照扩增产物长度为1795bp，而对于检测菌PCR鉴定发现均扩增出两个与预期一致的条带 (1795bp，1261bp，图10)。表明布鲁氏菌成功进行了第一次同源重组，为单交换菌。

(2)双交换菌的筛选

挑取鉴定为阳性的单交换菌，接种于无抗性TSB培养基中，37℃、180rpm 摇床培养24h。对菌液倍比稀释涂布于蔗糖板培养单菌落，挑取菌落同时在氨苄板和蔗糖板上划线，置于37℃恒温培养箱1-2天，此时蔗糖板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即为双交换菌。使用上下游引物wadC-UF 和wadC-DR进行PCR扩增，对蔗糖板上的菌落进行鉴定。利用载体的氨苄抗性和蔗糖敏感型自杀基因SacB进行反向筛选，并将鉴定正确的菌株命名为 Rev.1-ΔwadC。

涂板结果发现氨苄板全部未长菌、蔗糖板全部长菌(图11)；菌液PCR鉴定发现对于检测菌均扩增出一个目的条带(1261bp)，而未缺失亲本株Rev.1 仍然只扩增出1795bp大小目的条带(图12)。表明布鲁氏菌成功进行第二次同源重组，为双交换菌，也表明Rev.1-ΔwadC缺失株构建成功。

(3)稳定性分析

将Rev.1-ΔwadC菌株连续培养至30代，每5代对菌液用内部(wadC-Inner)、外部(wadC-Out)检测引物进行PCR鉴定和遗传稳定性分析。PCR产物通过 1％琼脂糖凝胶电泳检测，并将外部检测引物获得的胶块片段回收后，测序分析。

结果发现，与亲本株Rev.1相比，缺失株在菌落颜色、菌落大小、生长速度等方面均没有差异。使用内部检测引物进行菌落PCR鉴定，亲本株Rev.1扩增出246bp大小的目的条带，而缺失株Rev.1-ΔwadC并未扩增出条带(图13)；此外，使用外部检测引物Rev.1-ΔwadC扩增出大小为1906bp的目的条带，而亲本株Rev.1扩增出2471bp大小的条带(图14)。将缺失株连续传30代，均未发现回复和变异，此外测序结果与目标片段完全一致，说明其可以稳定遗传。

(4)生长特性检测

分别将亲本株Rev.1与缺失株Rev.1-ΔwadC以相同的起始浓度(OD₆₀₀ nm＝0.1)，于37℃恒温摇床，180r/min条件下培养。每隔4小时取菌液一次，检测OD₆₀₀ nm值的变化，直到细菌进入生长平台期即可，绘制亲本株和缺失株的生长曲线图。

从图15可以看出，缺失株Rev.1-ΔwadC与亲本株Rev.1生长趋势几乎一致，培养至20h两个菌株均到达对数生长期，44h细菌生长至平台期，可以看出缺失wadC基因并不会对细菌的生长繁殖产生影响。

(5)布鲁氏菌Rev.1和Rev.1-ΔwadC侵染BMDC以及RAW264.7细胞

参考Inaba等人的方法，分离小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)，并置于 6孔细胞板中培养，每孔10⁶个。分别使用对数生长期的亲本株Rev.1和缺失株Rev.1-ΔwadC按照感染比(MOI)100：1感染BMDC和RAW264.7细胞，感染1h、12h、24h、48h、72h分别用含0.1％triton的生理盐水裂解细胞，10倍系列稀释裂解液，在原倍、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4和10^-5稀释度各取100μL稀释液涂板并做三个平行对照，培养2-3天后统计菌落计数。比较亲本株Rev.1 和缺失株Rev.1-ΔwadC在BMDC和RAW264.7细胞中的复制繁殖能力。

结果显示，布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC在侵染骨髓来源的树突状细胞(BMDC) 48h和72h时，其胞内存活率显著低于亲本株(p<0.01)，表明其在BMDC中被杀死，尽管速度较低(图16-A)；而侵染小鼠RAW264.7巨噬细胞显示(图 16-B)，亲本株和缺失株胞内存活率在24h时达到最低，此后逐渐上升，三者之间无显著性差异(p>0.05)。

实施例2、RS双价苗小鼠免疫

1、诱导株RM227、缺失株Rev.1-ΔwadC和Rev.1菌液的制备

培养诱导株RM227与缺失株Rev.1-ΔwadC菌液，计数后，缺失株Rev.1- ΔwadC和Rev.1菌液用生理盐水稀释成10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵、10⁶CFU/mL，诱导株RM227稀释成10¹¹CFU/mL，待用。

2、小鼠的分组与免疫

120只BALB/C小鼠分12组，每组10只。对小鼠腹股沟皮下注射免疫，每只100μL，具体免疫剂量按照表3进行配比。

表3小鼠分组与免疫剂量

注：S单价苗代表光滑型亲本株Rev.1免疫组；R单价苗代表粗糙型诱导株M227免疫组；

RS双价苗代表粗糙型诱导株M227和光滑型缺失株Rev.1-ΔwadC联合免疫组

3、抗体效价测定

免疫后，小鼠每周采血并制备血清。采用微量凝集试验(Microagglutinationtest，MAT)方法对小鼠血清中抗体效价进行测定。其中，对于RS双价苗免疫组血清均分为两份，各用布病犬种试管凝集抗原(R型)和布病标准试管凝集抗原(S型)分别测其对应抗体效价，绘制抗体效价消长趋势图。

如图17所示，Rev.1-ΔwadC和RM227免疫BALB/c鼠均能诱导动物机体产生免疫应答，但是其免疫抗体在BALB/c鼠内消长曲线趋向不同，差异较明显。可以看出，所有RS双价苗免疫组R型抗体出现的时间全部早于S型 Rev.1-ΔwadC免疫抗体，并且早期其抗体效价增长速度也明显快于S型，这可能与免疫剂量有着直接的关系。

已知S型Rev.1-ΔwadC免疫剂量①组<②组<③组<④组<⑤组，于是从图中可以发现，S型抗体水平与免疫剂量呈正相关。图17-①、17-②以及17-③可以看出：R型抗体效价水平几乎一直高于S型抗体效价水平，另外RS双价苗各组中R型抗体在前5周内均高于S抗体。第6-8周R型抗体维持在较高水平，此后抗体水平开始下降，第12周以后抗体效价水平低于诊断线20以下或基本检测不到；而S型抗体效价在第7-8周维持在较高的水平，此后抗体效价开始下降，第10-12周抗体效价水平逐渐增高，这与M28的攻毒有着直接的关系。

另外，我们还能发现：对于图17-①组，S型抗体效价一直低于诊断线，而R型抗体效价是高于诊断线的，所以①组剂量的免疫有望解决免疫与自然感染的鉴别诊断，并且其能达到很高的免疫保护。

4、免疫保护力测定

小鼠免疫45天后，用羊种强毒株M28 1×10³CFU/只的剂量对每只小鼠攻毒，进行保护力测定试验。攻毒45天后，无菌扑杀取脾研磨，10倍系列稀释匀浆液，在原倍、10^-1、10^-2和10^-3稀释梯度各取100μL稀释液涂板并做三个平行对照，置于37℃恒温培养箱培养2-3天并计数，计算脾脏载菌量与脾脏指数，比较不同滴度免疫的保护力。

(1)免疫保护

通过对小鼠脾脏分离菌数的分析可知：对于RS双价苗免疫组，当免疫剂量为10³CFU/只(Rev.1-ΔwadC)+10¹⁰CFU/只(RM227)时，免疫保护率可达80％，与免疫剂量为10⁵CFU/只(Rev.1)S单价苗组保护率相近；RS双价苗①组与相对应的R单价苗组、S单价苗①组保护率相比，RS双价苗①组有很好的保护效果。PBS对照组小鼠脾脏10/10分离出细菌。具体见表4：

表4各组免疫小鼠保护率

RS双价苗代表粗糙型诱导株RM227和光滑型缺失株Rev.1-ΔwadC联合免疫组.

(2)脾重

无菌取脾，称量脾重，取各组脾重平均值，绘制图18。从图中可以看出： RS双价苗①组脾脏重略低于S单价苗⑤组，虽然这两组保护效果相当，但双价苗组对小鼠机体引起的病变程度相比来说较高，另外明显可以看出免疫各组脾脏重均低于对照组。由此说明，当RS双价苗与单价苗两组保护力较高并且相当时，RS双价苗对小鼠机体引起的病变程度略高，但均低于PBS对照组。

(3)不同剂量对小鼠免疫保护指数的比较

脾脏研磨培养后，统计脾脏含菌量并计算出各组小鼠出菌指数，结果显示，在对照组小鼠脾脏均分离到攻毒菌并且出菌指数为6.78的前提下，各免疫组的单位保护如表5所示。结果表明，RS双价苗①组和S单价苗⑤组的单位保护接近，证实一定剂量的R、S疫苗混合具有较好的免疫保护。

表5各组脾脏出菌指数

RS双价苗代表粗糙型诱导株RM227和光滑型缺失株Rev.1-ΔwadC联合免疫组；

SD：标准差.

通过使用RM227与Rev.1-ΔwadC混合疫苗进行免疫小鼠结果显示： Rev.1-ΔwadC疫苗剂量为10³CFU/只与RM227疫苗剂量为10¹⁰CFU/只混合免疫，M28攻毒剂量为10³CFU/只时，双价苗免疫组免疫效果最好，最高保护率达到80％，并且此组R型抗体效价达到阳性判定标准值20以上，而S型抗体效价低于此值。

因此，适当比例的R、S布鲁氏菌双价疫苗，具有良好的免疫保护率，并易于区分自然感染抗体与免疫所涉及脂多糖(LPS)抗体的诊断。

Claims

1.一种布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述菌株是由S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因获得的或缺失wadC基因获得的。

2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1随机突变缺失基因采用诱导突变技术获得菌株，获得的菌株命名为粗糙(R)型布鲁氏菌RM227，保藏编号为CGMCC NO.19808。

3.根据权利要求2所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227的制备方法为：取诱导剂加入TSB培养基中配制成R型布鲁氏菌诱变培养基，接种被诱变S型羊种布鲁氏菌Rev.1菌株，37℃恒温摇床培养3天，倍比稀释涂板，培养单菌落，用布鲁氏菌菌落结晶紫染色法初选R型菌落，再经表型鉴定，获得的R型布鲁氏菌，命名为布鲁氏菌RM227。

4.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述S型羊种布鲁氏菌Rev.1缺失wadC基因采用同源重组技术获得菌株，获得的菌株命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC，保藏编号为CGMCC NO.19807。

5.根据权利要求4所述的布鲁氏菌病保护菌株，其特征在于，所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的制备方法为：

(3)将融合片段wadC-UD插入载体质粒pUC 19-SacB，构建重组质粒pUC 19-SacB-wadC，将测序正确的重组载体Puc19-SacB-ΔwadC电转到布鲁氏菌Rev.1感受态细胞中，再接种到氨苄平板培养基上，长出菌落后，将菌落原位复制接种到氨苄平板培养基和蔗糖平板培养基上，挑取氨苄板上长出而同时蔗糖板没有长出的菌落为单交换菌；挑取单交换菌菌落同时划线接种到氨苄板，蔗糖板长出菌落、同时氨苄板完全没有长出菌落的电转菌即为双交换菌；对双交换菌进行PCR鉴定，对确定获得的wadC缺失菌株，命名为光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。

6.权利要求1-5任一项所述的布鲁氏菌保护菌株在制备布鲁氏菌病疫苗中的应用。

7.一种布鲁氏菌病RS双价疫苗，其特征在于，所述RS双价疫苗的生产菌株包含权利要求2或3所述的粗糙(R)型布鲁氏菌RM227和权利要求4或5所述的光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC。

8.根据权利要求7所述布鲁氏菌病RS双价疫苗，其特征在于，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的配比浓度为10^6-7:1；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227与所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC的配比浓度为10⁷:1。

9.根据权利要求7或8所述的布鲁氏菌病RS双价疫苗，其特征在于，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为10¹¹CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC浓度为10⁴CFU/mL-10⁶CFU/mL；优选地，所述粗糙(R)型布鲁氏菌RM227浓度为10¹¹CFU/mL；所述光滑(S)型布鲁氏菌Rev.1-ΔwadC浓度为10⁴CFU/mL。

10.根据权利要求7-9任一项所述的布鲁氏菌病RS双价疫苗，其特征在于，所述RS双价疫苗中还包括疫苗保护剂；优选地，所述疫苗保护剂为明胶蔗糖疫苗保护剂。