CN111727933A - 小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法。针对目前缺乏一种基底细胞癌动物模型的构建方法，制约基底细胞癌研究的问题，本发明提供了一种小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，包括以下步骤：a、将TE 354.T细胞进行培养，收集处于对数生长期的TE 354.T细胞；b、取步骤a的TE 354.T细胞与基质胶、PBS混合成混合溶液，采用混合溶液接种小鼠；c、接种2周后，肿瘤直径≥0.4cm并且成瘤率≥80％，表明成功建立原位基底细胞癌的动物模型。本发明的建模方法简单有效，建立的小鼠模型能够为科研工作者和临床医生的基于动物模型的科学研究提供条件，具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法。
背景技术
基底细胞癌属于非黑素瘤性皮肤癌，可发生于皮肤的任何部位，发病率高，疾病负担重，可向皮肤深部生长，进入皮下组织和骨骼，引起严重损害。因此，研究基底细胞癌的发病机制，探索其新型治疗靶点对于基底细胞癌的诊治具有重大意义。然而，由于目前国内可以使用的原位基底细胞癌模型缺乏，严重制约着基底细胞癌发病机制和诊治新策略的进一步研究。
而关于基底细胞癌动物模型的建立，也是一片空白，亟待开发研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：目前缺乏一种基底细胞癌动物模型的构建方法，制约基底细胞癌研究的问题。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法。该方法包括以下步骤：
a、细胞培养：将TE 354.T细胞在细胞培养基中培养，收集处于对数生长期的TE354.T细胞；
b、接种小鼠：取步骤a的TE 354.T细胞与基质胶、PBS混合成混合溶液，采用混合溶液接种小鼠；
c、评价：接种2周后，肿瘤直径≥0.4cm并且成瘤率≥80％，表明成功建立原位基底细胞癌的动物模型。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤a所述的TE 354.T细胞购自ATCC。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤a所述的培养基组成为：含10％血清的DMEM基础培养基。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述混合溶液的组成中，所述TE 354.T细胞与基质胶、PBS的体积比为：2︰1︰1。
进一步的，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述混合溶液的制备方法为：取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T 100ul，和50ul基质胶、50ul PBS混合，制备成细胞混悬液混合，即得混合溶液。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的基质胶是购自美国BD公司。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的小鼠为Balb/c雌性裸鼠。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的接种具体操作步骤为：将混合溶液皮下注射入Balb/c裸鼠腋窝处，注射剂量为200uL，其中细胞浓度为1×107/mL。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种新型的小鼠原位基底细胞癌模型的构建方法。该方法能够建立一种稳定的小鼠的原位基底细胞癌模型，用于基底细胞癌发病机制的研究、基底细胞癌新型治疗领域的研发和基底细胞癌新型治疗方法预后的判断。本发明采用基底细胞癌细胞株与基质胶及PBS的混悬液进行接种，有效防止了细胞回流，保障了后期建模的成功率。并且，本发明选取裸鼠腋下皮肤处进行建模，该部位延展性好，血供丰富且相对隐蔽，保证了成瘤效果。本发明提供的方法简单有效，建立的小鼠模型能够为科研工作者和临床医生的基于动物模型的科学研究提供条件，具有重要意义。
附图说明
图1所示为基底细胞癌细胞株TE 354.T的细胞形态；
图2所示为本发明裸鼠肿瘤生长前后对比图；
图3所示为本发明裸鼠成瘤后瘤体解剖图。
具体实施方式
本发明提供了一种小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，包括以下步骤：
a、细胞培养：将TE 354.T细胞在细胞培养基中培养，收集处于对数生长期的TE354.T细胞；
b、接种小鼠：取步骤a的TE 354.T细胞与基质胶、PBS混合成混合溶液，采用混合溶液接种小鼠；
c、评价：接种2周后，肿瘤直径≥0.4cm并且成瘤率≥80％，表明成功建立原位基底细胞癌的动物模型。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤a所述的TE 354.T细胞购自ATCC。将获得的TE 354.T细胞先进行培养，待细胞生长到对数期再建模，是由于基底细胞癌生长较慢，难以成瘤，只有取对数期生长的细胞才能保证细胞处于最佳的生长状态，具有相对最好的细胞活力。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤a所述的培养基组成为：含10％血清的DMEM基础培养基。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述混合溶液的组成中，所述TE 354.T细胞与基质胶、PBS的体积比为：2︰1︰1。
本发明特别的将TE 354.T细胞与基质胶、PBS混合，基质胶能有效防止细胞回流，利于接种，并且呈粉红色，有细胞流出时便于观察及补接；但基质胶也不是随意添加，越多越好，基质胶过多会增加悬液的整体密度，使注射阻力增大，不利于肿瘤细胞进入皮下。为了克服该缺陷，本发明在此基础上进一步混合了PBS，适当降低了整体混悬液的密度，在保证了基质胶防止细胞回流作用的同时降低了注射难度，增加了顺利进入皮下的肿瘤细胞总数。发明人经过大量筛选后得出，当TE 354.T细胞与基质胶、PBS的体积比为：2︰1︰1时，能够在保证肿瘤细胞含量的同时加入基质胶可以防止细胞回流，有利于模型的建立。
进一步的，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述混合溶液的制备方法为：取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T 100ul，和50ul基质胶、50ul PBS混合，制备成细胞混悬液混合，即得混合溶液。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的基质胶是购自美国BD公司。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的小鼠为Balb/c雌性裸鼠，为免疫缺陷鼠，无接触敏感性，无移植排斥反应。全部采用雌鼠，也避免了与雄性在一起饲养出现相互撕咬的情形，避免额外死伤，影响成瘤效果。
其中，上述小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法中，步骤b所述的接种具体操作步骤为：将混合溶液皮下注射入Balb/c裸鼠腋窝处，注射剂量为200uL，其中细胞浓度为1×107/mL。
本发明选取裸鼠腋下皮肤处进行建模，该部位延展性好，血供丰富且相对隐蔽，保障肿瘤生长所需空间及血供的同时避免因裸鼠饲养过程中因打斗等原因发生的机械损伤，影响成瘤效果。
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中所用的健康BALB/c雌性裸鼠，体重14～16g，4～5周龄，购于成都达硕动物有限公司，为实验专用裸鼠。实验动物全部饲养在四川大学华西医院华西科技园动物中心无特殊病原体(SPF)级动物房空气层流架内。Balb/c裸鼠分装于带空气过滤装置的饲养笼中饲养。笼具、垫料和饮用水均经消毒处理，饲料经高压灭菌。室内温度控制在26～28℃，相对湿度保持在40～60％。按需更换笼具及垫料，按需添加饲料及食用水。实验人员进行无菌操作。动物实验获得四川大学华西医院实验动物伦理委员会批准(伦理备案号：2017088A)。
实施例中所用的其他仪器和试剂均为普通市售产品。
实施例1细胞复苏及培养
将保存于-150℃冰箱中装有TE 354.T细胞的冻存管取出，及时置于37℃的水浴锅中并迅速摇动，使其快速完全解冻。预热20mL的DMEM完全培养基(含10％胎牛血清)(购自美国Gibco公司)。
75％酒精擦拭冻存管表面，放入紫外线已灭菌的超净工作台。
将TE 354.T细胞悬液移入含4mL DMEM完全培养基的15mL离心管。离心机800rpm离心3分钟。于超净工作台弃去离心管中的上清液，加入4mL DMEM完全培养基，与离心管底部细胞沉淀物混匀，制成细胞悬液。
在超净台中取规格为25cm2的培养瓶(T25培养瓶)，移入上述细胞悬液并晃动瓶身使细胞悬液均匀分布于培养瓶。用显微镜观察细胞状态，置于37℃、5％CO2浓度及95％饱和湿度条件下的恒温孵育箱中传代培养。根据细胞的状态和数量，每隔24h～48h更换1次DMEM完全培养基(5mL)。
倒置相差显微镜下观察TE 354.T细胞形态，TE 354.T细胞均呈单层贴壁生长，正常情况下呈多角形、成团生长(如图1所示)。
实施例2基底细胞癌动物模型建立
选取体重14～16g，4～5周龄的健康BALB/c雌性裸鼠28只，随机分配方案一上述裸鼠21只，方案三随机分配上述裸鼠7只，方案一中随机分为3组，每组7只，分别编号实验组1，2，3。
选取体重14～16g，4～5周龄的健康SCID小鼠21只，应用于方案二，随机分为3组，每组7只，分别编号为1，2，3。
选取体重14～16g，4～5周龄的健康昆明小鼠7只，应用于方案四。
各分组及试验情况如下表1所示。
表1不同的分组及处理方法
注：*成瘤后注射粉体容易不均匀、渗漏、影响肿瘤体积评估。
癌细胞悬液法操作步骤：用1mL注射器吸取配置好的细胞悬液浓度1×107/mL的细胞0.2mL。即细胞总数为1×106。碘伏消毒后，每只裸鼠皮下注射0.2mL，接种瘤细胞。注射后继续饲养裸鼠并仔细观察裸鼠全身及局部移植瘤生长情况。记录接种操作及接种后反应，观察是否有悬液漏出。接种后每2～3天观察，用游标卡尺测量肿瘤的最长径a(mm)和最短径b(mm)。
具体实施步骤：
取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T 100ul，和100ul基质胶，得到混合溶液，记为溶液A；
取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T 100ul，和50ul基质胶、50ulPBS混合，得到混合溶液，记为溶液B。
取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T 100ul，100ul PBS混合，得到混合溶液，记为溶液C。
分别取溶液A接种于方案一、二中的试验组1的小鼠，溶液B接种于方案一、二的试验组2的小鼠，溶液C接种于方案一、二中的试验组3的小鼠。接种剂量0.2mL。
组织匀浆法操作步骤：于超净工作台处死裸鼠，手术取出皮下肿瘤(来自于方案一)，测量长宽、称重并记录。眼科剪剪碎组织，使用组织研磨器研磨肿瘤组织(少许PBS)，约5分钟。匀浆后计算活细胞数，每只小鼠接种细胞数多为1×106～107。加入PBS(4℃保存)稀释组织碎屑(约1:1稀释)。200目实验网筛过滤，记录过滤后组织匀浆总体积。注射器(1mL注射器接6～7号针头)吸取1/10体积组织匀浆注射于待接种小鼠的皮下。记录接种操作及接种后反应，观察是否有匀浆漏出。接种后每2～3天开始观察，用游标卡尺测量肿瘤的最长径a(mm)和最短径b(mm)。
裸鼠肿瘤接种约28天后结束实验，1％戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉小鼠，仰卧位固定于解剖板上，常规消毒，完整取出肿瘤组织。考察相关指标：肿瘤体积按照公式(V＝a×b2×0.5)计算肿瘤体积(mm3)。
如图2所示，为肿瘤生长记录。
如图3所示，为裸鼠处死后肿瘤组织大体图。
由实验结果可知：仅有方案一中的实验组2建模成功。此实验组中的7只小鼠全部观察到肿瘤组织，建模成功率100％，平均肿瘤体积达到41.6mm3。方案一中的其他组及其他方案均无肿瘤生长。
可见，无法采用SCID小鼠、昆明小鼠构建基底细胞癌动物模型，而采用BALB/c裸鼠具有很好的建模效果；增加基质胶，可能是由于其能起到防止接种细胞回流的作用，能够提高建模成功率，通过将基质胶与PBS进行合理配比，能够达到100％的建模成功率。
因此，本发明首次获得了一种小鼠原位基底细胞癌模型的构建方法，建模成功率可达100％，其可用于基底细胞癌发病机制的研究，为后续基底细胞癌新型治疗领域的研发和基底细胞癌新型治疗方法预后的判断提供了基础。
Claims (8)
1.小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、细胞培养：将TE 354.T细胞在细胞培养基中培养，收集处于对数生长期的TE 354.T细胞；
b、接种小鼠：取步骤a的TE 354.T细胞与基质胶、PBS混合成混合溶液，采用混合溶液接种小鼠；
c、评价：接种2周后，肿瘤直径≥0.4cm并且成瘤率≥80％，表明成功建立原位基底细胞癌的动物模型。
2.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤a所述的TE 354.T细胞购自ATCC。
3.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤a所述的培养基组成为：含10％血清的DMEM基础培养基。
4.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤b所述混合溶液的组成中，所述TE 354.T细胞与基质胶、PBS的体积比为：2︰1︰1。
5.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤b所述混合溶液的制备方法为：取含有1×107/mL细胞的基底细胞癌细胞株TE 354.T100ul，和50ul基质胶、50ul PBS混合，制备成细胞混悬液混合，即得混合溶液。
6.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤b所述的基质胶是购自美国BD公司。
7.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤b所述的小鼠为Balb/c雌性裸鼠。
8.根据权利要求1所述的小鼠原位基底细胞癌动物模型的构建方法，其特征在于，步骤b所述的接种具体操作步骤为：将混合溶液皮下注射入Balb/c裸鼠腋窝处，注射剂量为200uL，其中细胞浓度为1×107/mL。
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| CN1730102A (zh) * | 2005-07-29 | 2006-02-08 | 上海第二医科大学附属第九人民医院 | 一种口腔鳞状细胞癌体外癌变模型 |
| CN1973047A (zh) * | 2004-06-22 | 2007-05-30 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于检测癌症的寡糖分布法 |
| US20140047570A1 (en) * | 2011-04-19 | 2014-02-13 | H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. | Animal model of human cancer and methods of use |
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