CN111721874A - 一种分离他达拉非与其手性异构体的hplc方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,包括参数:色谱柱:C18柱;流动相A相:由甲醇‑四氢呋喃‑水按体积比15:5:80混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc‑5‑氯‑DL‑色氨酸;流动相B相:由甲醇‑四氢呋喃‑水按体积比75:5:20混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc‑5‑氯‑DL‑色氨酸;洗脱方式:梯度洗脱;流动相流速:1.0mL/min;柱温:30℃。本发明提供了一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,他达拉非与其三种手性异构体在该HPLC色谱条件下能有效分离。本发明提供的方法只需要常规的C18反相硅胶柱,无需手性色谱柱,成本低。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域,具体涉及一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法。
背景技术
他达拉非是一种环磷酸鸟苷特异性磷酸二酯酶5(PDE-5)的选择性可逆抑制剂,能特异性的抑制PDE-5,现主要用于治疗勃起功能障碍(ED),能够有效的治疗各类疾病(糖尿病、高血压、BPH及LUTS、前列腺癌切除/放疗后)合并的ED,能使ED患者恢复自信与自尊,改善与性伴侣的关系,提高生活质量。另外,他达拉非在2009年先后被美国FDA和欧盟批准用于治疗肺动脉高压,提高患者的运动耐力。
他达拉非有两个手性中心,因此其有三个同分异构体,其中两个是非对映异构体,一个是对映异构体,四个化合物的化学式如下。
由于两个非对映异构体与他达拉非只有一个手性中心不同,因而易于分离开。难就难在他达拉非与其对映异构体的分离。
靖雅等提供了一种手性色谱柱分离他达拉非与其手性异构体的方法,使用了CHIRALPAK IB手性柱(HPLC测定他达拉非中的对映异构体和非对映异构体,中国现代应用药学2017年1月第34卷第1期)。但是,这种手性色谱柱较为昂贵,且使用寿命短,所以成本高。
手性流动相色谱法是一种采用添加了手性试剂的流动相进行手性异构体(对映体)分离的色谱技术。该方法使用普通填料的色谱柱即可实现手性异构体(对映体)的分离,成本低。
目前未见手性流动相色谱法成功用于他达拉非与其对映异构体分离的报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中存在的缺陷和不足,提供一种分离他达拉非与其对映异构体的HPLC方法。
实现上述目的的技术方案如下:
一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,包括如下色谱参数:
色谱柱:C18柱(250mm×4.6mm,5μm);
流动相A相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比15:5:80混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
流动相B相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比75:5:20混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
洗脱方式:梯度洗脱;
洗脱程序:0→10min,0%B→40%B;10→30min,40%B;30→35min,40%B→0%B;35→40min,0%B;
流动相流速:1.0mL/min;
柱温:30℃。
根据上述分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,色谱柱优选Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)。
根据上述分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,检测波长为285nm。
根据上述分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,进样量为10μL。
根据上述分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,分析时间为40min。
有益效果:
本发明提供了一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,他达拉非与其三种手性异构体在该HPLC色谱条件下能有效分离。本发明提供的方法只需要常规的C18反相硅胶柱,无需手性色谱柱,成本低。
附图说明
图1为流动相添加Boc-5-氯-DL-色氨酸的色谱图,其中:A为他达拉非单标溶液的色谱图,B为对映异构体单标溶液的色谱图,C为非对映异构体1单标溶液的色谱图,D为非对映异构体2单标溶液的色谱图,E为混标溶液的色谱图,可见混标溶液中的四个色谱峰的出峰时间分别与单标溶液中他达拉非、对映异构体、非对映异构体1、非对映异构体2的出峰时间一致,混标溶液中他达拉非与其三个手性异构体均实现两两基线分离;
图2为流动相不添加Boc-5-氯-DL-色氨酸的色谱图,其中:其中A为他达拉非单标溶液的色谱图,B为对映异构体单标溶液的色谱图,二者出峰时间相同。
具体实施方式
一、试验仪器和试剂
LC-20AT型高效液相色谱仪(日本岛津),配有紫外检测器及LC Solution工作站。
电子分析天平,梅特勒-托利多仪器上海有限公司。
他达拉非及其三种手性异构体对照品的纯度不低于98%。
Boc-5-氯-DL-色氨酸购自麦克林试剂,纯度不低于97%。
流动相使用的水为超纯水,有机溶剂为色谱纯试剂。
色谱柱为Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm),购自迪马科技。
二、试验方法和结果
1、溶液配制
他达拉非单标溶液的配制:精密称取他达拉非标准品2mg,置于20mL容量瓶中,甲醇溶解定容,备用。
对映异构体单标溶液的配制:精密称取对映异构体标准品2mg,置于20mL容量瓶中,甲醇溶解定容,备用。
非对映异构体1单标溶液的配制:精密称取非对映异构体1标准品2mg,置于20mL容量瓶中,甲醇溶解定容,备用。
非对映异构体2单标溶液的配制:精密称取非对映异构体2标准品2mg,置于20mL容量瓶中,甲醇溶解定容,备用。
混标溶液的配制:分别精密称取他达拉非、对映异构体、非对映异构体1和非对映异构体2标准品10mg,置于10mL容量瓶中,甲醇溶解定容,备用。
2、色谱条件
色谱柱:Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm);
流动相A相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比15:5:80混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
流动相B相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比75:5:20混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
洗脱方式:梯度洗脱;
洗脱程序:0→10min,0%B→40%B;10→30min,40%B;30→35min,40%B→0%B;35→40min,0%B;
流动相流速:1.0mL/min;
柱温:30℃;
检测波长:285nm;
进样量:10μL;
分析时间:40min。
3、进样分析
分别精密量取10μL他达拉非单标溶液、对映异构体单标溶液、非对映异构体1单标溶液、非对映异构体2单标溶液、混标溶液注入液相色谱仪,采集色谱图。色谱图如图1所示,其中A为他达拉非单标溶液的色谱图,B为对映异构体单标溶液的色谱图,C为非对映异构体1单标溶液的色谱图,D为非对映异构体2单标溶液的色谱图,E为混标溶液的色谱图,可见混标溶液中的四个色谱峰的出峰时间分别与单标溶液中他达拉非、对映异构体、非对映异构体1、非对映异构体2的出峰时间一致,混标溶液中他达拉非与其三个手性异构体均实现两两基线分离,分离效果优异。
同时,设置对比试验,对比试验色谱条件与上述试验的唯一区别在于流动相A相和B相中均不添加Boc-5-氯-DL-色氨酸,色谱图如图2所示,其中A为他达拉非单标溶液的色谱图,B为对映异构体单标溶液的色谱图,他达拉非与对映异构体在该色谱条件下出峰时间相同,为了避免共洗脱产生的过载对色谱柱的损伤,没有进样混标溶液。但是,通过单标溶液中他达拉非与对映异构体的保留时间,已经可以确信二者在该色谱条件下无法分离。
Claims (5)
1.一种分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,其特征在于,包括如下色谱参数:
色谱柱:C18柱(250mm×4.6mm,5μm);
流动相A相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比15:5:80混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
流动相B相:由甲醇-四氢呋喃-水按体积比75:5:20混合而成,并添加终浓度为200μg/mL的Boc-5-氯-DL-色氨酸,临用现配;
洗脱方式:梯度洗脱;
洗脱程序:0→10min,0%B→40%B;10→30min,40%B;30→35min,40%B→0%B;35→40min,0%B;
流动相流速:1.0mL/min;
柱温:30℃。
2.根据权利要求1所述的分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,其特征在于:色谱柱优选Diamonsil C18柱(250mm×4.6mm,5μm)。
3.根据权利要求1所述的分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,其特征在于:检测波长为285nm。
4.根据权利要求1所述的分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,其特征在于:进样量为10μL。
5.根据权利要求1所述的分离他达拉非与其手性异构体的HPLC方法,其特征在于:分析时间为40min。
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