CN111721840A

CN111721840A - 洛铂中有关物质的检测

Info

Publication number: CN111721840A
Application number: CN201910208835.9A
Authority: CN
Inventors: 窦啟玲; 汪立冬; 常新亮
Original assignee: Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd; Guizhou Yibai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hainan Changan International Pharmaceutical Co ltd; Guizhou Yibai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2020-09-29
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN111721840B

Abstract

本发明涉及一种洛铂中有关物质的检测。本发明提供了一种洛铂中有关物质的检测方法，所述有关物质选自化合物K、化合物I、化合物F或/和铂类物质M的一种或两种以上，其中：所述化合物F的结构为

化合物K的结构为

化合物I的结构为

铂类物质M为

或

和

或

Description

洛铂中有关物质的检测

技术领域

本发明涉及药物领域，特别涉及洛铂中有关物质的检测方法，属于药物分析质量控制技术领域。

背景技术

洛铂(Lobaplatin，D19466)，又名洛巴铂，是继顺铂、卡铂之后的第三代铂类抗肿瘤药物，其化学名称为：顺式-[反式-1,2-环丁烷双(甲胺)-N,N']-[(2S)-乳酸-O1,O2]-铂(II)，分子式为C₉H₁₈N₂O₃Pt，分子量为397.34，化学结构式如下式(a)所示：

洛铂具有烷化作用，属烷化剂(广义)，具有良好的抗肿瘤作用，如对离体AH135-瘤、B16-黑色素瘤、结肠癌115，在体小鼠P338白血病等具有很好的抑制作用。洛铂的特点是抗癌活性强，毒性低，无蓄积毒性和肾毒性，并且对骨髓毒性较小，目前已上市的注射用洛铂主要用于乳腺癌、小细胞肺癌及慢性粒细胞性白血病的治疗。

发明内容

为了保证该药物的安全、有效、质量可控，对其有关物质及有关物质的检测方法的研究显得十分重要。针对该药物，由于三个手性碳的存在以及制备过程产生的有关物质，因此确认有关物质结构以及寻找到合适的检测方法用于控制该药物的产品质量成为本领域急需解决的技术问题。

本发明要解决的技术问题是提供一种新的检测方法可以同时检测到洛铂中的多个有关物质。

本领域技术人员知道，任何影响药物纯度的物质统称为有关物质。有关物质的研究是药品研发的一项重要内容，它包括选择合适的分析方法，准确地分辨与测定有关物质的含量并综合药学、毒理及临床研究的结果确定有关物质的合理限度。这一研究贯穿于药品研发的整个过程。

具体来说，本发明通过如下技术方案实现的。

本发明提供了一种洛铂中有关物质的检测方法，其中，所述有关物质选自化合物K、化合物I、化合物F或/和铂类物质M的一种或两种以上，其中：

所述化合物F的结构为

化合物K的结构为

化合物I的结构为

铂类物质M为

的混合物。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物I经过中间体

制备得到，化合物K通过

制备得到，所述化合物F通过

制备得到。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述检测方法为HPLC法或者HPLC-MS法。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；优选的，梯度洗脱的方式如下：

0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

3～10分钟：流动相A从97体积％减少到92体积％，流动相B从3体积％增加到8体积％；

10～18分钟：流动相A从92体积％减少到87体积％，流动相B从8体积％增加到13体积％；

18～25分钟：流动相A从87体积％减少到10体积％，流动相B从13体积％增加到90体积％；

25～26分钟：流动相A从10体积％增加到97体积％，流动相B从90体积％减少到3体积％；

26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

其中，上述梯度洗脱的每段时间范围可以均增加1～2分钟或者可以从3～10分钟起的梯度洗脱时间范围可以均减少1～2分钟；

例如，梯度洗脱对应的时间范围可以为0～4分钟(或0～5分钟)、4～11分钟(或5～12分钟)、11～19分钟(或12～20分钟)、19～26分钟(或20～27分钟)、26～27分钟(或27～28分钟)、27～35分钟(或28～36分钟)；也可以设为0～3分钟、3～9分钟(或3～8分钟)、9～17分钟(或8～16分钟)、17～24分钟(或16～23分钟)、24～25分钟(或23～24分钟)、25～33分钟(或24～32分钟)；

优选的，化合物F的检测波长为219-221nm，化合物I、化合物K和铂类物质M的检测波长为234-236nm；流速为每分钟0.5-1.5ml，柱温为38-42℃。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，柱温为39-41℃，优选为40℃；优选的，所述醋酸铵溶液的浓度为9-11mmol，优选为10mmol；优选的，所述化合物F的检测波长为220nm，所述化合物I、化合物K和铂类物质M的检测波长为235nm，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈的体积比例＝1:1。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I和化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分峰面积；优选的，按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物F的相对保留时间为1.02-1.10，化合物I的相对保留时间为1.10-1.20，化合物K的相对保留时间为0.20-0.25，铂类物质M的相对保留时间为0.85-0.95；优选地，化合物F的相对保留时间为1.06，化合物I的相对保留时间为1.15，化合物K的相对保留时间为0.23，铂类物质M的相对保留时间为0.89。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述化合物F的校正因子为1.8-1.9，所述化合物I的校正因子为0.8-0.9，所述化合物K的校正因子为0.4-0.5；优选的，所述化合物F的校正因子为1.86，所述化合物I的校正因子为0.88，所述化合物K的校正因子为0.45。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述有关物质的峰与相邻有关物质的峰的分离度不小于1.5。

优选的，对于上述所述的检测方法，其中，所述洛铂包括洛铂非对映体Ⅰ和洛铂非对映体Ⅱ的任一种或两种。

本发明的有益效果如下：

本发明将化合物I和化合物K，化合物F以及铂类物质M中化合物G和化合物L进行了结构确认，确认洛铂中的有关物质，建立完整的洛铂质量检测体系，该方法可以同时检测洛铂中多个有关物质。该方法灵敏度高，专属性强，重复性好，准确度高，在洛铂药物的质量可控上具有重大的技术进步。

附图说明

图1-1A是实施例1中化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)；

图1-1B是实施例1中化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)

图1-2是实施例1中化合物I的HPLC-MS联用结构确认检测中MS图谱；

图2是实施例1中化合物I的¹H-NMR图谱；

图3是实施例1中化合物I的¹³C-NMR图谱；

图4是实施例1中化合物I的紫外吸收图谱，其中，1处的波长为220.5nm，2处的波长为196.5nm，3处的波长为205.5nm；

图5是实施例1中化合物I的红外吸收图谱；

图6是实施例1中化合物I的DSC曲线图；

图6A是实施例1中化合物I的HPLC图谱；

图7是实施例2中的反应混合物的HPLC图谱；

图8-1A是实施例2的化合物K在HPLC-MS结构确认中的HPLC图谱(215nm)；

图8-1B是实施例2的化合物K在HPLC-MS结构确认中的HPLC图谱(210nm)；

图8-2是实施例2的化合物K在HPLC-MS结构确认中的MS图谱；

图9是实施例2的化合物K的¹H NMR图谱；

图10是实施例2的化合物K的¹³C-NMR图谱；

图11是实施例2的化合物K的Q NMR图谱；

图12是实施例2的化合物K的HPLC图谱；

图13是实施例2的化合物K的UV图谱；

图14是实施例2的化合物K的IR图谱；

图15是实施例2的化合物K的DSC曲线图；

图16-1A是实施例4中化合物G1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)；

图16-1B是实施例4中化合物G1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)；

图16-2是实施例4中化合物G1的HPLC-MS联用结构确认检测中MS图谱；

图17是实施例4中化合物G1的¹H-NMR图谱；

图18是实施例4中化合物G1的¹³C-NMR图谱；

图19是实施例4中化合物G1的UV图谱；

图20是实施例4中化合物G1的IR图谱；

图21是实施例4中化合物G1的DSC图谱；

图22是实施例4中化合物G1的Q-NMR图谱；

图23是实施例4中化合物G1的HPLC图谱；

图24-1A是实施例4中化合物G2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)

图24-1B是实施例4中化合物G2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)

图24-2是实施例4中化合物G2的HPLC-MS联用结构确认检测中MS图谱；

图25是实施例4中化合物G2的¹H-NMR图谱；

图26是实施例4中化合物G2的¹³C-NMR图谱；

图27是实施例4中化合物G2的UV图谱；

图28是实施例4中化合物G2的IR图谱；

图29是实施例4中化合物G2的DSC图谱；

图30是实施例4中化合物G2的Q-NMR图谱；

图31是实施例4中化合物G2的HPLC图谱；

图32-1A是实施例6中化合物L1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)；

图32-1B是实施例6中化合物L1的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)；

图32-2是实施例6中化合物L1的HPLC-MS联用结构确认检测中MS图谱；

图33是实施例6中化合物L1的1H-NMR图谱；

图34是实施例6中化合物L1的¹³C-NMR图谱；

图35是实施例6中化合物L1的UV图谱；

图36是实施例6中化合物L1的IR图谱；

图37是实施例6中化合物L1的DSC图谱；

图38是实施例6中化合物L1的QNMR图谱；

图39是实施例6中化合物L1的HPLC图谱；

图40-1A是实施例6中化合物L2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为215nm)；

图40-1B是实施例6中化合物L2的HPLC-MS联用结构确认检测中的HPLC图谱(波长为210nm)；

图40-2是实施例6中化合物L2的HPLC-MS联用结构确认检测中的MS图谱；

图41是实施例6中化合物L2的¹H-NMR图谱；

图42是实施例6中化合物L2的¹³C-NMR图谱；

图43是实施例6中化合物L2的UV图谱；

图44是实施例6中化合物L2的IR图谱；

图45是实施例6中化合物L2的DSC图谱；

图46是实施例6中化合物L2的QNMR图谱；

图47是实施例6中化合物L2的HPLC图谱；

图48是实施例7中第二阶段所得到的滤饼的HPLC谱图；

图49是实施例8中化合物F的HPLC谱图；

图50是实施例8中化合物F的HPLC-MS结构确认中MS谱图；

图51是实施例8中化合物F的¹H NMR谱图；

图52是实施例8中化合物F的¹³C-NMR谱图；

图53是实施例8中化合物F的Q NMR谱图；

图54-1是实施例9-1中化合物F标识的典型图谱；

图54-2是实施例9-1中化合物I和铂类物质M的典型图谱；

图54-3是实施例9-1中化合物K、铂类物质M和化合物I的典型谱图；

图55-1是实施例10中波长为220nm的空白溶液的专属性示意图；

图55-2是实施例10中波长为235nm的空白溶液的专属性示意图；

图55-3是实施例10中波长为220nm的分离度溶液(RS-1)的专属性示意图；

图55-4是实施例10中波长为235nm的分离度溶液(RS-1)的专属性示意图；

图55-5是实施例10中波长为235nm的分离度溶液(RS-2)的专属性示意图；

图56-1是实施例10中波长为235nm的洛铂自身对照的线性关系示意图；

图56-2是实施例10中波长为220nm的洛铂自身对照的线性关系示意图；

图56-3是实施例10中化合物F的线性关系示意图；

图56-4是实施例10中化合物I的线性关系示意图；

图56-5是实施例10中化合物K的线性关系示意图；

图57-1是实施例11中化合物I对NCI-H460的抑制活性示意图；

图57-2是实施例11中STSP对NCI-H460的抑制活性示意图；

图58-1是实施例11中化合物I对95-D的抑制活性示意图；

图58-2是实施例11中STSP对95-D的抑制活性示意图；

图59-1是实施例11中化合物I对AGS的抑制活性示意图；

图59-2是实施例11中STSP对AGS的抑制活性示意图；

图60-1是实施例11中化合物I对OVCAR-3的抑制活性示意图；

图60-2是实施例11中STSP对OVCAR-3的抑制活性示意图；

图61-1是实施例11中化合物I对HL-60的抑制活性示意图；

图61-2是实施例11中STSP对HL-60的抑制活性示意图；

图62-1是实施例11中化合物I对THP-1的抑制活性示意图；

图62-2是实施例11中STSP对THP-1的抑制活性示意图；

图63-1是实施例11中化合物I对Jurkat Clone E6-1的抑制活性示意图；

图63-2是实施例11中STSP对Jurkat Clone E6-1的抑制活性示意图；

图64-1是实施例11中化合物I对DU 145的抑制活性示意图；

图64-2是实施例11中STSP对DU 145的抑制活性示意图；

图65-1是实施例11中化合物I对SK-NEP-1的抑制活性示意图；

图65-2是实施例11中STSP对SK-NEP-1的抑制活性示意图；

具体实施方式

本发明提供一种洛铂中多个有关物质的检测方法。下面将通过实施例说明本发明发现的与洛铂质量有关物质I、F、K以及M等制备，这些新物质的结构确认以及这些新物质化合物的抗肿瘤活性；并且进一步通过实施例来详细说明本发明关于洛铂中有关物质的检测方法。

其中，铂类物质M为化合物L1或L2和化合物G1或G2的混合物，而L1是下述结构中的一种，当L1为其中的一种结构时，另一种结构即为L2，具体结构为

或者

由于单晶培养失败，无单晶衍射检测数据，因此无法确认化合物L1和L2的绝对构型，但是可以确认的是两个手性对映体，除了单晶衍射外的其他检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物。

G1是下述结构中的一种，也就是说，当G1为其中的一种结构时，另一种结构即为G2，具体为：

或者

由于单晶培养失败，无单晶衍射检测数据，因此无法确认化合物G1和G2的绝对构型，但是可以确认的是两个手性对映体，除了单晶衍射外的其他检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物。

所述化合物F的结构为

化合物K的结构为

化合物I的结构为

铂类物质M为

的混合物。

在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，所述检测方法为HPLC法或者HPLC-MS法；优选的，所述HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；优选的，梯度洗脱的方式如下：

0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

在本发明优选的一种具体实施方式中，其中，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I和化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分峰面积；优选的，按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍。

优选的，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物F的相对保留时间为1.02-1.10，化合物I的相对保留时间为1.10-1.20，化合物K的相对保留时间为0.20-0.25，铂类物质M的相对保留时间为0.85-0.95；优选地，化合物F的相对保留时间为1.06，化合物I的相对保留时间为1.15，化合物K的相对保留时间为0.23，铂类物质M的相对保留时间为0.89。

具体是相对于洛铂非对映体II的保留时间。具体来说，作为洛铂化合物已知有2种异构体，即洛铂非对映体I和洛铂非对映体II，它们的结构式如下所述：

洛铂非对映体I(简称RRS)：

洛铂非对映体II(简称SSS)：

实施例中所述的化学物质没有标明的均为常规试剂的化学纯级别，其中，

化合物1和化合物20根据专利号为CN102093226B实施例1所述的方法制备得到，并经结构鉴定确认得到；

化合物4根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备；

化合物6和化合物13购自Matrix Scientific公司，纯度为≥97％；

氯亚铂酸钾购自上海久岳化工有限公司；

碘化钾购自广州化学试剂厂，为分析纯；

化合物12和化合物19购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司(Sigma-Aldrich)。

实施例1化合物I的制备

具体制备方法如下：

1)制备化合物2

ⅰ.将化合物1(30.0g,101.9mmol),氯亚铂酸钾(36.0g,86.7mmol),碘化钾(86.0g,518.1mmol)和氢氧化钾(24.0g,427.7mmol)分别溶于170mL,180mL,87mL和120mL纯化水,得A,B,C,D液。

ⅱ.将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。

ⅲ.将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。

ⅳ.将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。

ⅴ.将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌2小时。

ⅵ.过滤,滤饼用纯化水洗涤(100mL*6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物2(35g)为黄色粉末。

2)制备化合物3

将化合物2(5.0g,8.88mmol)分散至纯化水(21mL)和丙酮(3mL)中，得A料，将硝酸银(2.7g,15.9mmol)溶于纯化水(8mL)，加至A料,30℃避光搅拌18小时，过滤，滤饼用水洗涤6次(5mL*6)，合并滤液得3的溶液60mL直接用于下一步；

3)制备得到产品

将草酸钾一水合物(2.12g,11.51mmol)溶于纯化水(6.00mL)，加至步骤2)获得的3的溶液(60mL)中，30℃避光搅拌3小时，过滤,滤饼用丙酮(15mL*2)洗涤，干燥得产品(1.3g)类白色固体，取样检测HPLC,¹³CNMR,LCMS,¹HNMR。

对制备获得产物进行结构确认

1)HPLC-MS:

所使用的仪器型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

所用的HPLC-MS条件为：

其中，HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm、215nm、220nm和254nm(DAD检测器)，柱温为50℃。

表1梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(ml/min)
				0.00	99	1	0.8
0.04	99	1	0.8
				3.40	10	90	0.8
3.90	0	100	0.8
				3.91	99	1	0.8
4.00	99	1	1.0
				4.50	99	1	1.0

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1500。

其测定结果如下表所示：

表2测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			398.0,399.0,400.1	[M’ +H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
795.0	[2M’ +H]<sup>+</sup>	样品二聚合作用后的准分子离子峰

注：M’为化合物I的分子量

检测结果见附图1-1A，1-1B以及1-2，可以看出，该杂质为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在398.0、399.0、400.1处出现[M’ +H]⁺峰是样品准分子离子峰和795.0处出现样品二聚合作用后的准分子离子峰，对应于化合物I的分子量为397.29，质谱信息与本发明化合物I分子结构相符。

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:DMSO_400MHz)的化学位移及归属如下：

表3氢谱测定结果

谱图见附图2，可以看出，样品氢谱数据与化合物I分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:DMSO_400MHz)的化学位移及归属如下：

表4碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				22.72	仲碳	2	1,1’
39.35-40.60	仲碳	2	2,2’
				50.85	叔碳	2	3,3’
166.66	季碳	2	5,6

谱图见附图3，可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有4个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、2个不饱和季碳峰，这与化合物I的分子结构相符。

4)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:DMF；图谱见附图4。

从图4可以看出，化合物I在196.5nm处有最大紫外吸收。

5)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下：

表5红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3447.58,3236.86	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2937.56	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1697.05,1673.50,1653.80	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1384.59	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1234.96	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动

图谱见附图5。

6)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃

图谱见附图6。

从图6可以看出，化合物I在204.13℃开始熔融。

7)HPLC

仪器型号为SHIMADZU LC-20AB

HPLC的操作条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECTCSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表6梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(mL/min)
				0.01	95	5	1.0
5.00	82	18	1.0
				10.00	80	20	1.0
20.00	10	90	1.0
				20.01	95	5	1.0
28.00	95	5	1.0

谱图如图6A所示。

通过上述图谱确认了本发明的化合物结构为

实施例2：化合物K的制备及结构确认

具体制备方法如下：

将化合物4(5.0g,11.1mmol)溶于水(160mL)，加入双氧水(19.57g,172.60mmol),30℃搅拌5小时，取反应液HPLC检测到所要产物的保留时间位置(Rt＝0.576)，谱图见图7；其中，所使用的仪器型号为：SHIMADZU LC-20AB，(色谱柱:Waters XBridge C18(2.1*50mm*5um)；流动相A:水(+0.025(V/V)％NH₃·H₂O)，B：ACN]；柱温：40℃；按下表梯度洗脱

表7梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(ml/min)
				0.00	100	0	0.8
4.20	70	30	0.8
				5.30	70	30	0.8
5.31	100	0	0.8
				6.00	100	0	0.8

然后加入30质量％亚硫酸钠水溶液(76mL),搅拌12小时,将反应液浓缩至干，加入300mL甲醇，搅拌一小时，过滤，将滤液浓缩至干得黄色固体，黄色固体用prep.HPLC，使用的仪器型号：SHIMADZU LC-20AP(色谱柱:Phenomenex Synergi Max-RP(250*50mm*10um)；流动相A:水(10mmol/L NH₄HCO₃)，B：ACN]；0-16min梯度洗脱，流动相B的体积由0增大到95体积％)纯化得化合物5(1.9g,收率35.0％)为白色固体。

取样检测LCMS，¹H NRM,¹³C NMR，Q NMR。

对制备获得产物进行结构确认

1)HPLC-MS:

所使用的仪器型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

所用的HPLC-MS条件为：

HPLC条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent ZORBAX SB-Aq,2.1*50mm，5μm)，以0.0375体积％三氟乙酸为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为210nm和215nm(DAD检测器)，柱温为50℃。

表8梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(ml/min)
				0.00	10	90	1.2
1.50	10	90	1.2

MS条件：以单四级杆串联质谱仪检测，离子源为电喷雾(ESI)离子源，使用正离子扫描模式，监测模式为全扫描，扫描范围为100-1000。

其测定结果如下表所示：

表9测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			396	[M’-2H<sub>2</sub>O+H]<sup>+</sup>	样品失去两分子水的准分子离子峰
863.4	[2M’ +H]<sup>+</sup>	两倍样品加氢后的准分子离子峰

注：M’为化合物K(C₉H₂₀N₂O₅Pt)的分子量

测定图谱为附图8-1A，8-1B以及8-2，可以看出，该化合物K为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在396处出现[M’-2H₂O+H]⁺是样品失去两分子水的准分子离子峰及在863.4处出现[2M’ +H]⁺峰是两倍样品加氢后的准分子离子峰，质谱信息与化合物K(C₉H₂₀N₂O₅Pt)分子结构相符。

2)¹H-NMR

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR D₂O 400MHz)的化学位移及归属如下：

表10氢谱测定结果

谱图见附图9，可以看出，化合物K(C₉H₂₀N₂O₅Pt)的分子中含有6个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与化合物K(C₉H₂₀N₂O₅Pt)的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振

碳谱(¹³C NMR D₂O 400MHz)的化学位移及归属如下：

表11碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				21.12-21.60	伯碳	1	6
22.25-22.43	仲碳	2	1,1’
				38.92-39.77	仲碳	2	3,3’
48.59-49.74	叔碳	2	2,2’
				75.84-76.03	仲碳	1	5
192.05-192.28	季碳	1	7

谱图见附图10，从图10以及上表可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰这与所示化合物K的分子结构相符。

4)Q NMR

其是采用Bruker AVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD₃OD，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8％)，测定结果如下：

表12 Q NMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

谱图见附图11，从上表中可以看出，其标定含量为92.7％。

5)HPLC

所使用的仪器型号为：SHIMADZU LC-20AB

表13梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(mL/min)
				0.01	100	0	1.0
5.00	82	18	1.0
				10.00	80	20	1.0
20.00	10	90	1.0
				20.01	100	0	1.0
28.00	100	0	1.0

谱图如附图12所示。

从图12中可以看出，在保留时间为4.809min处出现了式K化合物的峰。

6)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水，图谱见附图13。

从图13可以看出，化合物K在190nm处有最大紫外吸收。

7)红外光谱(IR)

红外光谱仪：ALPHA-BRUKER；测定条件：固体KBr压片。测定范围：4000cm^-1～400cm^-1，测定结果及解析如下，图谱详见附图14：

表14红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3499.75	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2978.91	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1669.67	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1329.29	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1288.59	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1051.58	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

8)旋光度(OR)

旋光仪:Anton Paar MCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水)，25℃，结果如下:

表15旋光度测定结果

质量(mg)	体积(mL)	C(g/100mL)	旋光度(Optical Rotation)	比旋度(Specific Rotation)
					24.66	5	0.4932	-0.1115°	-22.607°

9)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELERDSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃图谱见附图15。

从图15可以看出，化合物K在162.59℃就开始熔融。

通过上述图谱确认了本发明的化合物K结构为

分子式为C₉H₂₀N₂O₅Pt，分子量为431.35。

实施例3化合物G1和G2的制备

具体制备方法如下：

1)制备化合物7

将化合物6(24.0g,226.1mmol)溶于无水四氢呋喃(THF，480mL)中,降温至0℃。0℃下,滴加10mol/L硼烷二甲硫醚(BH₃.Me₂S，其CAS号为13292-87-0，加入157mL,1.57mol)，保温搅拌1小时。体系升至40℃搅拌1小时。升温至65℃搅拌1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯体积比＝2/1)显示原料反应完全。将体系降温至0℃,用甲醇480mL淬灭反应,浓缩体系至干。加入正丁醇(350mL)升温至100℃搅拌16小时。得到化合物7粗品(42.0g),直接用于下一步。

2)制备化合物8

将化合物7(42.0g,粗品)溶于异丙醇(i-PrOH，400mL),得A液。将草酸(11.5g,127.7mmol)溶于异丙醇(115mL),得B液。将B液滴至A液,有大量白色固体(化合物3粗品)析出。将体系升温至70℃,搅拌1小时。过滤，滤饼加至常温THF(110mL)中，升温至65℃搅拌1h。过滤,滤饼干燥得化合物8(23.0g)为白色固体。

3)制备化合物9

将化合物8(17.0g,57.7mmol),氯亚铂酸钾(21.5g,51.9mmol),碘化钾(51.4g,309.7mmol)和氢氧化钾(14.6g,220.8mmol)分别溶于65mL，70mL，50mL和143mL纯化水，得A,B,C,D液。将B液升温至30℃，将A料搅拌，打散，将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液，将D液加至A液，搅拌，体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤，得F液，将F液加至E液，有黄色固体析出，继续在30℃下搅拌4小时，过滤，滤饼用纯化水洗涤(100mL*6)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物9粗品(19g,crude)为黄色粉末。

4)制备化合物10

将化合物9(19g)分散至水(82mL)和丙酮(9.5mL)中，搅拌10分钟。将硝酸银(10.4g,61.3mmol)溶于水(31mL)，加至体系，避光在20℃下搅拌16小时。过滤，滤饼用纯化水冲洗(30mL×5)，合并水相得化合物10(200mL)的水溶液直接用于下一步。

5)制备化合物11

用1.5mol/L氢氧化钠水溶液(150mL)处理树脂(80g，三菱化学株式会社，型号为DIAION SA10AX)，处理三遍。将化合物10的水溶液加热至30℃。将处理过的树脂一次性加至体系，搅拌1小时。过滤,树脂用纯化水洗涤(50mL×6)。合并水相得化合物11(500mL)的水溶液直接用于下一步。

6)制备化合物G1和G2

将化合物11(500mL)的水溶液置于烧瓶，用化合物12乳酸调体系pH＝6.6，升温至30℃,有少量黑渣生成，搅拌87小时。过滤，将水相冻干得到黄色固体。冻干片经制备液相高效液相色谱prep.HPLC，其型号为SHIMADZU LC-20AP(色谱柱:Phenomenex Synergi Max-RP(250*50mm*10um)；流动相A:水(10mM NH₄HCO₃)，B：ACN；0-17.8min梯度洗脱，流动相B由0增大到17.5体积％)两次纯化得化合物G1(1.45g)和化合物G2(1.54g)为白色固体。其中将先出峰的化合物标记为G1，后出峰的化合物标记为G2。

在随后的结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物G1和G2均对应于本实施例中制备得到的化合物G1和化合物G2，也就是说，本发明所称化合物G1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物G2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。

其中，G1和G2结构式均为下面两种结构中的任一种，当G1为其中一种结构时，G2是这2种结构的另一种，具体通过下面结构确认实施例来说明该结构的确认过程。

或者

实施例4：化合物G1和G2结构确认

对化合物G1和G2进行单晶培养，由于单晶培养失败不能确认最终两个化合物的具体具体结构，但是可以确认的是两个手性对映体，除了单晶衍射外的其他检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物。因此上述关于化合物G1和G2的结构确认都是指定。具体结构如下：

或者

1.化合物G1的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

表16梯度洗脱条件

检测结果如下表，

表17测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.1	[M’ +H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.1,440.2	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

图谱见附图16-1A,16-1B以及16-2，可以看出，该化合物G1为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.1处出现[M’ +H]⁺峰是样品准分子离子峰，在438.1、439.1、440.2左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于化合物G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:CD₃OD_400MHz)的化学位移及归属如下表所示，

表18氢谱测定结果

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.31-1.37	m	3	6
1.55-1.65	m	2	1,1’
				2.07-2.19	m	2	1,1’
2.70-3.01	m	6	3,3’,2,2’
				4.12-4.18	m	1	5

谱图见图17。

从上表和图17可以看出，化合物G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与化合物G1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:CD₃OD 400MHz)的化学位移及归属如下：

表19碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34-20.37	仲碳	2	1,1’
21.75	伯碳	1	6
				35.09-35.65	仲碳	2	3,3’
44.47-44.86	叔碳	2	2,2’
				74.83	仲碳	1	5
194.23	季碳	1	7

谱图见附图18。

从上表以及图18可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示化合物G1的分子结构相符。

4)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图19。

从图19可以看出，190nm处为最大紫外吸收波长。

5)红外光谱(IR)

表20红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3422.64,3253.80,3128.37	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2978.35,2937.71,2873.05	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1637.54,1615.10	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1363.46,1336.51	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1048.04	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

谱图见附图20。

6)旋光度(OR)

旋光仪:Anton Paar MCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水)，25℃；

结果如下：

表21旋光度测定结果

7)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图21。

从图21可以看出，第一个峰左极限为122.04℃，峰值为154.49℃，右极限为161.69℃；第二个峰左极限为161.69℃，峰值为177.73℃，右极限为240.05℃。

8)定量核磁共振(Q NMR)

仪器型号：Bruker AVANCE NEO 400；使用的溶剂为CD₃OD，采用内标法进行测定，内标物为苯甲酸苄酯(99.8％)，测定结果如下：

表22 Q NMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比；

图谱见附图22，从上表中可以看出，其标定含量为94.86％。

9)高效液相色谱(HPLC)

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB

HPLC的操作条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(PDA检测器)，柱温为40℃。

表23梯度洗脱条件

图谱见附图23。

从图23中可以看出，保留时间为7.815min时，出现了化合物G1的峰。

2.化合物G2的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

表24梯度洗脱条件

检测结果见下表，

表25测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			397.0，398.1，399.1,400.1,401.1	[M’ +H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
440.2	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

图谱见24-1A，24-1B以及24-2，可以看出，该化合物为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在397.0、398.1、399.1、400.1、401.1处出现[M’ +H]⁺峰是样品准分子离子峰、在440.2左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于化合物G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:CD₃OD 400MHz)的化学位移及归属如下：

表26氢谱化测定结果

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.28-1.35	d	3	6
1.44-1.65	m	2	1,1’
				2.10-2.22	m	2	1,1’
2.54-3.00	m	6	3,3’,2,2’
				4.10-4.18	m	1	5

图谱见附图25。

从上表和图25可以看出，化合物G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与化合物G2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:CD₃OD 400MHz)的化学位移及归属如下：

表27碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34	仲碳	2	1,1’
21.82	伯碳	1	6
				35.19	仲碳	2	3,3’
44.40-44.94	叔碳	2	2,2’
				74.85	仲碳	1	5
194.22	季碳	1	7

图谱见附图26。

从上表以及图26可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示化合物G2的分子结构相符。

4)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；

图谱见附图27。

从附图27可以看出，190nm处为最大紫外吸收波长。

5)红外光谱(IR)

表28红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3424.38,3217.09,3133.38	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2975.09,2868.01	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1636.72	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1350.46	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1110.91	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1048.04	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

谱图见附图28。

6)旋光度(OR)

旋光仪:Anton Paar MCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水)，25℃；结果如下：

表29旋光度测定结果

重量(mg)	体积(mL)	C(g/100mL)	旋光度(Optical Rotation)	比旋度(Specific Rotation)
					25.68	5	0.5136	-0.0482°	-9.385°

7)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃。图谱见附图29。

从图29可以看出，第一个峰的左极限为100.35℃，峰值为130.32℃，右极限为150.86℃；第二个峰的左极限为154.96℃，峰值为182.38℃，右极限为241.85℃。

8)定量核磁共振(Q NMR)

表30 Q NMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比；

谱图见附图30。

从上表可以看出，其标定含量为95.49％。

9)高效液相色谱(HPLC)

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB

表31梯度洗脱条件

图谱见附图31。

从图中可以看出保留时间为8.800min时，出现了化合物G2的峰。

实施例5：化合物L1和L2的制备

具体制备方法如下：

1)制备化合物14

将化合物13(24.0g,226.1mmol)分溶于无水四氢呋喃(THF，480mL)中,降温至0℃。0℃下,滴加10mol/L硼烷二甲硫醚(BH₃.Me₂S，其CAS号为13292-87-0)(157mL,1.57mol)，保温搅拌一小时。体系升至40℃搅拌1小时。升温至65℃搅拌1小时。TLC(石油醚/乙酸乙酯的体积比例＝2/1)显示原料反应完全。将体系降温至0℃，用甲醇480mL淬灭反应，浓缩体系至干。加入正丁醇(350mL)升温至100℃搅拌16小时。得到化合物14粗品(42.0g),直接用于下一步。

2)制备化合物15

将化合物14(42.0g,粗品)溶于异丙醇((i-PrOH，400mL),得A液。将草酸(11.5g,127.7mmol)溶于异丙醇(i-PrOH，115mL),得B液。将B液滴至A液,有大量白色固体(化合物15粗品)析出。将体系升温至70℃，搅拌1小时。过滤，滤饼加至常温THF(110mL)中，升温至65℃搅拌1h。过滤,滤饼干燥得化合物15(23.0g)为白色固体。

3)制备化合物16

将化合物15(23.0g,78.2mmol),氯亚铂酸钾(29.1g,70.2mmol),碘化钾(69.6g,419.0mmol)和氢氧化钾(19.7g,298.6mmol)分别溶于88mL,96mL,70mL和194mL纯化水,得A,B,C,D液。将B液升温至30℃。将A料搅拌，打散。将C液加至B液,搅拌0.5h,得E液。将D液加至A液,搅拌,体系变澄清，使用0.45微米滤膜过滤,得F液。将F液加至E液,有黄色固体析出,继续在30℃下搅拌4小时。过滤,滤饼用纯化水洗涤(50mL*5)至无卤素离子残留。滤饼经旋转蒸发仪干燥,得化合物16(24.0g)为黄色粉末。

4)制备化合物17

将化合物16(24.0g)分散至水(90mL)和丙酮(10.5mL)中，搅拌10分钟。将硝酸银(10.32g,60.75mmol)溶于水(90mL),加至体系,避光在20℃下搅拌16小时。过滤,滤饼用纯化水冲洗(30mL×5),合并水相得化合物17(300mL)的水溶液直接用于下一步。

5)制备化合物18

用1.5mol/L氢氧化钠水溶液(200mL)处理树脂(100g，三菱化学株式会社，型号为DIAION SA10AX),处理三遍。将化合物17(300mL)的水溶液加热至30℃。将处理过的树脂一次性加至体系,搅拌1小时。过滤,树脂用纯化水洗涤(40mL×4)。合并水相得化合物18(460mL)的水溶液直接用于下一步。

6)制备化合物L1和L2

将化合物18(460mL)的水溶液置于烧瓶。用化合物19乳酸调体系pH＝6.6，升温至30℃,有少量黑渣生成，反应87h。过滤,将滤液冻干。冻干品经制备型高效液相色谱prep.HPLC，仪器型号为Waters 80Q preparative SFC system(色谱柱:PhenomenexSynergi Max-RP(250*50mm*10um)；流动相A:水(10m mol/L NH₄HCO₃)，B：乙腈]；0-20min梯度洗脱，流动相B的体积由0增大到20体积％)两次纯化得化合物L1(0.775g)和化合物L2(0.882g)为白色固体。

在随后的结构确认实施例和活性测试实施例中，化合物L1和L2均对应于本实施例中制备得到的化合物L1和化合物L2，也就是说，本发明所称化合物L1为按照上述液相色谱条件制备化合物时先得到(即保留时间较短)的化合物，本发明所称化合物L2为按照上述液相色谱条件制备化合物时后得到(即保留时间较长)的化合物。

其中，L1和L2结构式均为下面两种结构中的任一种，当L1为其中一种结构时，L2是这2种结构的另一种，具体通过下面结构确认实施例来说明该结构的确认过程。

或者

实施例6：化合物L1和L2结构确认

将实施例5中步骤6)得到的纯化化合物L1和L2依次取样进行检测，包括高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)，核磁共振氢谱(¹H NMR)；核磁共振碳谱(¹³C NMR)；紫外吸收光谱(UV)；红外光谱(IR)；差示扫描量热(DSC)；旋光度(OR)。

由于单晶培养失败，无单晶衍射检测数据，因此无法确认化合物L1和L2的绝对构型，但是可以确认的是两个手性对映体，除了单晶衍射外的其他检测确认数据仅能确认所述相关物质为两个化合物，但是不能最终确认具体化合物。因此下述关于化合物L1和L2的结构确认都是指定。具体结构如下：

或者

分子式:C₉H₁₈N₂O₃Pt

分子量:397.33

1.对化合物L1的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

所用的HPLC-MS条件如下：

表32梯度洗脱条件

检测结果如下表，图谱见附图32-1A，32-1B以及32-2，可以看出，该化合物为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.2处出现[M’ +H]⁺峰是样品准分子离子峰、在438.1、439.1、440.2左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于化合物L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。

表33测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.2	[M’ +H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.2,440.2	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪氢谱(¹H NMR:氘代甲醇(CD₃OD)_400MHz)的化学位移及归属如下：

表34氢谱测定结果

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.31-1.35	m	3	6
1.55-1.64	m	2	1,1’
				2.07-2.19	m	2	1,1’
2.70-3.10	m	6	3,3’,2,2’
				4.12-4.18	m	1	5

谱图详见附图33。

从上表及附图33可以看出，化合物L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与化合物L1(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:CD₃OD_400MHz)的化学位移及归属如下：

表35碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.34-20.37	仲碳	2	1,1’
21.74	伯碳	1	6
				35.08-35.20	仲碳	2	3,3’
44.47-44.86	叔碳	2	2,2’
				74.83	仲碳	1	5
194.23	季碳	1	7

谱图见附图34。

从上表及附图34可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示化合物L1的分子结构相符。

4)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水，谱图见附图35。

从附图35可以看出，190nm处为最大紫外吸收波长。

5)红外光谱(IR)

表36红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3420.26,3253.53,3128.09	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2978.35,2937.71,2873.24	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1633.45	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1363.15,1336.41	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1047.80	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

谱图见附图36。

6)旋光度(OR)

旋光仪:Anton Paar MCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水),25℃；结果如下：

表37旋光度测定结果

质量(mg)	体积(mL)	C(g/100mL)	旋光度(Optical Rotation)	比旋度(Specific Rotation)
					24.95	5	0.499	+0.0381°	+7.635°

7)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELER DSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图37。

从附图37可以看出，第一个峰左极限为134.46℃，峰值为150.29℃，第二个峰左极限为154.94℃，峰值为175.96℃，右极限为245.06℃。

8)Q NMR

其是采用Bruker AVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD₃OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(Coumarin，99.74％)，如图38所示，测定结果如下：

表38 Q NMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

从上表中可以看出，其标定含量为89.8％。

9)HPLC分析

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB

表39梯度洗脱条件

谱图如附图39所示。

从图39可以看出，在保留时间为7.816min，出现了化合物L1的峰。

2.化合物L2的结构确认

1)HPLC-MS:

仪器名称和型号为：Agilent 1200 LC&Agilent 6110 MSD

所用的HPLC-MS条件为：

表40梯度洗脱条件

检测结果如下表，图谱见附图40-1A，40-1B以及40-2，可以看出，该化合物为含铂有机物，由于铂元素丰度较高的同位素有¹⁹⁴Pt,¹⁹⁵Pt,¹⁹⁶Pt，因此在样品的MS中，在397.1、398.1、399.1、400.0处出现[M’ +H]⁺峰是样品准分子离子峰、在438.1、439.1、440.1左右处出现[M’+CH₃CN+H]⁺峰是样品准分子离子峰，对应于化合物L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子量为397.33，质谱信息与化合物L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)分子结构相符。

表41测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			397.1,398.1,399.1,400.0	[M’ +H]<sup>+</sup>	样品的准分子离子峰
438.1,439.1,440.1	[M’+CH<sub>3</sub>CN+H]<sup>+</sup>	样品加乙腈的准分子离子峰

注：M’为C₉H₁₈N₂O₃Pt的分子量

2)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:CD₃OD_400MHz)的化学位移及归属如下：

表42氢谱测定结果

化学位移(ppm)	多重性	质子数	氢的归属
				1.28-1.30	m	3	6
1.52-1.65	m	2	1,1’
				2.07-2.18	m	2	1,1’
2.61-2.98	m	6	3,3’,2,2’
				4.07-4.16	m	1	5

谱图见附图41。

从上表及附图41可以看出，化合物L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)中含有4个活泼氢和14个不活泼氢；样品氢谱数据与化合物L2(C₉H₁₈N₂O₃Pt)的分子结构相吻合。

3)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:CD₃OD_400MHz)的化学位移及归属如下：

表43碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数	碳的归属
				20.21-20.48	仲碳	2	1,1’
21.83	伯碳	1	6
				35.20	仲碳	2	3,3’
44.40-45.05	叔碳	2	2,2’
				74.85	仲碳	1	5
194.21	季碳	1	7

图谱见附图42。

从上表及附图42可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有5个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰、1个饱和伯碳峰、1个不饱和季碳峰，这与所示化合物L2的分子结构相符。

4)紫外吸收光谱(UV):

紫外可见光谱仪:UV-2600 Series；测定温度:室温；测定范围:190-400nm；测定溶剂:水；图谱见附图43。

从附图43可以看出，190nm处为最大紫外吸收波长。

5)红外光谱(IR)

表44红外光谱测定结果

吸收峰波数(cm<sup>-1</sup>)	振动类型	基团归属
			3419.33,3216.73,3133.27	ν<sub>NH</sub>	氨基N-H伸缩振动
2974.96,2936.82,2868.12	ν<sub>CH</sub>	烷基C-H伸缩振动
			1637.12	ν<sub>C＝O</sub>	羰基C＝O伸缩振动
1350.04,1302.20	δ<sub>CH</sub>	烷基C-H弯曲振动
			1110.91	ν<sub>C-O</sub>	C-O键的伸缩振动
1046.93	ν<sub>C-N</sub>	C-N键的伸缩振动

谱图见附图44。

6)旋光度(OR)

旋光仪:Anton Paar MCP 500；测定条件:C＝0.5mol/L(水)，25℃；

结果如下:

表45旋光度测定结果

质量(mg)	体积(mL)	C(g/100mL)	旋光度(Optical Rotation)	比旋度(Specific Rotation)
					25.28	5	0.5056	+0.0581°	+11.491°

7)差示扫描量热法(DSC)

仪器型号:METTELERDSC1；升温速率:10.0℃/min；温度范围:40-350℃，图谱见附图45。

从附图45可以看出，第一个峰的左极限为96.08℃，峰值为124.04℃，第二个峰的左极限为154.33℃，峰值为179.13℃，第三个峰的左极限为22.80℃，峰值为232.55℃，右极限为280.40℃。

8)QNMR

其是采用Bruker AVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为CD₃OD，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(Coumarin，99.74％)，如图46所示，测定结果如下：

表46 Q NMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

从上表中可以看出，其标定含量为93.2％。

9)HPLC

仪器型号：SHIMADZU LC-20AB

表47梯度洗脱条件

谱图如附图47所示。

从图47可以看出，在保留时间为8.795min处，出现了化合物L2的峰。

实施例7化合物F的制备

具体制备方法如下：

第一阶段：将化合物20(7.5g，25.5mmol)分散于纯化水(37.5mL)中，得A料；然后将氢氧化钾(7.13g，108mmol)溶于纯化水(37.5mL)，加入至A料，30℃搅拌30分钟，用0.22μm滤膜过滤，得反应液B；

第二阶段：将氯亚铂酸钾(8.98g，21.6mmol)溶于纯化水(56.4mL)，将第一阶段所得到的反应液B加入其中，30℃搅拌16小时；然后过滤，滤饼用纯化水冲洗四次(100mL*4)，得固体，于40-50℃真空干燥，送样检测HPLC，仪器型号为SHIMADZU LC-20AB，其检测的具体操作方法为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XBridge C18，2.1*50mm，5μm)，以0.025％(V/V)NH₃·H₂O水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为215nm、220nm和254nm(PDA检测器)，柱温为40℃；

表48梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)	流速(ml/min)
				0.00	100	0	0.8
4.20	40	60	0.8
				5.30	40	60	0.8
5.31	100	0	0.8
				6.00	100	0	0.8

其结果如附图48所示；然后将滤饼溶于25mLDMF，加入25mL乙腈，搅拌15分钟；过滤得滤液，将100mL纯化水缓慢加入滤液中，搅拌30分钟，过滤得到滤饼，滤饼分别用100mL水，乙腈:水的体积比例＝1:1(25mL)洗涤，于40-50℃真空干燥得化合物21为灰色固体。

实施例8化合物F的结构确认

1)HPLC:

仪器型号为SHIMADZU LC-20AD

所用的HPLC条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters XSELECT CSHC18，4.6*150mm，3.5μm)，以10mmol醋酸铵为流动相A，甲醇为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；检测波长为235nm(DAD检测器)，流速为1ml/min，柱温为40℃。

表49梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)
			0	95	5
5	82	18
			10	80	20
20	10	90

谱图如附图49所示。

从图49中可以看出，在保留时间为8.922min处出现了式F化合物的峰。

2)LCMS

所使用的仪器型号为SHIMADZU LC20-MS2010

HPLC条件：用MERCK,RP-18e 25-2mm色谱柱，以水(+0.0375体积％三氟乙酸)为流动相A，乙腈(+0.01875体积％三氟乙酸)为流动相B，按下表程序进行洗脱；检测波长为220nm(UV检测器)，柱温为50℃。

表50梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)
			0	5	95
0.6	5	95

其测定结果如下表所示：

表51测定结果

m/e	碎片离子峰	备注
			398.2	[M’ +H<sub>2</sub>O]<sup>+</sup>	样品加上1分子水的离子峰

其中，M’为式(F)化合物的分子量。

检测结果见附图50，在样品的MS中，在398.2处出现[M’ +H2O]⁺峰是样品加上一分子水的分子离子峰，对应于式(F)化合物的分子量为380.18，质谱信息与式(F)化合物的分子结构相符。

3)¹H-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

氢谱(¹H NMR:DMF_400MHz)的化学位移及归属如下：

表52氢谱测定结果

化学位移(ppm)	多重性	质子数
			1.69	m	2
1.98	m	2
			2.54	m	2
2.98	m	4
			4.96	brs	2
5.26	brs	2

谱图见附图51，可以看出，样品氢谱数据与式(F)化合物的分子结构相吻合。

4)¹³C-NMR:

仪器名称：BRUKERBV-400型核磁共振仪

碳谱(¹³C NMR:DMF_400MHz)的化学位移及归属如下：

表53碳谱测定结果

化学位移(ppm)	碳原子类型	碳原子数
			22.58	仲碳	2
39.97	仲碳	2
			50.85	叔碳	2

谱图见附图52，可以看出，¹³C-NMR共振光谱图中有4个饱和仲碳峰、2个饱和叔碳峰，这与式F化合物的分子结构相符。

5)Q NMR

其是采用Bruker AVANCE NEO 400进行测定，使用的溶剂为DMSO，采用内标法进行测定，内标物为香豆素(99.74％)，测定结果如下：

表54 QNMR测定结果

W％的计算公式如下：

式中，W_ISTD为内标物的质量(mg)；

W_Sam为样品的质量(mg)；

A_Sam/A_ISTD为样品和内标物的面积比；

MW_SAM为样品的分子量；

MW_ISTD为内标物的分子量；

n_ISTD和n_Sam为各官能团的质子数；

W_ISTD％为内标物的质量百分比，

谱图见附图53，从上表中可以看出，其标定含量为98.37％。

通过上述图谱确认了本发明的化合物结构为

分子式为C₆H₁₂Cl₂N₂Pt，分子量为380.18。

实施例9-1：检测方法

按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验

所使用的仪器为Agilent1260，用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(WatersXselect HSS T3，4.6*150mm，3.5μm)，以10mmol/L醋酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:1为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml，柱温为40℃，检测波长为220nm检测化合物F，235nm检测化合物I、化合物K、铂类物质M和其他未知化合物。

表55梯度洗脱条件

时间(分钟)	流动相A(体积％)	流动相B(体积％)
			0	97	3
3	97	3
			10	92	8
18	87	13
			25	10	90
26	97	3
			34	97	3

系统适用性试验溶液的色谱图中，各已知化合物的峰与相邻化合物的峰分离度应不小于1.5；系统适用性试验溶液连续进样6次，主峰面积的相对标准偏差应不大于3.0％。

供试品溶液的制备取待测洛铂样品(根据专利CN 102020679 B说明书中实施例2公开的方法制备、并且经过结构鉴定确认得到的的洛铂样品，即本实施例加入洛铂三水合物作为待测洛铂，在各个实施例中涉及洛铂含量时均以洛铂无水物计)约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

系统适用性试验溶液/0.1％对照溶液的制备精密量取供试品溶液100μl，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照贮备液；精密量取对照贮备液1ml，置10ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液，同时作为0.1％对照溶液。

测定法取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至25分钟。

供试品溶液色谱图中如有洛铂有关物质的峰，以洛铂有关物质的标识色谱图中的色谱峰进行定位，化合物F标识的典型图谱详见附图54-1，化合物I和铂类物质M的典型图谱见附图54-2，化合物K、铂类物质M和化合物I的典型谱图见图54-3。

由附图54-1、附图54-2和附图54-3可以看出，在保留时间t＝15.598min处出现了洛铂非对映体I的峰，在保留时间t＝15.930min处出现了洛铂非对映体II的峰，在t＝16.842min出现了有关物质即本发明化合物F的峰，在t＝16.275min出现了有关物质即本发明化合物I的峰，在t＝3.687min出现了有关物质即本发明化合物K的峰，在t＝14.155min出现了有关物质即本发明铂类物质K的峰，化合物F的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.06，化合物I的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.15，化合物K的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.23，铂类物质M的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.89。按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I、化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分的面积；铂类物质M和其他未知化合物按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍，其他单一未知化合物的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的0.5倍。

表56各个化合物的校正因子

化合物名称	化合物F	化合物I	化合物K
				校正因子	1.86	0.88	0.45

实施例9-2：检测方法

按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验，其仪器型号与实施例9-1相同

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect HSS T3，4.6*150mm，3.5μm)，以8mmol/L醋酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:0.8为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml，柱温为38℃，检测波长为219nm检测化合物F，234nm检测化合物I、化合物K、铂类物质M和其他未知化合物。

表57梯度洗脱条件

供试品溶液的制备取待测洛铂样品(其来源与实施例9-1相同)约20mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加水超声溶解并至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

测定法取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至25分钟。供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物F的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.02，化合物I的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.10，化合物K的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.20，铂类物质M的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.85。按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I、化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分的面积；供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍，其他单一未知化合物的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的0.5倍。

表58各个化合物的校正因子

化合物名称	化合物F	化合物I	化合物K
				校正因子	1.86	0.88	0.45

化合物F、I、K、以及铂类物质M标识的典型图谱同实施例9-1一样。

实施例9-3：检测方法

按照高效液相色谱法(中国药典2015年版四部通则0512)测定

色谱条件与系统适用性试验其仪器型号与实施例9-1相同

用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Waters Xselect HSS T3，4.6*150mm，3.5μm)，以10mmol/L醋酸铵为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:1.2为流动相B，按下表程序进行梯度洗脱；流速为每分钟1.2ml，柱温为45℃，检测波长为222nm检测化合物F，240nm检测化合物I、化合物质K、铂类物质M和其他未知化合物。

表59梯度洗脱条件

系统适用性试验溶液的色谱图中，各已知有关物质峰与相邻有关物质峰分离度应不小于1.5；系统适用性试验溶液连续进样6次，主峰面积的相对标准偏差应不大于3.0％。

测定法取系统适用性试验溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图至25分钟。供试品溶液如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图色谱图中的色谱峰进行定位：化合物F的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.10，化合物I的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为1.20，化合物K的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.25，铂类物质M的相对保留时间(相对于洛铂非对映体II)约为0.95。按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I、化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分的面积；供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍，其他单一未知化合物的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的0.5倍。

表60各个化合物的校正因子

化合物名称	化合物F	化合物I	化合物K
				校正因子	1.86	0.88	0.45

化合物F、I、K以及铂类物质M标识的典型图谱同实施例9-1一样。

实施例10：检测方法的方法学验证

为了确认本发明检测方法的实用性和准确性，下面对检测方法的专属性、线性及范围、检测限和定量限、校正因子、准确度(回收率)、精密性、溶液稳定性、耐用性等方面进行说明：

1、专属性

精密量取空白溶液、浓度为0.02mg/l的分离度溶液RS-1和浓度为0.02mg/l的分离度溶液RS-2各20μL，注入液相色谱仪，结果如图55-1至55-5以及表61所示。

表61专属性结果-1

从图55-1至55-5以及表61可以看出，分离度大于3.0。

然后精密量取空白溶液、各条件下的强制降解溶液各20μL，注入液相色谱仪，其中，

碱破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品20.45mg于10mL容量瓶，加0.1mol/L氢氧化钠溶液0.5mL，放置3min，破坏后以0.1mol/L盐酸溶液0.5mL中和，稀释剂定容，作碱破坏溶液。

酸破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品20.47mg于10mL容量瓶，加入0.01mol/L盐酸溶液0.5mL，放置10min，破坏后以0.5mL0.01mol/L氢氧化钠溶液中和，稀释剂定容，作酸破坏溶液。

光照破坏溶液的制备方法为：称量在45,00lx光照强度下破坏10天的洛铂供试品20.18mg于10mL容量瓶，稀释剂溶解定容，作光照破坏溶液。

高温破坏溶液的制备方法为：称量在80℃高温条件下破坏3天的洛铂供试品20.02mg于10mL容量瓶，稀释剂溶解定容，作高温破坏溶液。

氧化破坏溶液的制备方法为：称量洛铂供试品19.96mg于10mL容量瓶，加0.5mL0.05％过氧化氢溶液，放置2min，稀释剂定容，结果如表62所示。

表62专属性结果-2

从表62可以看出，物料平衡在90％～110％之间，满足预期要求。

2、灵敏度

取化合物F溶液、化合物I溶液、化合物K溶液和洛铂对照品溶液，逐步稀释，以信噪比(S/N)3为检测限，信噪比(S/N)10为定量限，检测限结果如表63所示，定量限结果如表64所示。

表63检测限结果

样品	检测限浓度(μg/mL)	S/N
			化合物F	0.401	3.9
化合物I	0.127	3.4
			化合物K	0.020	5.3
洛铂对照品	0.199	4.7

表64定量限结果

从表63和表64可以看出，化合物F的检测限浓度为0.401μg/mL，定量限浓度为1.002μg/mL；化合物I的检测限浓度为0.127μg/mL，定量限浓度为1.015μg/mL；化合物K的检测限浓度为0.020μg/mL，定量限浓度为0.997μg/mL；洛铂对照品的检测限浓度为0.199μg/mL，定量限浓度为0.995μg/mL。

3、线性

以洛铂自身对照品的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，在235nm的线性结果如图56-1所示，在220nm的线性结果如图56-2所示。

从图56-1可以看出，在0.986μg/mL～3.942μg/mL范围内洛铂对照品的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝4.699X-0.109(235nm)，相关系数R2为1.000，表明线性关系良好；

从图56-2可以看出，线性方程为Y＝11.437X-0.427(220nm)，相关系数R2为0.999，表明线性关系良好。

以化合物F的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如图56-3所示。

从图56-3可以看出，在0.962μg/mL～3.848μg/mL范围内化合物F的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝6.138X+0.113(220nm)，相关系数R²为0.998，表明线性关系良好。

以化合物I的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如图56-4所示。

从图56-4可以看出，在0.994μg/mL～3.977μg/mL范围内化合物I的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝5.362X+0.104(235nm)，相关系数R²为1.000，表明线性关系良好。

以化合物K的浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，线性结果如图56-5所示。

从图56-5可以看出，在0.982μg/mL～3.927μg/mL范围内化合物K的浓度和峰面积呈良好的线性关系，线性关系为Y＝10.430X-0.141(235nm)，相关系数R²为1.000，表明线性关系良好。

4、精密度

由实验员A和B分别配制系统适用性溶液，然后分别精密量取系统适用性溶液20μL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如表65所示，洛铂主峰面积的RSD＜2％，精密度良好。

表65系统适用性精密度结果

由实验员A和B分别配制样品溶液，然后分别精密量取各样品溶液20μL，注入液相色谱仪，记录图谱，连续进样6次，结果如表66所示

表66各样品精密度结果

从表66可以看出，各化合物以及铂类物质M质量含量的RSD(n＝6)＜3％、RSD(n＝12)＜6％，精密度良好。

5、准确度

向供试品溶液中加入化合物F、I、K溶液，平行配制3份50％限度浓度、3份限度浓度和3份150％限度浓度的回收率溶液，考察各化合物的准确度。

结果表明，50％限度浓度下，化合物F的回收率在90％～105％之间，化合物I的回收率在100％～110％之间，化合物K的回收率在100％～105％之间；100％限度浓度下，化合物F的回收率在95％～110％之间，化合物I的回收率在95％～100％之间，化合物K的回收率在100％～105％之间；150％限度浓度下，化合物F的回收率在95％～105％之间，化合物I的回收率在95％～100％之间，化合物K的回收率在100％～105％之间，由此证明该方法的准确度良好。

6、溶液稳定性

分别量取供试品溶液，于0h、2h、3.5h、12h、14h进样，考察各化合物及铂类物质M的峰面积变化，结果如表67所示

表67溶液稳定性结果

备注：S＝(每个时间间隔溶液中各化合物或者铂类物质M的峰面积/0h时溶液中各化合物或者铂类物质M的峰面积)×100％

从表67可以看出，待测溶液中F在3.5h内S％在95％～105％之间为稳定；待测溶液中I、K、M在14h内S％在95％～108％之间为稳定。

7、耐用性

取系统适用性溶液，适当调整液相色谱系统中的参数，考察系统条件变化后的各化合物以及铂类物质M质量含量检测情况，结果如表68所示

表68耐用性结果

备注：U＝(改变条件后溶液中各化合物或者铂类物质M的质量含量/改变条件前溶液中各化合物或者铂类物质M的质量含量)×100％

从表68可以看出，系统条件微小变动后，各化合物以及铂类物质M的U％在90％～108％之间，表明该法的耐用性良好。

实施例11：体外抗肿瘤活性测定(本发明化合物I的活性测定实验)

一、试剂及耗材

1.细胞株，来自于中科院细胞库

表69细胞株

种属	细胞名称
		肺癌细胞	NCI-H460
前列腺癌细胞	DU 145
		白血病细胞	Jurkat Clone E6-1
胃癌细胞	AGS
		白血病细胞	HL-60
肾癌细胞	SK-NEP-1
		肺癌细胞	95-D
白血病细胞	THP-1
		卵巢癌细胞	OVCAR-3

2.DMEM培养基，中国Procell，货号：PM150210

3.MEM培养基，中国Procell，货号：PM150411

4.McCoy’s5A培养基，中国Procell，货号：PM150710

5.Ham's F-12培养基，中国Procell，货号：PM150810

6.

Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega，货号：G7572

7.96孔细胞培养板，美国Corning，货号：3610

8.Envision酶标仪，美国PerkinElmer

9.FBS，Lonsera，货号：S711-001S

10.丙酮酸钠，中国Procell，货号：PB180422

11.Insulin，中国上海源培，货号：S454

12.β-mercaptoethanol，Gibco，货号：21985

13.DMSO，美国Sigma，货号：D8418

14.Penicillin&Streptomycin(P/S)，中国Procell，货号：PB180120

15.0.25％胰酶-EDTA，中国Procell，货号：PB180228

16.RPMI-1640培养基，中国Procell，货号：PM150110

17.IMDM培养基，中国Procell，货号：PM150510

二、溶液与缓冲液

1.细胞生长培养基

配置完毕后，储存在4℃备用.

表70细胞及其培养基

细胞名称	培养基
		NCI-H460	RPMI-1640+10体积％FBS+1体积％P/S
DU 145	MEM+10体积％FBS+1体积％P/S
		Jurkat Clone E6-1	RPMI-1640+10体积％FBS+1体积％P/S
AGS	F-12+10体积％FBS+1体积％P/S
		HL-60	IMDM+20体积％FBS+1体积％P/S
SK-NEP-1	McCoy’s5A+15体积％FBS+1体积％P/S
		95-D	RPMI-1640+10体积％FBS+1体积％P/S
THP-1	RPMI-1640+10体积％FBS+0.05mMβ-mercaptoethanol+1体积％P/S
		OVCAR-3	RPMI-1640+20体积％FBS+0.01mg/ml Insulin+1体积％P/S

2.Heat-inactivated FBS热灭活血清

将血清于56摄氏度水浴30分钟即可。

3.化合物处理：

将实施例1制备得到的化合物I(3.19g)溶解于DMSO中配制浓度为1mM的溶液，在-20℃下保存待用。阳性对照药为星形孢菌素(Staurosporine)简称STSP(购自MedChemExpress(MCE)，货号为HY-15141)，是一种天然产物，最初于1977年由细菌霉菌Staurosporeus分离得到。

二、实验方法：

(1)复苏细胞

将需要复苏的细胞从液氮罐内迅速取出，在37℃水浴锅中融化，迅速加入预热的培养基中。1000转/分钟，离心5分钟后将离心管取出，弃去上清液，向离心管内加入新鲜预热的培养基，重悬细胞，然后将细胞悬液加入培养皿中，37℃，5体积％CO₂培养。

(2)细胞传代

细胞传代：贴壁细胞，当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶(由0.25g胰酶加入100mlpbs溶液配制而成)消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代，约2～3d传代1次。悬浮细胞，收集细胞悬液，800rpm，离心5分钟，去除上清，用新鲜培养基重悬，按照适当比例传代，约2～3d传代1次。

(3)化合物工作液浓度的配制

A.化合物单一浓度测试

根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液，再用培养基进一步稀释到50uM(5X最终浓度)工作液，化合物的测试浓度为10微摩尔，化合物的孵育时间为72小时。

B.化合物IC₅₀测试

根据检测要求，实验当天，将化合物使用DMSO稀释至1mM母液作为最高浓度，并进行2倍，3倍或5倍梯度稀释，再用培养基将每一个浓度点进一步稀释到5X最终浓度的工作液。

(4)细胞接种及药物处理

1.检测前1天，根据细胞生长速度将细胞按不同密度接种于96孔细胞板中，每孔接种80μL细胞悬液，37℃，5体积％CO₂培养箱，孵育过夜。细胞的具体铺板密度如下表：

表71细胞的铺板密度

细胞名称	密度(细胞/孔)
		NCI-H460	4000
DU 145	5000
		Jurkat Clone E6-1	10000
AGS	4000
		HL-60	8000
SK-NEP-1	3000
		95-D	3000
THP-1	15000
		OVCAR-3	5000

2.根据实验要求，每孔加入20μL化合物工作液，37℃，5体积％CO₂培养箱，孵育72小时。

3.结束孵育后，按照CTG试剂盒(购自promega，货号为G7572，名称为celltiter-glo)操作要求进行检测，得到相应化学发光值，计算细胞活性。

4.计算

细胞活率＝加药组RLU值/对照组(溶剂)RLU值×100％

(5)实验结果：

单一浓度10μM的化合物的抑制活性如下

表72化合物I的抑制活性

细胞名称	化合物I的细胞存活率(％)	对照的细胞存活率(％)
			NCI-H460	39.99	1.54
95-D	31.61	2.51
			AGS	34.66	3.11
OVCAR-3	45.97	5.15
			Jurkat Clone E6-1	8.39	0.93
HL-60	9.39	2.03
			THP-1	3.37	1.30
DU 145	46.31	14.27
			SK-NEP-1	10.38	3.07

本发明化合物I在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对Jurkat Clone E6-1、HL-60和THP-1的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。

测定的剂量-效应曲线见附图57-1至65-2，图中所述化合物为本发明有关物质的化合物I，其中横坐标为浓度，单位为微摩尔，纵坐标为细胞存活率。

化合物I的IC₅₀值如下：

表73化合物I的IC₅₀值

细胞名称	化合物I的IC<sub>50</sub>	对照(STSP)
			NCI-H460	1.08μM	40.35nM/40.41nM
95-D	1.8μM	56.48/50.42/69.34nM
			AGS	1.63μM	6.02/5.72/5.84nM
OVCAR-3	611.5nM	27.19/47.29/40.25nM
			Jurkat Clone E6-1	1.26μM	14.67/11.63/12.12/12.84nM
HL-60	3.56μM	17.1/17.42/17.06nM
			THP-1	1.82μM	73.02/74.45/42.58nM
DU 145	7.28μM	93.13/93.32nM
			SK-NEP-1	1.39μM	12.09/12.38/11.81/10.72nM

通过上述活性数据可以看出，本发明化合物I在10μM的浓度下对上述癌细胞具有较好的抑制活性，特别是针对Jurkat Clone E6-1、HL-60和THP-1的抑制率达到90％以上，具有显著的抑瘤活性，可以进一步开发为抗癌药物应用于临床。

Claims

1.一种洛铂中有关物质的检测方法，其特征在于，所述有关物质选自化合物K、化合物I、化合物F或/和铂类物质M的一种或两种以上，其中：

所述化合物F的结构为

化合物K的结构为

化合物I的结构为

铂类物质M为

的混合物。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述化合物I经过中间体

制备得到，化合物K通过

制备得到，所述化合物F通过

制备得到。

3.根据权利要求书1或2所述检测方法，其中所述检测方法为HPLC法或者HPLC-MS法。

4.根据权利要求3所述检测方法，其中所述HPLC法的检测条件为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以8-12mol/L的醋酸铵溶液为流动相A，甲醇：乙腈的体积比例＝1:(0.8-1.2)为流动相B，进行梯度洗脱；优选的，梯度洗脱的方式如下：

0～3分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

26～34分钟：97体积％流动相A：3体积％流动相B；

5.根据权利要求4所述检测方法，其中，柱温为39-41℃，优选为40℃；优选的，所述醋酸铵溶液的浓度为9-11mmol，优选为10mmol；优选的，所述化合物F的检测波长为220nm，所述化合物I、化合物K和铂类物质M的检测波长为235nm，所述流速为每分钟1ml，所述甲醇：乙腈的体积比例＝1:1。

6.根据权利要求3-5任一项所述检测方法，其中，按加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中化合物F、化合物I和化合物K的峰面积均不得超过对照溶液中主成分峰面积；优选的，按不加校正因子的主成分自身对照法以峰面积计算，供试品溶液中铂类物质M的峰面积不得超过对照溶液中主成分峰面积的10倍。

7.根据如权利要求1-6任一项所述检测方法，其中，供试品溶液色谱图中如有有关物质峰，以有关物质标识色谱图中的色谱峰进行定位：化合物F的相对保留时间为1.02-1.10，化合物I的相对保留时间为1.10-1.20，化合物K的相对保留时间为0.20-0.25，铂类物质M的相对保留时间为0.85-0.95；优选地，化合物F的相对保留时间为1.06，化合物I的相对保留时间为1.15，化合物K的相对保留时间为0.23，铂类物质M的相对保留时间为0.89。

8.根据权利要求1-7任一项所述的检测方法，其中，所述化合物F的校正因子为1.8-1.9，所述化合物I的校正因子为0.8-0.9，所述化合物K的校正因子为0.4-0.5；优选的，所述化合物F的校正因子为1.86，所述化合物I的校正因子为0.88，所述化合物K的校正因子为0.45。

9.根据权利要求1-8任一项所述的检测方法，其中，所述有关物质的峰与相邻有关物质的峰的分离度不小于1.5。

10.根据权利要求1-9任一项所述的检测方法，其中，所述洛铂包括洛铂非对映体Ⅰ和洛铂非对映体Ⅱ的任一种或两种。