CN111718969A

CN111718969A - β-丙氨酸的制备方法

Info

Publication number: CN111718969A
Application number: CN201910212635.0A
Authority: CN
Inventors: 苏金环; 曾聪明; 邱贵森; 刘文杰
Original assignee: Guang'an Mojia Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guang'an Mojia Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2020-09-29

Abstract

本发明提供了一种β‑丙氨酸的制备方法，包括：将含有富马酸和氨水的反应物在催化剂存在下制备得到β‑丙氨酸产物，其中所述催化剂包含含有天冬氨酸酶和L‑天冬氨酸‑α‑脱羧酶的催化组合物，并且在反应过程中加入富马酸，而且加入的富马酸的摩尔总量等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量。

Description

β-丙氨酸的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种酶催化制备β-丙氨酸的方法。

背景技术

β-丙氨酸，又名β-氨基丙酸或3-氨基丙酸，是自然界中存在的β型非蛋白氨基酸。β-丙氨酸是一种多用途的有机合成原料，主要用于合成泛酸和泛酸钙、肌肽、帕米膦酸钠、巴柳氮等，在医药、饲料、食品等领域应用广泛，有着非常大的市场需求。

目前β-丙氨酸的生产方法分为化学合成法和生物法两大类，因化学法合成β-丙氨酸研究较早，工艺成熟，所以仍是国内外主要采用的生产方法。

化学法生产β-丙氨酸主要有两种方式，一是丙烯腈与氨在高温高压下反应制备，该方法成本低，但由于副反应存在，产物分离困难；二是β-氨基丙腈与氢氧化钡高温条件下水解生成，该方法产率高，但由于反应过程中生成大量无机盐同样存在分离问题。

化学法普遍存在反应条件苛刻，设备要求高，环境污染等问题，因此随着β-丙氨酸使用量的不断增加，生物法以其反应条件温和，效率高，环境友好的优点逐渐成为研究热点。

生物法生产β-丙氨酸大都是利用能产特定酶的微生物转化底物生成β-丙氨酸，例如浙江工业大学(CN1285730)利用氨基化酶将丙烯酸和氨合成β-丙氨酸，该方法反应效率高，成本低，但由于原料具有强腐蚀性和刺激性，目前未有工业化应用报道。川利洋等(JP10-42886)利用有机腈水解酶催化β-氨基丙腈合成β-丙氨酸，该方法原料价格高，反应浓度低，成本较高，难以达到工业化生产要求。

另一种生物法合成β-丙氨酸是利用L-天冬氨酸-α-脱羧酶特异性地脱去L-天冬氨酸的α羧基生成β-丙氨酸。但是现有方法中存在酶活不高，酶稳定性差的问题。

发明内容

本发明提供了一种β-丙氨酸的制备方法，包括：将含有富马酸和氨水的反应物在催化剂存在下制备得到β-丙氨酸产物，其中所述催化剂包含含有天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化组合物，并且在反应过程中加入富马酸，而且加入的富马酸的摩尔总量等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量。

在某些实施方式中，所述催化组合物含有纯化的天冬氨酸酶和纯化的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。在某些实施方式中，所述催化组合物含有表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述菌体包括湿菌体、固定化菌体或菌体破碎液。在某些实施方式中，所述菌体来源于重组工程菌。在某些实施方式中，所述菌体包含单独表达天冬氨酸酶的菌体和单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述单独表达天冬氨酸酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为0.5％～4％(w/w)；并且所述单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～30％(w/w)。在某些实施方式中，所述菌体包含共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～40％(w/w)。在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶来源于Anoxybacillus flavithermus或Geobacillusthermodenitrificans；所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于Bacillus thermotolerans、Anoxybacillus flavithermus或Methanocaldococcus jannaschii。在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶来源于Anoxybacillus flavithermus WK1或Geobacillusthermodenitrificans NG80-2；所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于Quasibacillusthermotolerans、Anoxybacillus flavithermus AK1或Methanocaldococcus jannaschiiDSM 2661。

在某些实施方式中，在所述反应物中，所述富马酸与所述氨水的初始摩尔比为1：2。在某些实施方式中，在反应过程中加入的富马酸以流加的方式加入。在某些实施方式中，所述富马酸的浓度为50-400g/L，其流加速度使得反应期间的pH值控制在6.8～7.2之间。在某些实施方式中，反应温度控制在25～55℃之间。

在某些实施方式中，本发明所述的方法在催化反应结束之后进一步包括：除去所述催化组合物中的残留物。在某些实施方式中，本发明所述的方法进一步包括对所述β-丙氨酸产物进行析晶。在某些实施方式中，在所述析晶后得到母液，并且在所述母液中无机盐的含量低于10g/L。在某些实施方式中，所述析晶后得到的母液可以循环套用。在某些实施方式中，在所述析晶后得到β-丙氨酸晶体，并且在所述晶体中无机盐的含量低于20mg/g。

附图简述

图1：显示了Anoxybacillus flavithermus WK1的基因组序列中编码天冬氨酸酶的基因序列SEQ ID NO:1。

图2：显示了Geobacillus thermodenitrificans NG80-2的基因组序列中编码天冬氨酸酶的基因序列SEQ ID NO:2。

图3：显示了Bacillus thermotolerans中Quasibacillus thermotoleransstrain SGZ-8Contig4的基因组序列中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因序列SEQ ID NO:3。

图4：显示了Anoxybacillus flavithermus AK1的基因组序列中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因序列SEQ ID NO:4。

图5：显示了Methanocaldococcus jannaschii的基因组序列中编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶的基因序列SEQ ID NO:5。

具体实施方式

本发明克服了现有β-丙氨酸制备工艺的不足，提供一个绿色、高效、低成本、适合工业化生产的β-丙氨酸生产工艺。

本发明提供了一种β-丙氨酸的制备方法，包括：将含有富马酸和氨水的反应物在催化剂存在下制备得到β-丙氨酸产物，其中所述催化剂包含含有天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化组合物，并且在反应过程中加入富马酸，并且加入的富马酸的摩尔总量等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量。

富马酸或氨水的“初始摩尔量”是指富马酸或氨水在催化反应开始前的起始摩尔量。所述反应物中的“初始富马酸”重量指的是在催化反应开始之前加入到反应物中的富马酸的起始重量。在某些实施方式中，在所述反应物中，所述氨水与所述富马酸的初始摩尔比为2：1，或者在此数值上下波动10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％的范围内。

在某些实施方式中，所述含有富马酸和氨水的反应物可以包含富马酸铵。富马酸铵是指富马酸和氨水经酸碱中和得到的产物。不受理论限制，但认为在含有富马酸和氨水的反应物中，至少部分富马酸和部分氨水会自发形成富马酸铵。在本申请中，认为1摩尔的富马酸铵相当于2摩尔的氨水和1摩尔的富马酸。因此，当所述反应物中仅含有1摩尔富马酸铵时，认为其中的氨水和富马酸的初始摩尔量之比为2：1。

在本申请提供的方法中，所述催化剂包含含有天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化组合物。任何已知的天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶都可以使用。本领域公知，天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶已知在多种微生物中都有天然表达，而且都具有相应的催化活性。

在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于细菌。在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶来源于Anoxybacillus flavithermus或Geobacillusthermodenitrificans。在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶来源于Anoxybacillusflavithermus WK1株或Geobacillus thermodenitrificans NG80-2株。在某些实施方式中，所述天冬氨酸酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2编码的氨基酸序列相同，或与之具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性。

在某些实施方式中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于Bacillusthermotolerans、Anoxybacillus flavithermus或Methanocaldococcus jannaschii。在某些实施方式中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于Quasibacillus thermotolerans、Anoxybacillus flavithermus AK1或Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661。在某些实施方式中，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或SEQID NO:5编码的氨基酸序列相同，或与之具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％的同源性的氨基酸序列。

“同源性”在本申请中是指，针对氨基酸序列而言，将候选氨基酸序列与对比氨基酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的氨基酸数目达到最多，并在此基础上计算两条氨基酸序列之间相同氨基酸的百分比；针对核酸序列而言，将候选核酸序列与对比核酸序列进行序列对比，并在必要时引入间隔，使相同的核苷酸数目达到最多，并在此基础上计算两条核酸序列之间相同核苷酸的百分比。可以通过本领域所知的多种方式来对比以确定同源性的百分比。例如，可以用公开可用的以下工具进行序列对比，所述工具如BLASTp(美国国家生物技术信息中心网站(NCBI)：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi，也可参见，Altschul S.F.et al.,J.Mol.Biol.，215:403–410(1990)；StephenF.et al,，Nucleic Acids Res.，25:3389–3402(1997))、ClustalW2(欧洲生物信息研究所网站：http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/，可参见，Higgins D.G.et al.，Methods in Enzymology，266:383-402(1996)；Larkin M.A.et al.，Bioinformatics(Oxford、England)，23(21):2947-8(2007))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，也可以根据对比的需要适当调整参数，这些都在本领域技术人员的知识范围之内。

在本申请中，催化组合物中的天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶可以以任何适当的活性形式存在，例如但不限于，分离或纯化的活性酶蛋白，天然或重组表达所述酶的细胞或者其裂解物。

在某些实施方式中，所述催化组合物含有纯化的天冬氨酸酶和纯化的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。所述纯化的酶可以是从天然表达酶的微生物中分离纯化得到，或者可以是通过重组表达然后分离纯化得到。本领域技术人员可以采用本领域的常规技术手段制备纯化的天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶。例如，硫酸铵沉淀后，离子交换层析，然后凝胶层析。

在某些实施方式中，所述催化组合物含有表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述菌体包括湿菌体、固定化菌体或菌体破碎液。在某些实施方式中，所述的湿菌体为细菌培养发酵液固液分离后所得的菌体，如离心收集的菌体；所述的固定化菌体为湿菌体经常规固定化手段所得的固定化菌体，如海藻酸钠包埋的菌体；所述的菌体破碎液为菌体经常规破碎所得溶液，如高压匀浆破碎液。菌体破碎液中含有所需的酶。

在某些实施方式中，所述表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体来源于野生型细菌。例如，可以使用天然表达天冬氨酸酶的野生型细菌，天然表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的野生型细菌，或天然表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶这两者的野生型细菌。所述野生型细菌包括，例如，Anoxybacillus flavithermus、Geobacillusthermodenitrificans、Bacillus thermotolerans、Methanocaldococcus jannaschii等。

在某些实施方式中，所述表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体来源于重组工程菌。重组工程菌是指在宿主工程菌中通过重组DNA的方法导入了外源基因的工程菌。重组工程菌可以重组表达导入的外源基因。本领域技术人员可以根据其实际需要选择合适的宿主来表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶。在某些实施方式中，所述宿主选自下组：大肠杆菌、Escherichia fergusonii、Anoxybacillus flavithermus WK1、Geobacillus thermodenitrificans NG80-2、Bacillus thermotolerans、Anoxybacillusflavithermus AK1、Methanocaldococcus jannaschii、Bacillus cereus、Corynebacterium glutamicum。

本领域技术人员根据其实际需要可以使用本领域公知的技术手段制备重组工程菌，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)。实验中所采用的载体、质粒、宿主均为常规的细菌(例如大肠杆菌)表达采用的载体、质粒、宿主系列，如PET系列载体、质粒，BL21系列宿主菌；所采用的培养基为常规细菌(例如大肠杆菌)工程菌的培养基，如LB培养基；所采用的培养方法为常规细菌(例如大肠杆菌)工程菌培养方法。

在某些实施方式中，所述表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体包括单独表达天冬氨酸酶的菌体，和单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述菌体来源于野生型细菌或重组工程菌。

在某些实施方式中，所述单独表达天冬氨酸酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为0.5％～4％(w/w)，例如0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或以上任意两个数值范围之间的任意数值，优选地为1％～2％(w/w)；并且所述单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～30％(w/w)，例如，11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％或以上任意两个数值范围之间的任意数值，优选地为15％～20％(w/w)。

在某些实施方式中，在计算所述菌体与初始富马酸的重量百分比时，所述菌体的重量按湿重计。在某些实施方式中，在计算所述菌体与初始富马酸的重量百分比时，所述菌体的重量按干重计。本领域技术人员可以根据其实际需要进行选择。本领域技术人员也可以根据现有技术中的常规手段在干重和湿重之间进行换算，参考例如https:// bionumbers.hms.harvard.edu/bionumber.aspx？id＝109836。

在某些实施方式中，本发明使用的重组工程菌产生的天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性比野生型细菌产生的天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性高至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％及其以上。本领域技术人员可以使用常规技术手段来测定天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的活性，例如，分别以富马酸和天冬氨酸为底物，测定单位时间内底物的转化率。

不受理论限制，但认为在本发明中使用的来源于重组工程菌的酶或表达酶的菌体与野生型菌体相比具有意想不到的优势。例如，与野生型菌体相比，本发明中使用的重组工程菌能够大大提高富马酸反应浓度，例如从100g/L提高至200g/L，并且同时还保持β-丙氨酸产物的高产率和高纯度。

在某些实施方式中，所述表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体包括共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。在某些实施方式中，所述菌体来源于重组工程菌。

在某些实施方式中，所述共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～40％(w/w)，例如10％、15％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％或以上任意两个数值范围之间的任意数值，优选地为20％～30％(w/w)。

在本申请提供的方法中，随着催化反应的进行，溶液的pH逐渐升高，本申请发明人在反应过程中加入富马酸以便控制反应的pH值。不受理论限制，但认为富马酸与现有技术中惯用的无机酸调节剂相比，在至少以下两方面具有明显的优势：一方面，富马酸可以有效地降低反应溶液的pH值至合适的范围，另一方面，加入的富马酸又可以作为反应底物，通过催化反应被消耗进而生成β-丙氨酸，这样能够避免引入额外的杂质；相反，如果使用无机酸调节剂调节pH，则会与反应体系中的氨水形成无机酸的铵盐，导致杂质的产生，进而需要有额外的杂质去除步骤。

在本申请提供的方法中，富马酸和氨水在天冬氨酸酶的催化作用下，首先生成中间产物天冬氨酸，然后天冬氨酸无需进一步纯化或提取，直接在L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化作用下，进一步生成终产物β-丙氨酸，可以实现一步法直接生成β-丙氨酸，无需提取中间产物天冬氨酸。

本发明的另一个技术优势在于，能够显著降低在产物中残留的氨水、富马酸以及富马酸铵。在本申请提供的方法中，加入的富马酸的摩尔总量等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量，从而确保反应物中的氨水反应完全，同时避免产物中有过量的富马酸。并且氨水和富马酸经催化反应后被转化成β-丙氨酸，因此未催化的富马酸铵的含量也会显著降低。

在本申请的某些实施例中，富马酸与氨水的初始摩尔量之比设计为1:2，例如，假设富马酸的初始摩尔量为1mol，氨水的初始摩尔量则为2mol。在反应过程中，为了避免pH升高，申请人的发明人巧妙地通过在反应过程中加入富马酸的方式来控制pH值，并精准地控制在反应过程中加入的富马酸的量，使得加入的富马酸的摩尔量(1mol)等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量(2mol)减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量(1mol)，从而确保反应物中的氨水反应完全，同时避免产物中有过量的富马酸。由富马酸和氨水制备β-丙氨酸的反应过程可总结如下所示：

在某些实施方式中，在反应过程中加入的富马酸以流加的方式加入。在某些实施方式中，富马酸的流加速度使得反应期间的pH值控制在6.8～7.2之间。在某些实施方式中，所述富马酸的浓度为50-400g/L，其流加速度使得反应期间的pH值控制在6.8～7.2之间，例如pH值为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2或以上任意两个数值范围之间的任意数值。在某些实施方式中，可以在流加的过程中检测反应体系的pH值，由此调整反应过程中富马酸的流加速度。例如，在某些实施方式中，当浓度为100g/L时，流加速度取决于将反应期间的pH值控制在6.8-7.1。在某些实施方式中，当浓度为200g/L时，流加速度取决于将反应期间的pH值控制在6.9-7.2。

在某些实施方式中，本发明所述方法的反应温度控制在25～55℃之间，例如25℃、30℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃或以上任意两个数值范围之间的任意数值，优选地反应温度控制在35～42℃。

在某些实施方式中，在催化反应结束后，本发明所述的制备方法进一步包括：除去所述催化组合物中的残留物。

在本申请中，“催化反应”是指富马酸和氨水在催化剂存在下反应生成β-丙氨酸产物的反应过程。本领域技术人员可以采用多种手段来判断催化反应是否结束。在某些实施方式中，在富马酸流加结束后监控反应(例如采用HPLC)，当富马酸含量＜0.5％(w/v)，例如为0.4％、0.3％、0.2％、0.1％甚至更低，天冬氨酸摩尔转化率＞99％，例如为99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、甚至100％时，表明反应结束。本领域技术人员可以采用本领域的常规手段来计算天冬氨酸的摩尔转化率，例如，使用HPLC法测定反应混合物中每种成分的量，从而确定天冬氨酸的摩尔转化率。

在某些实施方式中，所述残留物包括大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，也包括小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质。本领域技术人员可以根据其实际需要使用常规的分离手段去除所述混合物中所述催化剂的残留物，例如，过滤、离心、微滤、超滤等多种手段中的一种或者多种。

在某些实施方式中，所述过滤通过使用滤纸或滤布来实现。本发明中所述的滤纸或滤布可以是市售的滤纸或滤布，例如GE Healthcare Life Sciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的滤纸或滤布。在某些实施方式中，滤纸或滤布的孔径为10～150μm，例如10μm、20μm、30μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、110μm、120μm、130μm、140μm、150μm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。本领域技术人员可以根据杂质的尺寸，选择合适的滤纸或滤布孔径来去除杂质。

在某些实施方式中，所述微滤通过使得所述反应液经过微滤膜来实现。本发明中所述的微滤膜可以是市售的微滤膜，例如GE Healthcare Life Sciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的微滤中空纤维膜系列。在某些实施方式中，所述微滤膜的孔径为0.1μm～0.6μm，例如0.1μm、0.15μm、0.2μm、0.22μm、0.25μm、0.3μm、0.35μm、0.4μm、0.45μm、0.5μm、0.55μm、0.6μm或者以上任意两个数值范围之间的任意数值。本领域技术人员可以根据杂质的尺寸，选择合适的微滤膜孔径来去除杂质。

在某些实施方式中，所述超滤通过使得所述反应液经过超滤膜来实现。本发明中所述的超滤膜可以是市售的超滤膜，例如GE Healthcare Life Sciences公司、仕比纯公司、旭化成公司等公司生产的超滤中空纤维膜系列。在某些实施方式中，所述超滤膜是孔径为5kD～500kD的中空纤维超滤膜，例如孔径为5kD、6kD、7kD、8kD、9kD、10kD、20kD、30kD、40kD、50kD、60kD、70kD、80kD、90kD、100kD、150kD、200kD、250kD、300kD、350kD、400kD、450kD、500kD或者以上任意两个数值范围之间任意数值的中空纤维超滤膜。本领域技术人员可以根据杂质的尺寸，选择合适的超滤膜孔径来去除杂质。

在某些实施方式中，本发明所述的制备方法进一步包括对所述β-丙氨酸产物进行浓缩。在某些实施方式中，所述浓缩是通过减压实现的，例如，将过滤、微滤或超滤后的反应液泵入浓缩设备进行减压浓缩至原体积的1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10或者以上任意两个数值范围之间任意数值。

在某些实施方式中，本发明所述的制备方法进一步包括对所述β-丙氨酸产物进行析晶。在某些实施方式中，所述析晶是通过降低温度、加入有机溶剂(例如甲醇、乙醇等)实现的，例如，向浓缩的反应液中滴加1倍、2倍、3倍、4倍等体积的有机溶剂，在低温条件下(例如10℃、5℃或更低的温度)析晶。

在本申请提供的方法中，在所述析晶后得到母液。在本申请中，“母液”是指催化反应结束后，β-丙氨酸析晶之后剩余的液体。在所述母液中无机盐的含量低于10g/L，例如低于9g/L、8g/L、7g/L、6g/L、5g/L、4g/L、3g/L、2g/L、1g/L、0.5g/L等。在某些实施方式中，所述析晶过程中得到的母液中不含有无机盐。本领域技术人员可以使用常规技术手段测定母液中无机盐的含量，例如，使用氨氮检测仪(上海仪电科学仪器有限公司)检测母液中的残留铵离子。不受理论限制，本发明的另一个技术优势在于，反应结束后剩余的母液基本上不含有无机盐等杂质，可以循环使用，避免排放工业废水，因此更加环保。在某些实施方式中，在所述析晶后得到β-丙氨酸晶体，并且在所述晶体中无机盐的含量低于20mg/g，例如低于19mg/g、18mg/g、17mg/g、16mg/g、15mg/g、14mg/g、13mg/g、12mg/g、11mg/g、10mg/g、9mg/g、8mg/g、7mg/g、6mg/g、5mg/g、4mg/g、3mg/g、2mg/g、1mg/g等。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1.以价格低廉的富马酸为初始底物，一步法直接生成β-丙氨酸，无需中间提取天冬氨酸，简化了生产工艺，降低了生产成本，绿色环保；

2.在工程菌中高效表达热稳定性酶，酶活性高，酶稳定性好，反应底物浓度高，转化效率高，富马酸与天冬氨酸摩尔转化率均大于99％；

3.以流加富马酸控制pH值，整个反应过程中不引入其他无机酸(例如磷酸、硫酸、盐酸、硝酸等)，精准地控制反应过程中反应物中富马酸的摩尔量、氨水的摩尔量、以及流加的富马酸的摩尔量，从而使得反应过程无副产物和无机盐生成，产品提取工艺简单，产品纯度高。

4.β-丙氨酸析晶之后得到的母液中几乎不含无机盐和其他杂质，理论上该母液可以循环使用，从而降低了生产成本。

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例一

大肠杆菌工程菌的发酵培养，无机盐发酵培养基配方：NaCl 1g/L；MgSO₄-7H₂O 1g/L；FeSO₄-7H₂O 0.02g/L；ZnSO₄-7H₂O 0.03g/L；CuSO₄-5H₂O 0.005g/L；(NH₄)₂SO₄ 4g/L；KH₂PO₄4g/L，121℃灭菌15分钟，灭菌后冷却至37℃、接种，接种量2％，在37℃的条件下进行发酵，溶氧保持在30％-50％，通气量为1VVM，流加氨水调节pH和提供氮源，氨水控制pH在7.5，流加葡萄糖提供碳源，残糖控制在0.1-0.5g/L，培养至OD₆₀₀＝30时，降温至30℃加入IPTG诱导，诱导培养30小时后结束发酵，OD₆₀₀达到110左右，离心后菌体湿重达到120g/L左右。

实施例二

参考《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)及Li Y.et.al.Appl.Microbiol.Biotechnol.2017,101,6015-6021制备得到含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的天冬氨酸酶(下称“酶1”)的大肠杆菌工程菌和含来源于Bacillus thermotolerans的L-天冬氨酸-α-脱羧酶(下称“酶2”)的大肠杆菌工程菌菌株，常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵后离心(转速5000rpm，离心时间5min)，得到湿大肠杆菌工程菌，备用。

配制3L富马酸铵溶液(100g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为2.586mol，氨水的初始摩尔量为5.172mol，加入3g含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌工程菌的湿菌体(其与初始富马酸的重量比为1％)，和60g含来源于Bacillusthermotolerans的酶2的大肠杆菌工程菌的湿菌体(其与初始富马酸的重量比为20％)，开始反应，流加2.586mol的富马酸(100g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是5.172mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应18h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。

将反应液通过0.4μm微滤膜除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过10KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/5，滴加3倍体积的甲醇在10℃下低温析晶，抽滤烘干，得白色固体390.5g，β-丙氨酸含量为98.7％，收率为83.7％。回收母液中的甲醇之后，循环套用。

实施例三

参考实施例二的相同文献制备得到含来源Geobacillus thermodenitrificansNG80-2的酶1的大肠杆菌工程菌和含来源于Anoxybacillus flavithermus AK1的酶2的大肠杆菌工程菌菌株，常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵后离心(转速5000rpm，离心时间5min)，得到湿大肠杆菌工程菌，按1g细胞加入10ml pH7.0磷酸盐缓冲液，搅拌均匀后，将菌体经高压匀浆破碎，得到大肠杆菌工程菌细胞破碎液，备用。

配制3L富马酸铵溶液(150g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为3.879mol，氨水的初始摩尔量为7.758mol，加入9g含来源于Geobacillus thermodenitrificans NG80-2的酶1的大肠杆菌工程菌细胞破碎液(其与初始富马酸的重量比为2％)和135g含来源于Anoxybacillus flavithermus AK1的酶2的大肠杆菌工程菌细胞破碎液(其与初始富马酸的重量比为30％)开始反应，流加3.879mol的富马酸(150g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是7.758mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应24h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。

将反应液通过0.4μm微滤膜除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过6KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/4，滴加3倍体积的甲醇在5℃下低温析晶，抽滤烘干，得白色固体622.5g，β-丙氨酸含量为99.1％，收率为89.3％。回收母液中的甲醇之后，循环套用。

实施例四

参考实施例二的相同文献制备得到含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌工程菌和含来源于Methanocaldococcus jannaschii的酶2的大肠杆菌工程菌菌株，常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵后离心(5000rpm,离心时间5min)，得到湿大肠杆菌工程菌，备用。

配制3L富马酸铵溶液(75g富马酸/L)，富马酸初始浓度为1.939mol，氨水的初始摩尔量为3.878mol，加入20mM的磷酸吡哆醛(PLP)，加入2.25g含来源于Anoxybacillusflavithermus WK1的酶1的大肠杆菌工程菌的湿菌体(其与初始富马酸的重量比为1％)和33.75g含来源于Methanocaldococcus jannaschii的酶2的大肠杆菌工程菌的湿菌体(其与初始富马酸的重量比为15％)开始反应，流加1.939mol的富马酸(75g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是3.878mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应24h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。

将反应液通过0.4μm微滤膜除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过10KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/7，缓慢降至4℃低温析晶，抽滤烘干，得白色固体227.6g，β-丙氨酸含量为99.4％，收率为65.5％。回收母液中的甲醇之后，循环套用。

实施例五

参考实施例二的相同文献制备得到共表达来源于Anoxybacillus flavithermusWK1的酶1和来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌工程菌菌株，常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵后离心(转速5000rpm，离心时间5min)，得到湿大肠杆菌工程菌，备用。

配制3L富马酸铵溶液(100g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为2.586mol，氨水的初始摩尔量为5.172mol，加入90g共表达来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1和来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌工程菌的湿菌体(其与初始富马酸的重量比为30％)开始反应，流加2.586mol的富马酸(100g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是5.172mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应27h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。

将反应液通过0.4μm微滤膜除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过10KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/6，缓慢降至5℃低温析晶，抽滤烘干，得白色固体338.5g，β-丙氨酸含量为99.3％，收率为73％。回收母液中的甲醇之后，循环套用。

实施例六

参考实施例二的相同文献，利用常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵制备得到共表达来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1和来源于Bacillusthermotolerans的酶2的大肠杆菌细胞之后，配制8％聚乙烯醇和2.5％海藻酸钠混合溶液，加入10％大肠杆菌细胞，混合均匀后，用蠕动泵从10cm高处滴入含有2％氯化钙和3％硼酸的交联剂中，固化8小时，过滤，用蒸馏水反复冲洗3-4次，固定化细胞备用。

配制3L富马酸铵溶液(75g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为1.939mol，氨水的初始摩尔量为3.878mol，加入67.5g共表达来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1和来源于Bacillus thermotolerans的酶2的固定化大肠杆菌细胞(其与初始富马酸的重量比为30％)开始反应，流加1.939mol的富马酸(75g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是3.878mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应20h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。

将反应液通过滤布除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过10KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/7，滴加3倍体积的甲醇在10℃下低温析晶，抽滤烘干，得白色固体296.7g，β-丙氨酸含量为98.9％，收率为85％。回收母液中的甲醇之后，循环套用。

实施例七

申请人分别使用本发明的制备方法(下称“无盐工艺”)与适当使用无机酸的制备方法(下称“有盐工艺”)来制备β-丙氨酸，并比较了两种工艺得到的β-丙氨酸的含量、氨氮以及每克β-丙氨酸中的含氨氮量。

无盐工艺：参考实施例二的相同文献，利用常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵制备得到含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌全细胞和含来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌全细胞，备用。

配制3L富马酸铵溶液(100g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为2.586mol，氨水的初始摩尔量为5.172mol，加入3g含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌全细胞(其与初始富马酸的重量比为1％)和60g含来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌全细胞(其与初始富马酸的重量比为20％)开始反应，流加2.586mol的富马酸(100g富马酸/L)(与反应物中的富马酸初始摩尔量加起来一共是5.172mol富马酸)控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，富马酸流加结束后HPLC监控反应，当反应18h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。使用氨氮检测仪(上海仪电科学仪器有限公司)检测反应液中的铵离子浓度为0.82g/L。

对照实验

有盐工艺：参考实施例二的相同文献，利用常规LB培养基或者用实施例一的方法发酵制备得到含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌全细胞和含来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌全细胞，备用。

配制3L富马酸铵溶液(200g富马酸/L)，富马酸初始摩尔量为5.172mol，氨水的初始摩尔量为10.344mol，加入6g含来源于Anoxybacillus flavithermus WK1的酶1的大肠杆菌全细胞(其与初始富马酸的重量比为1％)和120g含来源于Bacillus thermotolerans的酶2的大肠杆菌全细胞(其与初始富马酸的重量比为20％)开始反应，流加H₂SO₄控制反应pH值为7.0，反应温度为37℃，HPLC监控反应，当反应18h，富马酸含量＜0.5％(w/v)，天冬氨酸摩尔转化率＞99％时结束反应。使用氨氮检测仪(上海仪电科学仪器有限公司)检测反应液中的铵离子浓度为23.5g/L。

上述无盐工艺和有盐工艺均采用同样的后处理工艺，通过0.4μm微滤膜除去大颗粒杂质，例如细胞、细菌碎片、聚集体、凝絮体等杂质，通过10KD超滤膜除去小分子杂质，例如细菌培养基中的核酸及核酸碎片、蛋白、培养基成分等杂质，减压浓缩至原反应液体积的1/5，10℃下低温析晶，抽滤烘干。结果如下：

(1)在无盐工艺中，得到β-丙氨酸207g，含量为98.6％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为13mg/g。回收液中氨氮含量为2.3g/L。

(2)在有盐工艺中，得到β-丙氨酸290g，含量为55.6％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为910mg/g，回收液中氨氮含量为51.7g/L。

实施例八

申请人使用本发明的制备方法进行无盐工艺的循环套用。

按照实施例六中无盐工艺的方法制备3批反应液，分别编号为A、B、C。

(1)反应液A进入减压浓缩至原反应液体积的1/5，10℃下低温析晶，抽滤烘干，得到β-丙氨酸212g，含量为98.7％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为11mg/g。回收液510ml，回收液中氨氮含量为2.5g/L。

(2)将上述(1)中反应液A的回收液加入到反应液B，一起进入减压浓缩至原反应液体积的1/5，10℃下低温析晶，抽滤烘干，得到β-丙氨酸393g，含量为98.3％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为10mg/g。回收液620ml，回收液中氨氮含量为5.7g/L。

(3)将上述(2)中回收液加入到反应液C，一起进入减压浓缩至原反应液体积的1/5，10℃下低温析晶，抽滤烘干，得到β-丙氨酸410g，含量为98.1％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为11mg/g。回收液650ml，回收液中氨氮含量为5.8g/L。

(4)上述(3)的回收液直接减压浓缩成固体，得到β-丙氨酸275g，含量为90.1％，每克β-丙氨酸中氨氮含量为11mg/g。

由实施例七和实施例八的结果可以看出，本发明的无盐工艺制得的β-丙氨酸在含量、氨氮以及每克β-丙氨酸中的含氨氮等方面均显著优于有盐工艺制得的β-丙氨酸，而且无盐工艺中析晶之后得到的母液经多次循环后，仍然几乎不含无机盐和其他杂质，从而降低了生产成本。

序列表

<110> 广安摩珈生物科技有限公司

<120> β-丙氨酸的制备方法

<130> 065954-8002CN01

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1410

<212> DNA

<213> Anoxybacillus flavithermus WK1

<400> 1

ttatttccct gcaatgcccg gacttgtcat cgcatacggg tctaaaatat catgtaattg 60

cttttcattc aacaaatcgt actccaagca tagctcgcgc actgattttc ccgtatgaag 120

cgcttctttc gcgatgcgcg atgccgcttc ataaccgatg tacggattga cagctgtaat 180

gacgccgatg ctattttcga cgtgttgctt cattcgctct tcgttcgctt caatgccagc 240

taaacaatag tctgtaaaca cacgaaagac gttgtccatc atatgaagcg actgaagtaa 300

gttaaacaca agcaccggct ccatgacgtt tagctctagc tgtcctgctt ctgacgctaa 360

gcaaatcgtt tggtcattac cgatcacttg aaacgccact tggttgacga cttccgccat 420

aaccggattc actttccccg gcataatcga cgatcccggc tgacgagcag gcaacgtaat 480

ttctccaagc cctgcccgcg gaccagacgc catgagacga agatcgtttg cgattttcga 540

catgttgatc atacatattt ttaaggcagc tgatacttct gtatacgcat ctgtattttg 600

tgtcgcatca acgagatgtt ctgcgcgcac aagcggcaat tcggtcaagc gaacgagatg 660

aaaaatgacg cgttcaatat agaccggatc ggcatttaat cccgttccga ccgccgttgc 720

accaatattg acttcgtaca aatgttggcg cgaatgagca atgcgctcca tatcgcgctt 780

gacgacgcga cgatacgctt caaattcttg tccgagccga atcggaacgg catcttgtaa 840

atgcgtccgt cccatcttaa tgacatgatc aaactgtttc gctttatcgg cgaacacatc 900

gtgcatatgt ttcatcgtct gaagtaattg gttcaccatc tttaacactg caatatgaat 960

cgctgtcggg aaaacgtcgt ttgtcgattg cgacatgttg acgtgcgtat ttgggctaat 1020

gatatgataa tttccttttc gctctcctaa ccattcgagt gcgcgattcg cgatcacttc 1080

gttcgtgttc atattgatcg acgttcctgc gccaccttga atcgggtcga cgataaattg 1140

atcgtgccat tgtcctgcga tcacttcatc tgccgctttt acgatcgctt caccgatgcg 1200

acgatcaagt tgccccgttt ccatattcgc aagcgccgcc gcttttttca cgatcgccat 1260

cgcttgaatg agttcgcgat gaagacgata cccggtaatc gggaagtttt ctgcggcgcg 1320

catcgtttga atgccgtaat acgcatcgta tggaatttct ttttcgccaa gcaaatctcg 1380

ttcaagtcgt actgcttttg tttctagcat 1410

<210> 2

<211> 1437

<212> DNA

<213> Geobacillus thermodenitrificans NG80-2

<400> 2

ttagggcttg tcaaaagaaa taacactgag gatgcctgga ctcgtcattt tataaggatc 60

taaaatatga tccaattctt tttccgttaa caaaccgtat tgcaaacata gtttacggat 120

ggattcccct tctaagatcg cctgttgagc aatacgtgcg gccgtttcat atccgatata 180

tgggctaaca gctgtaacca cactgacact tttttctaca taatgtctca aacgttcctc 240

gttggcttca atacccttta aacaataatt tgtaaacaca tgaaacgcat tcgtcattat 300

cgtaatcgat tgaagcagat taaagacgag cacaggttcc attacattta gttccagttg 360

acctgcctca gaagcaagac aaatcgtatg gtcattgcct atcacttgga aagcgacttg 420

gttaatcacc tcggccataa caggattaac tttacctggc ataatagacg agccaggctg 480

acggggcggc aatgtaattt ctcccaaacc ggctctaggt cctgacgcca ttaaacgcaa 540

gtcattggct attttagaca tattgatcat acacactttt agagcggacg atacttctgt 600

atatgcatcc gtattttgtg ttgcatccac caaatgttca gctctaacta atggcaaccc 660

gctaatttct gataaatatt tgacaacacc ctcaatatat cggggatcag catttaaccc 720

cgtcccgact gcggtggctc ccatattgat ttcatataaa tattgacggg agcgatcgat 780

gcgttggata tcacgctcta acacgcagct atatgcttca aactcttgcc ctaaacgaat 840

gggtacagca tcttgaagat gggtgcggcc tattttaatg acatggtcaa attgccgggc 900

tttttccttc atcactgcat gcatatatcg catcgtatgg agcagtttgt ctagtaagtt 960

tagtaaggca atatgaaccg ctgttgggaa aacatcgttg gttgactgag acatattcac 1020

atgattattt ggacttaaat aaccatattc tcctttttca tatccaagca attcgagagc 1080

acgattggcg atgacttcat ttgcattcat atttatcgat gtacccgctc cgccttgtat 1140

aggatcaacg ataaagtgct catgccattt tcctgcaatg atttcatctg cagctttaac 1200

gatggcctcg cctatttcag cttttaatcg ttttgtgtcc atattggcta aggcagctgc 1260

tttcttcacc atcgccaaag ctttaatcaa ttccttgtga attcgatatc cggtgatagg 1320

aaagttctct agggctctta atgtttgtat cccataataa gcatctatcg gaacttcttt 1380

atcccctagg aaatcccttt caatccgaac cttactattg gtattagcgg ttgccat 1437

<210> 3

<211> 384

<212> DNA

<213> Bacillus thermotolerans

<400> 3

atgtttcgta ctatgatgaa cgggaaaatt caccgtgcga ctgtcacgga agctaactta 60

aactatgtag gcagtatcac gattgaccaa gatctgctgg atgcggcagg catggttgaa 120

aatgaaaaag tgcaaattgt caacaataac aatggcgccc gtctggaaac atacattatc 180

tcaggtgagc ggggcagcgg tgtagtttgc ttaaacggag cagcagcccg tctcgttcag 240

cctggagata aggttattat catttcgtat gtcatggtgg ctgaagagca agtgaaggat 300

catcagccaa agattgtcgt agcagatgaa ttaaaccgga ttgatcagct gcttcatcag 360

gaaatagcgg gcacagtttt ataa 384

<210> 4

<211> 384

<212> DNA

<213> Anoxybacillus flavithermus AK1

<400> 4

atgtttcgta cattaatgaa tgctaaaatt catcgtgctc gcgtgacgga agcgaattta 60

aactatgtcg gcagcattac gatcgatgaa gatattttag atgcggtcgg catggtgcca 120

aatgaaaaag tacaaattgt aaacaataac aatggggcac gatttgaaac atatattatt 180

ccaggtgaaa gaggaagcgg cgtattttgt ttgaacgggg cagccgctcg cctcgttcaa 240

aaagacgata ttattatcgt tatttcgtac gtgctcgtac cagaagaaaa attagcttcg 300

caccgtccaa aaattgcaat tatggacgag cataatcgga ttaaagaatt gatcgtgcaa 360

gagccggcgg cgaccgtttt ataa 384

<210> 5

<211> 1182

<212> DNA

<213> Methanocaldococcus jannaschii

<400> 5

atgcaggaaa aaggtgttag tgagaaagaa attttagagg aattgaaaaa atataggagt 60

ttggatttaa agtatgaaga tggaaatatt ttcggttcaa tgtgttccaa tgtattacca 120

ataacaagaa aaattgtaga tatcttctta gaaacaaact tgggagaccc tggactattt 180

aaagggacta aattgttaga agaaaaagct gtggctttat tgggttcttt gttaaataac 240

aaagatgcct atggacatat agttagtgga gggactgaag ccaacttaat ggctttaaga 300

tgcataaaaa atatatggag ggaaaaaagg agaaagggct tatcaaaaaa tgaacatcca 360

aagattatcg ttccaataac tgcccatttc tcattcgaaa aaggaagaga aatgatggac 420

ttagagtata tctatgcccc aattaaagaa gattatacaa tagatgagaa attcgttaaa 480

gatgccgtag aggattatga tgtagatggc attataggaa ttgctggaac aacagagctt 540

ggaactattg acaacataga ggagctaagt aaaatagcaa aagaaaacaa catttatatc 600

catgtagatg cggcatttgg aggcttagta attccatttt tagatgataa atataagaaa 660

aaaggagtaa attataaatt tgacttttct ttgggagttg attctataac catagacccc 720

cataaaatgg ggcactgccc aatcccaagt ggagggattc tatttaaaga tataggttat 780

aaaagatatt tggatgttga tgccccttat ttaactgaaa caagacaggc aacaatctta 840

ggaacaaggg ttggattcgg aggagcctgc acttatgcag ttttaagata tttaggtaga 900

gagggacagc gaaaaattgt taatgaatgt atggaaaaca ccctttatct ttacaaaaaa 960

ttgaaggaaa ataattttaa accagtcatt gaaccaatat taaatattgt tgcaattgaa 1020

gatgaagatt ataaagaagt ctgcaaaaaa cttagagata gaggcattta cgtttcagtt 1080

tgcaattgtg ttaaagcttt gagaatcgtt gttatgccac atattaagag ggagcatata 1140

gataatttta tcgaaatatt gaatagtatt aaaagggatt ga 1182

Claims

1.一种β-丙氨酸的制备方法，包括：

将含有富马酸和氨水的反应物在催化剂存在下制备得到β-丙氨酸产物，

其中所述催化剂包含含有天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的催化组合物，并且

在反应过程中加入富马酸，而且加入的富马酸的摩尔总量等于所述反应物中的氨水的初始摩尔量减去所述反应物中的富马酸的初始摩尔量。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述催化组合物含有纯化的天冬氨酸酶和纯化的L-天冬氨酸-α-脱羧酶。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述催化组合物含有表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述菌体包括湿菌体、固定化菌体或菌体破碎液。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其中所述菌体来源于重组工程菌。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其中所述菌体包含单独表达天冬氨酸酶的菌体和单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中所述单独表达天冬氨酸酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为0.5％～4％(w/w)；并且，所述单独表达L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～30％(w/w)。

8.根据权利要求3-5中任一项所述的制备方法，其中所述菌体包含共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其中所述共同表达天冬氨酸酶和L-天冬氨酸-α-脱羧酶的菌体与所述反应物中的初始富马酸的重量百分比为10％～40％(w/w)。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的制备方法，其中所述天冬氨酸酶来源于Anoxybacillus flavithermus或Geobacillus thermodenitrificans；并且，所述L-天冬氨酸-α-脱羧酶来源于Bacillus thermotolerans、Anoxybacillus flavithermus或Methanocaldococcus jannaschii。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的制备方法，其中在所述反应物中，所述富马酸与所述氨水的初始摩尔比为1：2。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的制备方法，其中在反应过程中加入的富马酸以流加的方式加入。

13.根据权利要求12所述的制备方法，其中所述富马酸的浓度为50-400g/L，其流加速度使得反应期间的pH值控制在6.8～7.2之间。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的制备方法，其中反应温度控制在25～55℃之间。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的制备方法，其中在催化反应结束之后进一步包括：除去所述催化组合物中的残留物。

16.根据权利要求15所述的制备方法，其进一步包括对所述β-丙氨酸产物进行析晶。

17.根据权利要求16所述的制备方法，其中在所述析晶后得到母液，并且在所述母液中无机盐的含量低于10g/L。

18.根据权利要求16所述的制备方法，其中在所述析晶后得到β-丙氨酸晶体，并且在所述晶体中无机盐的含量低于20mg/g。