CN111718882A - 一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法 - Google Patents

一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明以L‑谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌G01和L‑精氨酸生产菌株钝齿棒杆菌SDNN403为出发菌株，在其中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，分别得到了生产L‑谷氨酸的重组菌GC‑K，和生产L‑精氨酸的重组菌CC‑K。使得L‑谷氨酸的产量较出发菌株提高了31.5％，使得L‑精氨酸的产量较原始菌株提高了36.1％。

Description

一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法
技术领域
本发明公开了一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术
L-谷氨酸和L-精氨酸被广泛应用于食品、医药及化工等行业，其衍生出来的高值化产品γ-氨基丁酸、聚谷氨酸和L-茶氨酸等市场需求量巨大。近年来，随着氨基酸高值化产品需求量不断增大，L-谷氨酸和L-精氨酸高产菌株的选育越来越受到重视。
谷氨酸棒杆菌是非致病细菌，是工业上生产各种氨基酸的微生物细胞工厂，如赖氨酸、精氨酸、谷氨酸等。同时其生长迅速且可广泛使用不同的有机化合物作为碳源。实验室在前期工作中，通过逐级诱变获得了一株L-谷氨酸生产菌株谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)G01(中国典型培养物保藏中心，保藏号：CCTCC NO:M2013418)和一株高产L-精氨酸的钝齿棒杆菌突变菌株SDNN403(菌株保藏编号为CGMCCNO.0890，在公开号为CN1441055A的专利中已公开)。
菌株发酵需要一定的能量供应，而ATP作为主要的供能物质对L-精氨酸合成具有重要作用。糖酵解中丙酮酸激酶对ATP的合成至关重要，又因丙酮酸激酶的活力受到K+的激活。因此适宜K+浓度有利于丙酮酸激酶发挥功能并生成ATP，保证充足的能量供应。
近年来，氨基酸高值化产品聚谷氨酸、GABA和L-茶氨酸等市场需求量巨大，而L-谷氨酸和L-精氨酸作为其前体物质，生产菌株中L-谷氨酸和L-精氨酸产量低将会限制高值化产品的高产出，因此，亟待寻找一种提高L-谷氨酸和L-精氨酸产量的方法，以期为高值化产品的生产奠定基础。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP的重组谷氨酸棒杆菌发酵生产L-谷氨酸和L-精氨酸，得到的L-谷氨酸和L-精氨酸产量和产率均提高，对于规模化制备氨基酸具有重要的应用价值。
本发明提供了一种重组谷氨酸棒杆菌，是过表达了功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP；所述CglK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
本发明提供了一种重组菌，所述重组菌过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。
在本发明的一种实施方式中，所述CglK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以pDXW-10为表达载体。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌以谷氨酸棒杆菌G01，或钝齿棒杆菌SDNN403为宿主。
本发明提供了一种提高棒杆菌氨基酸产量的方法，所述方法为过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。
在本发明的一种实施方式中，在谷氨酸棒杆菌G01中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-谷氨酸。
在本发明的一种实施方式中，在钝齿棒杆菌SDNN403中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-精氨酸。
在本发明的一种实施方式中，编码所述功能性摄钾蛋白CglK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述阳离子转运ATP酶CTAP的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在本发明的一种实施方式中，将OD600为20～30的重组菌以5～15％的添加量接入发酵体系，发酵温度为25～35℃，pH值为6.5～7.5。
在本发明的一种实施方式中，搅拌速度为500～700r/min，空气流量为1～1.5vvm。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵液中含有葡萄糖50～70g/L，酵母浸粉5～10g/L，K3PO4 3～4g/L，MgSO4·7H2O 0.1～1g/L，(NH4)2SO4 10～25g/L，FeSO4·7H2O 0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L。
本发明还保护所述重组菌，或所述方法在生产L-谷氨酸或L-精氨酸的产品中的应用。
本发明的有益效果：本发明成功在谷氨酸棒杆菌中实现了过表达cglK和ctapK，离子转运蛋白CglK和CTAPK可从培养基中运输足够的K+到胞内。在补料分批发酵中，GC-K菌株L-谷氨酸产量达到120.43g/L，较原始菌提高了31.5％，糖酸转化率为55.7％；CC-K发酵至96h，L-精氨酸产量达到60.72g/L，较原始菌提高了36.1％。
附图说明
图1为重组菌株GC-K补料分批发酵过程图。
图2为重组菌株CC-K补料分批发酵过程图。
图3为重组菌在不同钾离子浓度下菌株生长情况。
具体实施方式
LBG培养基组分：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，葡萄糖5g/L。
实施例1：过表达功能性摄钾蛋白CglK重组菌的构建
分别以谷氨酸棒杆菌G01和钝齿棒杆菌SDNN403基因组为模板，利用引物对10-cglKctapK-1/2(核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示)和10-cglKctapK-3/4(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)分别扩增出上游cglK和下游ctapK基因片段。回收后，以上下游片段为模板，利用引物对10-cglKctapK-1/4融合PCR扩增出串联基因cglKctapK片段。将pDXW-10质粒经BamHI酶和HindIII酶酶切产物纯化回收，将回收产物和cglKctapK片段利用同源重组酶进行连接，得到连接产物。连接产物经热激转化E.coliBL21感受态，涂布于含有15μg/L的卡那霉素抗性LBG平板，在30℃培养至长出单克隆，挑取单克隆并在含有15μg/L的卡那霉素抗性LBG液体培养基中，培养20h；对菌液进行质粒提取、并进行酶切验证，再将酶切验证通过的送测序验证。验证正确的单克隆即为阳性转化子，表明质粒pDXW-10-cg1KctapK构建成功。
将过表达质粒pDXW-10-cg1KctapK分别电击转化至谷氨酸棒杆菌G01和钝齿棒杆菌SDNN403菌株感受态细胞(感受态细胞的制备方法参照徐美娟《钝齿棒杆菌SYPA5-5发酵产L-精氨酸的代谢工程改造》)，培养2h后离心收集细胞涂布于含卡那霉素(15μg/L)抗性的LBG平板。30℃培养36-48h，随机挑取LBG平板上的转化子，利用10-cglKctapK-3/4(核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示)的引物进行PCR鉴定，鉴定正确的菌株即为GC-K(宿主为谷氨酸棒杆菌G01)和CC-K菌株(宿主为钝齿棒杆菌SDNN403)。
实施例2：不同钾离子浓度下菌株生长的测定
分别挑一环平板活化的菌株GC-K和菌株CC-K接入液体LBG培养基中，30℃，180r/min回旋式摇床培养至OD600≈10.0作为种子液。取1mL种子液转接入250mL摇瓶中的25mL L0基本培养基饥饿培养2-3h，无菌PBS洗涤细胞，充分悬浮后，6000r/min离心10min，在超净台内弃上清，重复洗涤、离心3次，留沉淀，最后用PBS(购自赛默飞)悬浮至OD600≈1.0，再用无菌水梯度稀释10-1、10-2、10-3、10-4倍，分别吸取不同梯度的菌液1μL在不同钾离子浓度(浓度分别为10mmol/L和50mmol/L)和pH 7.0进行点板实验，30℃进行培养，密切观察离子转运蛋白突变株的生长表型，如图3所示。
实施例3：胞内丙酮酸激酶活性的测定
取摇瓶发酵24h的样品，离心后弃上清，每500万细胞加入1mL提取液，超声波破碎细胞，取上清，置冰上待测。按照索莱宝-丙酮酸激酶活性检测试剂盒说明书加入试剂，在340nm处，记录各管吸光值变化。根据说明书公式计算丙酮酸激酶的活力。过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运蛋白CTAPK的突变株，丙酮酸激酶的活力较出发菌株有显著提高。
菌株GC-K和CC-K的丙酮酸激酶活力分别为0.85U/mL和0.89U/mL，出发菌株谷氨酸棒杆菌G01和钝齿棒杆菌SDNN403丙酮酸激酶酶活力分别为0.66U/mL和0.68U/mL。
实施例4：重组菌GC-K和CC-K的发酵
(1)种子培养
分别在LBG平板活化谷氨酸棒杆菌GC-K和CC-K，活化后分别接入含15mL液体的LBG培养基中，30℃、180r/min回旋式摇床培养至OD600≈10.0。分别全部转接于150mL种子培养基中，将15mL种子液全部转接入1000mL带挡板含150mL发酵罐发酵种子培养基的摇瓶中，30℃、180r/min回旋式摇床培养至OD600≈25.0作为二级种子液。
种子培养基组分：葡萄糖50g/L(与其他组分分开灭菌)，酵母浸粉20g/L，K3PO43.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 20g/L；初始pH调到7.2，加入CaCO3 1g/L，115℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)发酵培养
初始发酵培养体积为1.5L，采用的发酵培养基成分如下：
发酵培养基成分：葡萄糖70g/L，酵母浸粉8g/L，K3PO43.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，(NH4)2SO4 20g/L，FeSO4·7H2O 0.02g/L，MnSO4·H2O 0.02g/L，去离子水配置；将上述发酵培养基用50％的氨水调节其pH至7.0，在115℃下高温灭菌20min。
补料培养基组分：葡萄糖500g/L，酵母浸粉8g/L，(NH4)2SO4 20g/L。
发酵条件：二级种子液全部接入装有1.5L发酵罐发酵初始培养基的5L发酵罐中，30℃，通过自动添加50％氨水，pH值维持在7.0。搅拌速度控制在600r/min，空气流量保持在1vvm。当葡萄糖残留浓度小于10g/L时，添加葡萄糖，控制葡萄糖浓度在40g/L。
每6h取样一次，采用分光光度仪在562nm下测定细胞OD值，用生物传感分析仪测定(SBA-50，山东省科学院生物研究所)葡萄糖的含量，并采用HPLC测定L-谷氨酸含量(赛默飞，美国)。结果表明，相比于出发菌株，重组菌生长情况更好，糖耗更快，发酵至48h，重组菌GC-K的L-谷氨酸产量达到120.43g/L，较原始菌提高了31.5％，糖酸转化率为55.7％；重组菌CC-K发酵至96h，L-精氨酸产量达到60.72g/L，较原始菌提高了36.1％，实现L-谷氨酸和L-精氨酸的高产。
表1重组菌GC-K发酵结果
时间(h) 0 6 12 18 18 24 24 36 36 42 48
葡萄糖(g/L) 130 110 70 40 90 55 95 48 93 55 39.4
L-谷氨酸(g/L) 0 11.1 31.02 46.02 46.5 66.06 66.06 87.09 87.09 111.3 120.4
细胞干重(g/L) 0.00 6.67 12.00 22.67 22.67 29.87 30.00 39.81 39.81 37.477 33.49
表2谷氨酸棒杆菌G01发酵结果
时间(h) 0 6 18 22 26 30 42 46
葡萄糖(g/L) 140 135 126 108 78 86.4 50.4 57.6
L-谷氨酸(g/L) 0.03 11.5 24.4 38 46.5 68 82.3 91.5
细胞干重(g/L) 1.945 7.37 22.92 26.625 32.9 31.725 31.875 31.025
表3重组菌CC-K发酵结果
时间(h) 0 12 24 24 37 37 48 48 60 60 72 72 84 96
葡萄糖(g/L) 70 48 19 35 12 41 20 40 25.5 45 13.6 30 20.6 7.76
L-精氨酸(g/L) 0 5.5 11.36 11.36 29.52 30 37.36 37.36 44.92 45 52.86 53 58.37 60.7
细胞干重(g/L) 0 4.28 9.5 9.5 13.76 14 16.76 16.76 18.86 18.86 22.31 22.31 23.57 25.4
表4钝齿棒杆菌SDNN403发酵结果
时间(h) 0 12 24 24 36 36 48 48 60 60 72 84 96
葡萄糖(g/L) 70 55 16 30 18 31 9.8 30 10 32 25.2 19.4 8.4
L-精氨酸(g/L) 0 3.7 10.34 10.34 15.34 15.5 22.02 22.02 29.03 29.03 37.1 40.6 42
细胞干重(g/L) 0 5 8.5 8.5 12 12 17.4 17.5 19 19 21.12 23.27 23.5
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种用离子转运蛋白促进谷氨酸棒杆菌合成氨基酸的方法
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1062
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggatacgcga tggtgctgct ggttatcgtc accatggttg tctattttga ccgcaacgga 180
tactccgaag acctcacgtt catcgacgcg ttgtactatt ccacagtctc gttgaccacc 240
gtgggctacg gcgatatcac cccggtgacg caatcggcac gcctgatcaa catcatcgtc 300
ctcaccccag cacgcatcgg cttcctgatc ctcctggtcg gcaccacctt gtcagtgctc 360
accgaagaat cgcgccgggc cctgcaaatc caacgttgga gaaaacgcat gcgcaaccac 420
accgtcgttg tcggatacgg aaccaaaggt cgctccgcgg tcgctgcact gcttgccgac 480
ggcgtccccg ccaaccagat cgttgttatc gacaccgatc aagtctccct cgacgccgcc 540
aacaacagcg gactcgtcac cgtcaaaggc tccgccacca aagcagatgt gttgcgtcta 600
gctggcgtgt cacgagcgcg cgccgtcgtc gtggcaccga acctggacga tactgcagtt 660
ctggtgactc tatcggtgcg agaaatcgcg ccgcaggcaa tgattgtggc cagtgtccga 720
gaatctgaaa accaacacct cctcgaacaa tccggtgcgg actcggttgt gatctcctca 780
gaaaccgctg gccgaatgct cggtctggca acagttaccc catcggttgt ggagatgatg 840
gaagacctcc tctcacccga cgaaggattc tccgttgccg aacgactagt cggtgaggat 900
gaaatcggct ccaacccacg acacctcgct gacatcgtcc tcggtgttgt tcgatccggt 960
gagctctacc gcatcgactc cccagaagca gaaactgtag agcccggcga tcgtctcctt 1020
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atgctttcac gtgatactta cccggtggca cgtcgatacg cagacagctt aggcatcacc 2220
cacgtcttgg ccggcatcgc gccgggcaag aaagcccagg tcgtccgtgc agtccacacc 2280
cgcggatcca ctgtcgcgat gatcggcgat gaatcagtaa tggactgttt gaaagtcgct 2340
gacgtgggtg tactgatggg cgtcgatcgt ccctcagatc tgcgtgatga ttccgatgac 2400
ccggcagctg acgttgtggt catgcgcgaa gaggtcatga gcgtgccgac gctgtttaaa 2460
ctggctcgac gctacgccaa gttggtcaat ggcaatattg ctctggcctg gatctataac 2520
ggtgttgcca tggtgcttgc agtgtctggc ttgctgcatc caatggctgc gaccgtggct 2580
atgctggcgt cttcgctgct tattgaatgg cgctcgggca gggcgcgcaa gtactaa 2637
<210> 3
<211> 353
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Gly Arg Met Lys Asn Asp Gly Glu Leu Ala Asp Leu Pro Asp His
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ser Ile Ile Arg Ile Pro Gln Ala Ala Lys Arg Ser Pro
20 25 30
Trp Ala Leu Ile Leu Thr Arg Ile Gly Tyr Ala Met Val Leu Leu Val
35 40 45
Ile Val Thr Met Val Val Tyr Phe Asp Arg Asn Gly Tyr Ser Glu Asp
50 55 60
Leu Thr Phe Ile Asp Ala Leu Tyr Tyr Ser Thr Val Ser Leu Thr Thr
65 70 75 80
Val Gly Tyr Gly Asp Ile Thr Pro Val Thr Gln Ser Ala Arg Leu Ile
85 90 95
Asn Ile Ile Val Leu Thr Pro Ala Arg Ile Gly Phe Leu Ile Leu Leu
100 105 110
Val Gly Thr Thr Leu Ser Val Leu Thr Glu Glu Ser Arg Arg Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Gln Arg Trp Arg Lys Arg Met Arg Asn His Thr Val Val Val
130 135 140
Gly Tyr Gly Thr Lys Gly Arg Ser Ala Val Ala Ala Leu Leu Ala Asp
145 150 155 160
Gly Val Pro Ala Asn Gln Ile Val Val Ile Asp Thr Asp Gln Val Ser
165 170 175
Leu Asp Ala Ala Asn Asn Ser Gly Leu Val Thr Val Lys Gly Ser Ala
180 185 190
Thr Lys Ala Asp Val Leu Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Ala Arg Ala
195 200 205
Val Val Val Ala Pro Asn Leu Asp Asp Thr Ala Val Leu Val Thr Leu
210 215 220
Ser Val Arg Glu Ile Ala Pro Gln Ala Met Ile Val Ala Ser Val Arg
225 230 235 240
Glu Ser Glu Asn Gln His Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Asp Ser Val
245 250 255
Val Ile Ser Ser Glu Thr Ala Gly Arg Met Leu Gly Leu Ala Thr Val
260 265 270
Thr Pro Ser Val Val Glu Met Met Glu Asp Leu Leu Ser Pro Asp Glu
275 280 285
Gly Phe Ser Val Ala Glu Arg Leu Val Gly Glu Asp Glu Ile Gly Ser
290 295 300
Asn Pro Arg His Leu Ala Asp Ile Val Leu Gly Val Val Arg Ser Gly
305 310 315 320
Glu Leu Tyr Arg Ile Asp Ser Pro Glu Ala Glu Thr Val Glu Pro Gly
325 330 335
Asp Arg Leu Leu Tyr Val Arg Arg Val Phe Ser Glu Glu Val Asn Asp
340 345 350
Lys
<210> 4
<211> 878
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Ser Thr Pro Asp Ser Ser Ser Val Asp Lys Ala Val Asn Thr Ala
1 5 10 15
Ile Ser Asp Ala Lys Thr Ala Ala Leu Lys Ala Gly Val Gly Leu Asn
20 25 30
Arg Ala Thr Ala Ser Glu Glu Glu Glu Asp Leu Ser Ser Ser Ile Lys
35 40 45
Val Ser Leu Ala Phe Glu Leu Glu Gly Leu Ser Asn Ala Pro Ser Leu
50 55 60
Met Val Val Glu Lys Ala Leu Glu Lys Ile Pro Gly Val Ser Ala Asp
65 70 75 80
Leu Ile Tyr Pro Ser Gln Thr Ala Trp Ile Thr Ala Thr Asp Arg Val
85 90 95
His Pro Glu Thr Leu Ile Glu Val Phe Glu Gln Phe Gly Ile Lys Ala
100 105 110
His Leu Ser Asn Ser Ser Leu Leu Arg Arg His Gln Gln Leu Ser Ala
115 120 125
Glu Val Asn Arg Glu Ala Arg Leu Asp Arg Tyr Arg Ser Arg Met Asp
130 135 140
Ala Lys Arg Ile Ser Pro Arg Val Arg Arg His Asn Arg Gln Glu Met
145 150 155 160
Val His Ala Val Arg Ala Arg Glu Ser Gly Trp Ile Lys Arg Arg Asn
165 170 175
His Thr Thr Ser Gln His Glu Asp Pro Met Ser Gly Asp Val Leu Phe
180 185 190
Thr Ala Arg Ala Leu Ile Thr Pro Lys Arg Leu Trp Val Ser Leu Pro
195 200 205
Phe Ala Leu Ile Val Leu Ala Leu Ser Leu Asn Pro Ser Trp Gln Phe
210 215 220
Asp Tyr Trp Gln Trp Leu Ser Ala Val Leu Ala Ile Pro Val Val Val
225 230 235 240
Trp Gly Ala Trp Pro Phe His Arg Ala Ala Ala Gly Gly Ile Arg Arg
245 250 255
Gly Ile Ser Ala Leu Asp Ala Thr Ser Ser Ile Ala Ile Ala Ala Ala
260 265 270
Tyr Ala Trp Ser Ile Ala Met Leu Leu Phe Glu Thr Pro Gly Gly Lys
275 280 285
Ser Trp Arg Ser Tyr Pro Ser Trp Phe Ala Phe Asp His Gly Thr Leu
290 295 300
Thr Gln Asn Glu Ile Tyr Phe Asp Val Ala Cys Gly Ile Thr Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ala Gly Arg Leu Leu Thr Arg Arg Arg Ser Gln Ser Ser Leu
325 330 335
Leu Ala Glu Leu Gly Arg Leu Gln Ile Asp Pro Gln Arg Ile Val Thr
340 345 350
Val Val Arg Lys His Arg Leu Lys Arg Val Val Gln Glu Leu Asn Ile
355 360 365
Pro Val Gln Glu Val Arg Val Asn Asp Asp Val Lys Val Pro Pro Asn
370 375 380
Thr Thr Ile Pro Val Asp Gly Thr Val Ile Gly Gly Gly Ser Arg Ile
385 390 395 400
Ala Ala Ser Ile Ile Met Gly Gln Asp Gln Arg Asp Val Lys Val Asn
405 410 415
Asp Lys Val Phe Ala Gly Ser Leu Asn Leu Glu Ser Glu Ile Lys Val
420 425 430
Arg Val Ile Arg Thr Gly His Arg Thr Arg Ile Ala Ala Val His Arg
435 440 445
Trp Val Lys Glu Ala Thr Leu Lys Glu Asn Arg His Asn Arg Ala Ala
450 455 460
Ile Arg Ser Ala Gly Asn Leu Val Pro Ile Thr Phe Thr Leu Ala Val
465 470 475 480
Val Asp Phe Cys Leu Trp Ala Leu Ile Ser Gly Asn Ile Asn Ala Ala
485 490 495
Phe Thr Thr Thr Leu Ala Val Leu Ala Cys Val Ala Pro Val Ala Leu
500 505 510
Ala Leu Ser Ala Pro Leu Ala Thr Arg Asn Ser Ile Glu Ala Ala Ala
515 520 525
Arg His Gly Ile Leu Val Arg Ser Gly Glu Ile Phe Arg Val Leu Asp
530 535 540
Asp Val Asp Thr Ala Val Phe Asn Arg Val Gly Thr Leu Thr Asp Gly
545 550 555 560
Glu Met Thr Val Glu Thr Val Thr Ala Asp Lys Gly Glu Asp Pro Glu
565 570 575
Leu Val Leu Arg Val Ala Gly Ala Leu Ala Met Glu Ser His His Ala
580 585 590
Ile Ser Lys Ala Leu Val Lys Ala Ser Arg Glu Ala Arg Asp Thr Gly
595 600 605
Ala Gly Gly Glu Asp Val Pro His Trp Ile Glu Val Gly Asn Val Glu
610 615 620
Ile Thr Glu Ala Gly Ser Phe Gln Ala Thr Ile Glu Leu Pro Leu Ile
625 630 635 640
Lys Pro Ser Gly Glu Lys Ile Met Arg Thr Thr Glu Ala Leu Leu Trp
645 650 655
Arg Pro Arg Ser Met Thr Glu Val Arg Glu His Leu Ser Pro Arg Leu
660 665 670
Val Ala Ala Ala Thr Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ile Val Arg Trp Lys
675 680 685
Gly Lys Asp Arg Gly Val Ile Thr Leu Ser Asp His Val Arg Ser Asp
690 695 700
Ser Ser Asp Ala Ile Ile Ala Ile Glu Glu Gln Gly Ile Glu Thr Met
705 710 715 720
Met Leu Ser Arg Asp Thr Tyr Pro Val Ala Arg Arg Tyr Ala Asp Ser
725 730 735
Leu Gly Ile Thr His Val Leu Ala Gly Ile Ala Pro Gly Lys Lys Ala
740 745 750
Gln Val Val Arg Ala Val His Thr Arg Gly Ser Thr Val Ala Met Ile
755 760 765
Gly Asp Glu Ser Val Met Asp Cys Leu Lys Val Ala Asp Val Gly Val
770 775 780
Leu Met Gly Val Asp Arg Pro Ser Asp Leu Arg Asp Asp Ser Asp Asp
785 790 795 800
Pro Ala Ala Asp Val Val Val Met Arg Glu Glu Val Met Ser Val Pro
805 810 815
Thr Leu Phe Lys Leu Ala Arg Arg Tyr Ala Lys Leu Val Asn Gly Asn
820 825 830
Ile Ala Leu Ala Trp Ile Tyr Asn Gly Val Ala Met Val Leu Ala Val
835 840 845
Ser Gly Leu Leu His Pro Met Ala Ala Thr Val Ala Met Leu Ala Ser
850 855 860
Ser Leu Leu Ile Glu Trp Arg Ser Gly Arg Ala Arg Lys Tyr
865 870 875
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ccgccaaaac agaagcttat gggccgaatg aaaaacgatg 40
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggtgtgctca ctcatttgtc at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgacaaatg agtgagcaca cc 22
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagggtacca gatctccgcg gttagtactt gcgcgccctg 40

Claims (10)

1.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP；所述CglK的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CTAP的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
2.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以pDXW-10为表达载体。
3.如权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌以谷氨酸棒杆菌G01，或钝齿棒杆菌SDNN403为宿主。
4.一种提高棒杆菌氨基酸产量的方法，其特征在于，过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在谷氨酸棒杆菌G01中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-谷氨酸。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在钝齿棒杆菌SDNN403中过表达功能性摄钾蛋白CglK和阳离子转运ATP酶CTAP，生产L-精氨酸。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，编码所述功能性摄钾蛋白CglK的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述阳离子转运ATP酶CTAP的基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将OD600为20～30的重组菌以5～15％的添加量接入发酵体系，发酵温度为25～35℃，pH值为6.5～7.5。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵液中含有葡萄糖50～70g/L，酵母浸粉5～10g/L，K3PO4 3～4g/L，MgSO4·7H2O 0.1～1g/L，(NH4)2SO4 10～25g/L，FeSO4·7H2O0.01～0.05g/L，MnSO4·H2O 0.01～0.05g/L。
10.权利要求1～3所述重组菌，或权利要求4～9所述方法在生产L-谷氨酸或L-精氨酸的产品中的应用。
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